СПОСОБ ОЦЕНКИ АДРЕНОРЕАКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН ПО ИЗМЕНЕНИЮ СКОРОСТИ ОСЕДАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ НА ФОНЕ ИХ БЛОКАДЫ β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ (ОПРЕДЕЛЕНИЕ АДРЕНОЗАВИСИМОЙ СОЭ) Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 G01N15/05 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клиническим методам исследования, и может быть использовано для оценки адренореактивности эритроцитов у женщин с физиологическим и осложненным течением беременности и родового акта, а также у больных с воспалительными заболеваниями.

В клинической практике существует большая потребность определения адренореактивности миометрия у беременных женщин и рожениц. Известно, что адренореактивность матки во время беременности изменяется (В.И.Циркин и соавт. 1986, И.В.Дуда 1989), а именно, при беременности концентрации β-адренорецепторов в матке возрастает, а перед родами снижается, что способствует нормальному течению беременности и родового акта. Поэтому можно ожидать, что в эритроцитах соответственно во время беременности количество β-адренорецепторов должно увеличиваться, а перед родами уменьшаться.

Определять адренореактивность в миометрии непосредственно достаточно сложно, поэтому требуется поиск физиологических индикаторов, в качестве которых можно использовать эритроциты. Нами предлагается способ, с помощью которого можно оценить адренореактивность эритроцитов (а следовательно, и адренореактивность миометрия), используя известный метод определения скорости оседания эритроцитов по Панченкову Т.П. в нашей модификации.

Теоретической предпосылкой для разработки предлагаемого способа явилось то, что на мембране эритроцитов содержатся β-адренорецепторы (Belizikian J. P, Aurbach G.D, 1973, Levitzki A. 1974, Rasmussen H, Lefkowitz R.J. 1979). Связывание β-адренорецепторов β-адреномиметиками, как было неоднократно показано, сопровождается активацией аденилатциклазы (Robison G.A, Butcher R.W, Sutherland E.W. 1971). Образующийся затем цАМФ за счет активации специфических протеинкиназ опосредует многие из физиологических β-адренергических эффектов, наблюдаемых в эритроцитах. Б.Н.Манухин, Е.А.Смурова, Л.А.Нестерова (1993) исследовали количество β-адренорецепторов (мест связывания лиганда) в эритроцитах крыс и их сродство к ³H-пропранололу и показали, что в эритроцитах выявляется два пула β-адренорецепторов - с высокой и низкой аффинностью, которые обнаруживаются при исследовании реакции эритроцитов на β-адреноблокатор в широком диапазоне концентраций. Рецепторы высокоаффинного пула в 17 раз более чувствительны, чем рецепторы низкоаффинного, а количество мест связывания этого пула в 9 раз меньше. По мнению авторов, разная чувствительность двух пулов β₂-адренорецепторов обеспечивают их избирательную активность в зависимости от действующей концентрации медиатора.

Известно, что чувствительность β-адренорецепторов эритроцитов может изменяться (В. Н. Соминский, Л.В.Бердышева, Р.К.Блума и др. 1989, Е.А.Смурова 1995), в частности, при адаптации организма к условиям внешней среды, формировании стрессорной реакции, колебаниях температуры среды, сердечно-сосудистых, психических заболеваниях, что отражает функциональное состояние симпато-адреналовой системы (В.Н.Соминский и соавт. 1989). В связи с этим нами предполагается, что изменения адренореактивности эритроцитов отражают соответствующие изменения адренореактивности в других органах, содержащих β-адренорецепторы, в частности в матке.

В качестве аналогов можно рассмотреть следующие методы:
1. Метод оценки адренореактивности, основанный на определении концентрации β-адренорецепторов в эритроцитах.

Для получения количественных характеристик адренорецепторов эритроцитов применяются методы связывания рецепторов с меченными лигандами, в частности, для идентификации связывающих мест в мембранах эритроцитов можно использовать ³H-(-)-алпренолол (Lefkowitz R.J. 1979) или ³H-пропранолол (В.Н.Манухин и соавт. 1993).

Однако данный метод является технически сложным и недоступен для широкой клинической практики.

2. Исследования β-адренореактивности мембран эритроцитов с помощью спектрального люминесцентного анализа.

В. Н. Соминский, Р.К.Блума, И.Э.Калниня (1985) для оценки адренореактивности эритроцитов в экспериментальных условиях прижизненно повышенной и пониженной адренореактивности организма использовали флуоресцентный зонд n-толуолсульфонат 4-(n-диметил-аминостирил)-1-метилпиридиния (ДСМ). Авторы показали зависимость связывания зонда с мембранами эритроцитов морской свинки от уровня адренореактивности по люминесценции зонда в области 615 нм. Выявлено два типа связывания зонда с мембранами эритроцитов - специфическое и неспецифическое. При повышенной адренореактивности организма найдено увеличение концентрации мест специфического связывания и понижение константы диссоциации специфического связывания, при пониженной адренореактивности - уменьшение концентрации мест специфического связывания и увеличение константы диссоциации специфического связывания.

Таким образом показано, что концентрация связанного зонда ДСМ и параметры связывания зонда с мембранами эритроцитов меняются в зависимости от адренореактивности организма.

Однако техническая сложность, необходимость специального оборудования и реактивов, а также отсутствие нормативных значений ограничивают применение данного метода в клинической практике.

В качестве прототипа предлагается рассмотреть метод оценки адренореактивности эритроцитов, основанный на определении их осмотической резистентности на фоне адренерзических средств. (В.Н.Соминский, К.В.Окунь, Н.А.Севастьянова 1980, 1981).

Согласно данным этих авторов β-адреномиметические средства (адреналин, алупент) при воздействии на эритроциты человека in vitro за счет активации β-адренорецепторов снижают осмотическую резистентность, а β-адреноблокатор пропранолол блокирует эффекты адреналина и инвертирует действие алупента, одновременно оказывая выраженное собственное влияние на осмотическую резистентность эритроцитов, повышая ее.

С помощью данного метода показано, что при инфаркте миокарда адренореактивность эритроцитов возрастает; об этом свидетельствует тот факт, что повышение осмотической резистентности эритроцитов под влиянием пропранолола у больных инфарктом миокарда было более существенным, чем у здоровых. Также наблюдается рост адренореактивности эритроцитов у животных при искусственном снижении содержания норадреналина в тканях, об этом свидетельствует повышение сродства β-адренорецепторов эритроцитов к пропранололу (А.Н.Соминский, Л.В.Бердышева, Р.К.Блума и др. 1989).

Таким образом, данный метод позволяет судить об адренореактивности организма.

Однако способ имеет следующие недостатки: сложности клинической оценки гемолиза; необходимость специального оборудования (ФЭК-56М, термостат, ротационный встряхиватель); отсутствие нормативных значений.

Целью предлагаемого способа является упрощение оценки адренореактивности эритроцитов, повышение доступности и возможности широкого использования в клинической практике.

Поставленная цель достигается применением известного метода определения скорости оседания эритроцитов по Панченкову Т.П. с добавлением к исследуемой крови беременных женщин β-адреноблокатора обзидана при условии, что исходная СОЭ выше 10 мм/час (беременность, воспалительные заболевания).

Обоснование
Известно, что во время физиологически протекающей беременности скорость оседания эритроцитов возрастает и составляет по данным М.М.Шехтмана (1980) в I триместре беременности 15 (10-15) мм/ч, во II триместре 25 (15-35) мм/ч, в III триместре 40 (25-50) мм/ч. Увеличение СОЭ во время беременности объясняется изменением соотношения белковых фракций в крови, в частности относительным увеличением содержания глобулинов и фибриногена (Бодяжина В.И. 1987 и др. ). Кроме того, мы полагаем, что повышение СОЭ при беременности может быть обусловлено ростом β-адренореактивности эритроцитов и наличием в крови эндогенных агонистов β-адренорецепторов и сенсибилизатора β-адренорецепторов, существование которых доказывается в работах В.И.Циркина и соавторов (1995, 1996). С этих позиций мы предполагаем, что добавление в исследуемую кровь пропранолола (обзидана) должно приводить к блокаде β-адренорецепторов эритроцитов, тем самым к уменьшению их агрегации, лежащей в основе механизма СОЭ, и, следовательно, к снижению СОЭ, а степень снижения скорости оседания эритроцитов под влиянием обзидана должна зависеть главным образом от концентрации β-адренорецепторов в эритроцитах, а также, но в меньшей степени, от содержания в крови агонистов и сенсибилизаторов β-адренорецепторов. В связи с вышесказанным предлагаемый нами способ оценки адренореактивности эритроцитов можно для краткости называть - способ определения β-адренозависимой СОЭ.

Описание способа
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Аппарат Панченкова с 10 стандартными капиллярами;
2. Пробирки стеклянные 20 шт.;
3. Мерные пипетки 10 мл, 1 мл, 0,1 мл;
4. Профильтрованный 5% раствор цитрата натрия;
5. Обзидан (ампулярный раствор 0,005 г - 5 мл) или пропранолол.

Постановка пробы
Модифицированный способ исследования СОЭ (β-адренозависимой СОЭ) предусматривает раздельное изучение СОЭ с растворами, содержащими различные концентрации обзидана (1•10^-5, 1•10^-6 ... 1•10^-13 г/мл) и контрольную СОЭ, т.е. без добавления обзидана.

Для исследования используется венозная кровь. В пробирку набирается 1 мл 5% раствора цитрата натрия и 4 мл венозной крови (соотношение антикоагулянта и крови 1:4). Готовятся растворы обзидана в диапазоне концентраций 1•10^-5, 1•10^-6 . .. 1•10^-13 г/мл (в качестве растворителя используется 0,9% раствор NaCl). С помощью мерной пипетки исследуемая цитратная кровь разливается по 0,5 мл в каждую из 10 пробирок.

Определение контрольной СОЭ
В 1 пробирку с 0,5 мл цитратной крови с помощью микропипетки наливается 0,05 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешиваются, а затем 0,1 мл полученной смеси набирается в капилляр до отметки "0". Капилляр ставится в аппарат Панченкова и замечается время.

Для проведения β-адренозависимой СОЭ в 9 пробирок с 0,5 мл исследуемой цитратной крови добавляется по 0,05 мл раствора обзидана соответствующей концентрации (1•10^-5, 1•10^-6 ... 1•10^-13 г/мл), и тем самым создается концентрация обзидана в исследуемой крови соответственно 1•10^-6, 1•10^-7 ... 1•10^-14 г/мл. Цитратная кровь в каждой пробирке тщательно перемешивается с раствором обзидана. Полученная смесь из каждой пробирки набирается в соответствующий капилляр до отметки "0" (0,1 мл). Все капилляры ставятся строго вертикально в аппарат Панченкова и замечается время их постановки.

Оценка β-адренозависимой СОЭ
Регистрация скорости оседания эритроцитов во всех капиллярах производится через 1 час обычным способом (по высоте столбика плазмы в мм над осевшими эритроцитами). При том учитываются максимальные изменения СОЭ (в мм и в % к контрольной СОЭ), наблюдаемые во всем диапазоне концентраций обзидана. На основании проведенных нами исследований крови женщин со сроком беременности 28-38 недель, протекающей без осложнений (42), а также осложнившейся угрозой прерывания (37) и гестозом (54), при β-адренозависимой СОЭ, составляющей 60-80% от контрольной СОЭ адренореактивность эритроцитов считается умеренной (нормальной), при β-адренореактивной СОЭ более 80% - сниженной, а менее 60% - повышенной.

Следующие примеры иллюстрируют возможности способа.

Пример 1.

К-ва Т.С. 34 года
Диагноз: Беременность 36 недель. Тазовое предлежание. Отягощенный акушерский анамнез.

Контрольная СОЭ 42 мм/час (100%), максимальная β-адренозависимая СОЭ (при концентрации обзидана 1•10^-9 г/мл) 31 мм/час, т.е. 73,8% от контрольной СОЭ.

Заключение: Адренореактивность эритроцитов нормальная.

Пример 2.

З-на Т.А. 30 лет.

Диагноз: Беременность 32 недели. Угроза преждевременных родов. Гипотрофия плода 1 степени. Кольпит. Отягощенный акушерский анамнез.

Контрольная СОЭ 26 мм/час, максимальная β-адренозависимая СОЭ (при концентрации обзидана 1•10^-6, 1•10^-10, 1•10^-11 г/мл) 24 мм/час, т.е. 92,3% от контрольной СОЭ.

Заключение: Адренореактивность эритроцитов снижена.

Пример 3.

Н-на Т.В. 22 года.

Диагноз: Беременность 38 недель. Нефропатия 1 ст.

Контрольная СОЭ 55 мм/час, максимальная β-адренозависимая СОЭ (при концентрации обзидана 1•10^-11 г/мл) 20 мм/час, т.е. 36,4% от контрольной СОЭ.

Заключение: адренореактивность эритроцитов повышена.

Предлагаемый способ дает возможность оценки адренореактивности эритроцитов беременных женщин при различных осложнениях гестационного процесса и родового акта.

Преимуществами данного способа являются простота выполнения, наглядность и объективность. Данный способ не требует специального оборудования, что делает его доступным для применения в широкой клинической практике. Достоинством модифицированного способа исследования СОЭ на фоне β-адреноблокатора является быстрота получения результатов (в течение 1 часа), что позволяет, в частности, использовать данный метод для определения тактики ведения родов.

Результаты исследования β-адренозависимой СОЭ в сочетании с другими методами могут способствовать диагностике гестозов, угрозы прерывания беременности, выбору их патогенетического лечения и контролю его эффективности, а также прогнозированию течения родового акта и выявлению женщин группы риска по развитию аномалий родовой деятельности. В целом предлагаемый способ позволяет снизить материальные затраты на медицинское обслуживание беременных женщин и рожениц.

Литература:
1. Бердышева Л.В., Манухин Б.Н., Путинцева Т.Г., Мелентьева А.А. Адреночувствительность изолированных органов крыс при изменении в них содержания норадреналина.// Физиологический журнал СССР 1978, Т. 64. N 6. С. 758-765.

2. Билезикян Дж. Взаимосвязь между β-адренергическими рецепторами и активностью аденилатциклазы в эритроцитах индейки.//Взаимодействие гормонов с рецепторами. М.: Мир. 1979. С. 341-363.

3. Бодяжина В.И. Акушерская помощь в женской консультации. М.: Медицина 1987.

4. И. В. Дуда "Нарушения сократительной деятельности матки". Минск: "Беларусь", 1989.

5. Лефковиц Р. Выявление β-адренергических рецепторов.//Взаимодействие гормонов с рецепторами. М.: Мир, 1979, С. 324-340.

6. Манухин Б.Н., Смурова Е.А., Нестерова Л.А. Закономерности связывания ³H-пропранолола β-адренорецепторами эритроцитов крыс.// Доклады Академии Наук. 1993. Т. 332. N 3. С. 388-390.

7. Соминский В. Н., Окунь К.В., Севастьянова Н.А. Методика определения функционального состояния β-адренорецепторов эритроцитов. //Биохимическая характеристика патологических процессов. Рига. 1980. С. 168-171.

8. Соминский В. Н. , Окунь К.В. Повышение осмотической резистентности эритроцитов под влиянием пропранолола. //Лабораторное дело. 1981. N 9. С. 525-527.

9. Соминский В.Н., Блума Р.К., Калниня И.Э. Исследование β-адренорецептивной функции мембран эритроцитов морской свинки с помощью спектрального люминесцентного анализа. //Физиологический журнал СССР 1985. Т. 71. N 12. С. 1587-1590.

10. Соминский В.Н., Бердышева Л.В., Блума Р.К., Калниня И.Э., Окунь К.В. , Селиванова Г.П., Манухин Б.Н. Использование эритроцитов крови для прижизненной оценки функционального состояния адренорецепторов. //Физиологический журнал СССР 1989. Т. 75, N 2. С. 189-193.

11. Смурова Е.А., Нестерова Л.А., Манухин Б.Н. Действие высокой температуры in vitro на специфическую активность β-адренорецепторов. //Доклады Академии Наук 1995. Т. 342. N 3. С. 421-423.

12. Циркин В.И., Медведев Б.И., Плеханова Л.М., Рыбалова Л.Ф., Шаймарданов Х. А. Роль β-адренорецепторного ингибирующего механизма в регуляции сократительной деятельности матки женщин. //Акушерство и гинекология. 1986. N 1. С. 19-21.

13. Циркин В.И., Дворянский С.А., Братухина С.В., Неганова М.А., Видякина Г.Я., Лебеденко А.Ю. Влияние сыворотки крови человека на β-адренореактивность изолированного миометрия крысы. //Вятская земля в прошлом и настоящем. Материалы III научной конференции, посвященной 50-летию победы в Великой Отечественной войне. Киров. 1995. Т. 3. С. 167-171.

14. Циркин В.И., Дворянский С.А., Заугольников В.С., Братухина С.В., Сизова Е. Н., Морозова М.А., Осокина А.А., Шушканова Е.Г., Туманова Т.В., Видякина Г.Я. Лекарственная терапия и эндогенные адреномодуляторы. //Лекарственное обозрение. 1996. N 2. С. 3-10.

15. Шехтман М.М., Бархатова Т.П. Заболевания внутренних органов и беременность. М.: Медицина, 1982.

16. Levitski A., Atias D., Stear M. - Proc. hat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 2773-2776.

17. Rasmussen H. , Lake W., Allen J. The effect of catecholamines and prostaglandins upon human and rat erytrocytes. //Biochim. et Biophys. Acta. 1975. Vol. 411. N 1. P. 63-73.

18. Robison G. A. , Butcher R.W., Sutherland E.W. Cyclic AMP, Academic Press. London. 1971. P. 145-131.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в лабораторной диагностике. Определяют изменения физико-химических свойств эритроцитов под влиянием β-адреноблокатора пропранолола (обзидана, анаприлина), добавляемого in vitro в исследуемую цитратную кровь, при этом об изменениях физико-химических свойств эритроцитов судят по степени уменьшения скорости оседания эритроцитов, определяемой стандартным методом при условии, что исходная СОЭ выше 10 мм/ч, в присутствии β-адреноблокатора обзидана в диапазоне его концентраций 1 • 10^-5, 1 • 10^-6 ... 1 • 10^-13 г/мл, при β-адренозависимой СОЭ, составляющей 60-80% от контрольной СОЭ, адренореактивность оценивают как умеренную (нормальную), при β-адренозависимой СОЭ более 80% - как сниженную, а при менее 60% - как повышенную. Способ позволяет в сочетании с другими методами способствовать диагностике гестозов, угрозы прерыванию беременности, выбору их патогенетического лечения.

Способ оценки адренореактивности эритроцитов основан на определении изменений физико-химических свойств эритроцитов под влиянием β-адреноблокатора пропранолола (обзидана, анаприлина), добавляемого in vitro в исследуемую цитратную кровь, отличающийся тем, что об изменениях физико-химических свойств эритроцитов судят по степени уменьшения скорости оседания эритроцитов, определяемой стандартным методом (при условии, что исходная СОЭ выше 10 мм/ч), в присутствии β-адреноблокатора обзидана в диапазоне его концентраций 1 • 10^-5, 1 • 10^-6 ... 1 • 10^-13 г/мл, при β-адренозависимой СОЭ, составляющей 60-80% от контрольной СОЭ, адренореактивность эритроцитов оценивают как умеренную (нормальную), при β-адренозависимой СОЭ более 80% - как сниженную, а менее 60% - как повышенную.