СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, ИНГИБИРУЮЩИМ ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ, ОПТИМИЗИРУЮЩИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТИМУСА У СТАРЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/30 A61K35/37 A61K35/48 

Изобретение относится к способу получения биологически активных веществ, которые могут найти применение в медицине, косметологии, сельском хозяйстве в качестве средства, способного обеспечить профилактику и патогенетическую коррекцию процессов, вызванных нарушениями пролиферации, роста, дифференцировки, функциональной активности и апоптоза клеток.

Известно использование в качестве средства стимуляции регенерации тканей и оптимизации тканевого обмена солкосерила [1] и экстракта плаценты [2].

Недостатком этих известных средств является их сравнительно невысокая эффективность.

Технической задачей изобретения является способ получения веществ, обладающих более высокой ранозаживляющей активностью в сочетании с нормализующим действием на метаболизм при развитии патологических процессов и старении.

Эта задача решается способом, заключающимся в том, что органы и ткани организма, находящегося на стадиях эмбрионального или раннего постнатального развития, измельчают, гомогенизируют, проводят водную и кислотную экстракцию, балластные вещества осаждают центрифугированием, супернатант лиофилизируют.

Пример 1. Хранящиеся при -70^oC печень, желудок, тонкий кишечник, головной мозг новорожденных поросят (возраст до 1 сут) гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе Virtis в пятикратном объеме 10 мМ цитратного буфера pH 7,0 и центрифугировали в течение 1 ч при 100000 g. Супернатант стерилизовали с использованием ультрафильтров Millipore 0,22 мкм.

Пример 2. Хранящийся при -70^oC фетальный головной мозг человека (стадия развития эмбриона - 18 нед) измельчали, помещали в десятикратный объем кипящей 0,25 М уксусной кислоты и гомогенизировали в системе стекло-тефлон. Гомогенат подвергали прогреванию в кипящей водяной бане в течение 10 мин, нейтрализовали ацетатом аммония и центрифугировали (100000 g 60 мин). Супернатант лиофилизировали.

Пример 3. Хранящиеся при -70^oC печень, желудок, тонкий кишечник, головной мозг новорожденных поросят (возраст до 1 сут) измельчали, помещали в десятикратный объем кипящей 0,25 М уксусной кислоты и гомогенизировали в гомогенизаторе Virtis. Гомогенат подвергали прогреванию в кипящей водяной бане в течение 10 мин, нейтрализовали ацетатом аммония и центрифугировали (100000 g 60 мин). Супернатант стерилизовали с использованием ультрафильтров Millipore 0,22 мкм.

Пример 4. Хранящиеся при -70^oC печень, желудок, тонкий кишечник, головной мозг новорожденных поросят (возраст до 1 сут), пуповину и плаценту человека гомогенизировали в забуференном физиологическом растворе (pH 7,0) и центрифугировали в течение 1 ч при 100000 g. Супернатант лиофилизировали.

Пример 5. Изучены противовоспалительный, ранозаживляющий и обезболивающий эффекты комплекса веществ, полученного в соответствии с методами, приведенными в примерах 1 и 3 (КВ). В качестве препаратов сравнения использовали аптечный препарат солкосерил ("Алкалоид-Скопье", Хорватия) - 1 и 4 ампулы на 75 кг массы, а также экстракт плаценты (аптечный препарат) - 1 ампула на 75 кг массы, что в пересчете на кг массы соответствует дозировкам, используемым в клинике (Машковский М.Д., 1986).

В исследовании использовано 140 беспородных крыс-самок массой 180 - 220 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая" и содержавшихся в стандартных условиях вивария. Период акклиматизации, предшествовавший началу экспериментов, составлял не менее двух недель.

Противовоспалительный эффект КВ изучали на модели местного воспалительного процесса, вызванного подкожным введением 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда в подушечку правой задней лапки. Адъювант вводили под легким эфирным наркозом.

КВ вводили в очаг воспаления в 0,1 мл физиологического раствора (ФР) через трое суток после инъекции адъюванта однократно в дозах 1, 25 и 100 мкг/кг. Контрольным животным вводили ФР.

Порог болевой чувствительности у животных определяли, измеряя длительность латентного периода реакции облизывания задних лап (ЛП РОЛ) через 45 мин после инъекции препаратов. Температура "горячей пластинки" 56^oC.

Онкометрию осуществляли непосредственно перед введением исследуемых препаратов и через 1, 3, 6, 8, 10, 13, 16, 23 и 34 сут после введения.

При изучении эффекта КВ на заживление ран у крыс под легким эфирным наркозом вырезали на спине кожный лоскут диаметром 20 мм. Для устранения возможности взаимного вылизывания раневой поверхности крыс содержали в отдельных клетках.

В данной серии экспериментов произведено 7 инъекций препаратов: одновременно с нанесением раны и на 2, 4, 7, 9, 11 и 14 сут по окончании операции. КВ использовали в дозах 0,5, 10,0 и 50 мкг/кг и вводили внутримышечно в 0,1 мл ФР (внутренняя сторона бедра правой задней лапы). Контрольным животным вводили ФР.

Измерение площади раневой поверхности проводили по "весовому" методу (Стручков В. И. и др., 1975) на 11, 14, 18 и 22 сут после операции. Замеры производили не ранее, чем на 11 сут после операции, поскольку к этому дню практически у всех крыс произошло отторжение струпа. Это позволило измерять площадь ран с относительной высокой степенью точности. Скорость заживления раны (величину относительного заживления - Y) определяли по формуле Y = , где S₀ - начальная площадь раны, S₁ - ее площадь в день t (Кузин М. И. и др., 1990).

Местный эффект КВ на воспалительный процесс.

В результате онкометрии очага воспаления показано, что КВ обладает противовоспалительным эффектом. Действие КВ наиболее выражено при использовании его в дозах 1 и 25 мкг/кг массы, когда эффект наблюдается уже через сутки после однократной инъекции и остается достоверным на протяжении всего периода исследования. При использовании данной экспериментальной модели и режима введения КВ его противовоспалительный эффект более выражен, чем действие солкосерила и препарата плаценты (табл. 1), применяемых в клинической практике в качестве противовоспалительных средств.

Дополнительным подтверждением противовоспалительного эффекта КВ служат результаты, полученные при определении порога болевой чувствительности методом "горячей пластинки". Показано, что введение КВ в дозах 1 и 25 мкг/кг массы приводит к увеличению продолжительности ЛП РОЛ в 1,7 раза (P < 0,001). Эффект КВ отмечен на воспаленной, но не на интактной лапке. КВ в дозе 100 мкг/кг, солкосерил в обеих использованных дозах и препарат плаценты не изменяли величину ЛП РОЛ.

Эффект КВ заживление раны.

На 11 сут после операции у всех экспериментальных и контрольных животных грануляции разрослись и выполнили всю полость раны. Поверхность грануляций блестящая, розово-красного цвета, что свидетельствует о течении раневого процесса без осложнений. О нормальном ходе заживления свидетельствовала и ведущая роль механизма контракции в изучаемом раневом процессе (Кузин, 1990).

В результате введения КВ в дозах 0,5 и 10,0 мкг/кг отмечено ускорение процесса раневой контракции. Этот эффект отмечен также при введении солкосерила и препарата плаценты. Однако действие препаратов сравнения наблюдалось не на всех сроках исследования. Кроме того, эффект КВ был более выраженным и стабильным (табл. 2).

Во всех использованных моделях при введении КВ не отмечено местных реакций иммунной системы.

Пример 6. Антиоксидантную активность КВ, полученного в соответствии с описанием, приведенным в примерах 1 и 3, оценивали по его способности ингибировать Fe-аскорбат-индуцированное окисление липосом из яичного лецитина. Для получения суспензии липосом к 20 мл среды (PBS, pH 7,4) при постоянном перемешивании добавляли 500 мкл 9%-ого спиртового раствора лецитина (Харьков), раствор инкубировали 2 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Окисление липосом инициировали добавлением 50 мкл раствора PBS, содержащего FeSO₄ и аскорбиновую кислоту, конечная концентрация которых в инкубационной среде составила 10^-5 М и 2 • 10^-4 М соответственно. Раствор исследуемого препарата также добавляли в объеме 50 мкл. Окисление липосом проводили в тефлоновых пробирках, помещенных в термостатируемую ячейку, при постоянном и равномерном перемешивании. Объем инкубационной среды 1 мл, продолжительность окисления 9 - 40 мин при 37^oC. Процесс останавливали, перенося 200 мкл суспензии окисленных липосом в пробирку с 1,5 мл 30%-ной трихлоруксусной кислотой, затем туда же добавляли 1,5 мл 0,5% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и помещали на кипящую водяную баню на 30 мин с последующим фотометрированием окрашенного продукта при 532 нм. Результаты измерений выражали в процентах, принимая за 100% оптическую плотность раствора, соответствующего суспензии лецитина, в которой окисление липосом протекало в тех же условиях, но в отсутствие исследуемого вещества.

Эффект КВ на перекисное окисление липидов.

Изучено действие КВ in vitro на Fe-аскорбатиндуцированное окисление липосом из яичного лецитина. Препарат в концентрациях от 10 до 160 мкг-эквивалент белка/мл обладает выраженным антиоксидантным эффектом, вызывая заметное торможение процесса перекисного окисления липосом. Максимальный уровень торможения наблюдается при концентрациях КВ от 50 мкг-эквивалент белка/мл и составляет 35%. Необходимо отметить, что в аналогичных экспериментальных условиях - α -токоферол (Serva) в конечной концентрации 10^-5 М тормозил окисление липосом на 48%. Для доказательства "специфичности" эффекта КВ в используемую систему in vitro вводили препарат плаценты в концентрациях 20 - 60 мкг-эквивалент белка/мл. При использовании препарата плаценты в данном диапазоне концентраций антиоксидантный эффект не отмечен.

Пример 7. Изучены эффекты комплекса веществ, полученного из фетальных тканей и органов в соответствии с описанием, приведенным в примерах 1 и 3 на состояние тимуса старых животных при адаптации к стрессорным воздействия.

В исследовании использовали 31 крысу-самку популяции Wistar массой 350 - 400 г (возраст 16 мес), полученных из питомника РАМН "Столбовая" и содержавшихся в стандартных условиях вивария. Период акклиматизации, предшествовавший началу экспериментов, составлял не менее двух недель.

КВ и карнозин (препарат сравнения) вводили внутрибрюшинно 5 раз с интервалом в одну неделю (последний раз за сутки до забоя). Однократная доза обоих препаратов - 20 мкг/кг. Контрольным животным вводили ФР в соответствующие сроки и в объеме 0,1 мл.

В качестве "стрессора" использовали раздражение конечностей животных электрическим током (I = 1 мА; продолжительность сеанса 300 с; четырежды через день по одному разу в сутки; последний раз за 24 ч до забоя) в специальных аппаратах производства НТК "Диагностика".

Две последние инъекции препаратов провели за 1 ч до начала двух последних сеансов foot-shock.

Непосредственно перед забоем крыс взвешивали. Кровь (3 мл) собирали в пробирки с 3%-ным раствором натриевой соли ЭДТА (в соотношении 1:10). Извлеченные органы (тимус и селезенку) взвешивали.

Затем тимус гомогенизировали вручную на слабо притертом гомогенизаторе (стекло/стекло) в 5 мл физиологического раствора, после чего гомогенат пропускали через нейлоновую сетку (Falkon, Германия) для отделения тимоцитов от стромы. Селезенку разрушали продавливанием между двумя предметными стеклами.

Количество клеток подсчитывали при окрашивании генцианвиолетом в 3%-ной уксусной кислоте. Жизнеспособность полученных клеток, определяемая по включению трипанового синего, составляла не менее 95%.

Математическую обработку полученных результатов проводили по критерию Стьюдента.

В результате проведенного исследования доказано, что введение КВ в значительной степени увеличивает содержание клеточных элементов в тимусе (табл. 3 и 4).

Источники информации:
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, часть 2 с. 185.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства, часть 2 с. 177.

Способ заключается в том, что органы и ткани организма, находящегося на стадиях эмбрионального или раннего постнатального развития, измельчают, гомогенизируют, проводят водную и кислотную экстракцию, балластные вещества отделяют центрифугированием и супернатант лиофилизируют. Способ позволяет получить комплекс веществ, который обладает более высокой ранозаживляющей активностью в сочетании с нормализующим действием на метаболизм при развитии патологических процессов и старении. 4 табл.

Способ получения комплекса веществ, обладающих противовоспалительным, ранозаживляющим, оптимизирующим функциональное состояние тимуса у старых животных, ингибирующим процессы перекисного окисления липидов действием, заключающийся в том, что органы и ткани организма, находящегося на стадиях эмбрионального или раннего постнатального развития, измельчают, гомогенизируют, проводят водную или кислотную экстракцию, балластные вещества отделяют центрифугированием и супернатант лиофилизируют.