СПОСОБ ОЦЕНКИ α И β-АДРЕНОРЕАКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПО ИЗМЕНЕНИЮ ИХ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОД ВЛИЯНИЕМ АДРЕНАЛИНА И АДРЕНОБЛОКАТОРОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемая разработка относится к области биологии, а также к области медицины, а именно, к лабораторным способам исследования в гематологии и физиологии.

Способ оценки α и β₂-адренореактивности эритроцитов человека по изменению осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) в дистиллированной воде, под влиянием адреналина и смеси адреналина и адреноблокаторов. Специфика способа в том, что оценивается число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ), после фиксированной по времени (например, в течение 45 с) экспозиции в дистиллированной воде (ДВ), совместно с 2,5 мМ CaCl₂, т.е. при отсутствии в среде адренергических средств (контроль, К45). Также оценка ОРЭ проходит при наличии в ДВ адреналина (опыт 1, Оадр), и в ДВ при наличии адреналина, а также блокатора α-адренорецепторов ницерголина и β₁-адренорецепторов атенолола (опыт 2, Оадр+бл). Повышение ЧНЭ в опыте 1 означает увеличение ОРЭ и говорит о доминировании α-АР. Снижение ЧНЭ отражает уменьшение ОРЭ и указывает на доминирование β₂.АР. Степень повышения ОРЭ в опыте 2 отражает эффективность активации α-АР, а уровень снижения ОРЭ в этом опыте отражает эффективность активации β₂-АР.

Известно несколько способов оценки адренореактивности эритроцитов, которые можно рассматривать в качестве аналогов заявляемого способа:

1. Способ оценки адренореактивности эритроцитов мужчин и женщин по характеру изменения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) под влиянием адреналина - снижение СОЭ указывает на нормальную β-адренореактивность, а рост СОЭ под влиянием адреналина, например, при бронхиальной астме - на низкую β-адренореактивность (11). Вариантом этого способа является расширение числа адренергических средств, в частности, применение не только адреналина, но и пропранолола (6) При этих модификациях снижение СОЭ под влиянием β-адреноблокатора пропранолола (обзидана) или адреналина указывает на нормальную β-адренореактивность, а рост СОЭ под влиянием пропранолола указывает на ее снижение или полное отсутствие, что, в частности, наблюдается у пациентов с хроническим бронхитом (6) или у пациентов с бронхообструктивным синдромом (5).

Недостатки способов:

- способы не адаптированы к изучению адренореактивности эритроцитов беременных и рожающих женщин, у которых исходно имеется высокая СОЭ.

- при использовании данных способов не известен вид адренорецепторов, ответственных за изменение СОЭ.

2. Способ оценки адренореактивности эритроцитов беременных женщин по изменению скорости оседания эритроцитов на фоне блокады их β-адренорецепторов (определение β-адренозависимой СОЭ (8). Способ основан на определении изменения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) беременных женщин под влиянием пропранолола и других адренергических средств. Мерой β-адренореактивности является величина снижения СОЭ беременных женщин под влиянием пропранолола (обзидана) или других адренергических средств, включая адреналин. Чем больше эта величина, тем выше β₂-адренореактивность эритроцитов, т.е. выше эффективность активации β₂-АР, и наоборот. В частности, этим способом показано, что величина снижения СОЭ под влиянием адренергических средств повышена при гестозе средней степени тяжести, но снижена при наличии у женщин угрозы преждевременных родов. Недостатками способа являются:

- отсутствие зависимости эффекта пропранолола (обзидана), адреналина или другого адренергического средства от его концентрации в среде.

- неспецифичность снижения СОЭ под влиянием адренергических средств,

- применение этого способа ограничено - он может быть применен лишь в том случае, если исходно СОЭ высокая (беременность или наличие воспалительного процесса).

3. Способ оценки адренореактивности эритроцитов, основанный на визуальной фиксации изменения агрегации эритроцитов под влиянием адреналина и других адренергических средств (16). Способ основан на фиксации изменения способности эритроцитов к агрегации под влиянием адреналина и других адренергических средств. При этом агрегация эритроцитов оценивается визуально с помощью световой микроскопии. Считается, что в основе роста агрегации эритроцитов под влиянием адреналина и других агонистов адренорецепторов лежит повышение концентрации ионов Ca²⁺ в эритроцитах, что индуцирует Гардош-эффект, т.е. утечку из эритроцитов ионов K⁺.

Недостатки способа:

- неспецифичность повышения агрегации эритроцитов под влиянием адренергических средств. Способ не дает возможность дифференцированной оценки эффективности активации α-АР или β-АР, так как агрегация вызывается всеми видами агонистов АР (т.е. α₁-АР, α₂-АР, β₂-АР), a адреноблокаторы (обзидан, ницерголин) не блокируют способность агонистов адренорецепторов повышать агрегацию эритроцитов.

- зависимость результатов исследования от группы крови пациента.

4. Способ оценки адренореактивности эритроцитов, основанный на фиксации изменения агрегации эритроцитов, индуцированной алциановым голубым, под влиянием адреналина и других адренергических средств, с помощью агрегометра «Биола» (17). Способ представляет собой модификацию метода (14), в котором агрегацию отмытых эритроцитов, находящихся физиологическом растворе, вызывают с помощью красителя алцианового голубого. В предложенном (17) способе, агрегация эритроцитов дозозависимо снижалась под влиянием адреналина, а этот эффект частично блокировался ницерголином и пропранололом (обзиданом). Авторы считают, что снижение индуцированной алциановым голубым агрегации эритроцитов при действии адреналина обусловлено активация α-АР и β₂-АР, а этому процессу препятствует активация β₁-АР. Таким образом, при использовании различных видов адреноблокаторов можно дифференцировано оценивать α-, β₂- и β₁-адренореактивность эритроцитов

Недостатки способа:

- большая трудоемкость способа и необходимость наличия агрегометра «Биола».

- сложность интерпретации данных, получаемых на агрегометре «Биола» при оценке способности эритроцитов к агрегации, вследствие несовершенства самой процедуры, а также потому, что индукция агрегации эритроцитов под влиянием красителя алцианового голубого далека от физиологических условий, приводящих к агрегации эритроцитов.

- относительная неспецифичность снижения алциан-вызванной агрегации эритроцитов под влиянием адренергических средств.

5. Способ определения гиперадренергической формы гипертонической болезни (7). В основе этого способа лежит регистрация изменения осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) под влиянием β-адреноблокатора пропранолола (обзидана). Этот способ является модификацией метода Идельсона Л.И., предложенного в 1974 году (9).Согласно этому методу, осмотическая резистентность эритроцитов, помещенных на 30 минут в гипотоническую среду (0,40% раствор NaCl), определяется по интенсивности гемолиза эритроцитов. Для этого с помощью фотоэлектроколориметра определяют величину экстинкции надосадочной жидкости, в которой находились эритроциты. В способе (7) (для оценки β-адренореактивности эритроцитов их экспонируют в гипотонической среде совместно с β-адреноблокатором. Степень уменьшения гемолиза эритроцитов под влиянием блокатора говорит об уровне β-адренореактивности - чем больше величина снижения экстинкции надосадочной жидкости, тем выше β-адренореактивность эритроцитов. В норме, значение этого показателя (β-АРМ) составляет 2-20%. Более высокие значения указывают на снижение β-адренореактивности эритроцитов. По мнению (7) низкая β-адренореактивность эритроцитов может быть следствием десенситизации адренорецепторов, возникающей при повышении интенсивности адренергических воздействий на органы и ткани, например, при стрессе. По этой причине способ рекомендован для определения у пациентов уровня стресса, или для изучения природы артериальной гипертензии. Этот способ был применен и для оценки адренореактивности беременных женщин (1), у которых в конце беременности и в родах показатель β-АРМ был очень высоким. Эти авторы показали, что исход родов у женщин зависел от значений показателя β-АРМ. Отметим, что наряду со способом (7) предложены подобные способы оценки адренореактивности эритроцитов. Например, используют экспозицию эритроцитов в гипотонической среде (0,40% раствор NaCl), при наличии в ней адреналина или других адренергических средств - ницерголина, пропранолола и атенолола (3).

Недостатками способа (7)) являются:

- несовершенство способа определения содержания гемоглобина в надосадочной жидкости (0,40% раствор NaCl, что порождает нестабильность результатов исследования. Все это говорит о том, что данный способ не отражает β₂-адренореактивность эритроцитов.

- осутствие возможности оценки α-адренореактивности эритроцитов,

- отсутствие возможности оценить адренореактивность эритроцитов в зависимости от длительности их жизни.

В качестве прототипа рассматривается способ оценки осмотической резистентности эритроцитов (18). Способ основан на подсчете числа эритроцитов (в расчете на 1 л крови, или на 80 малых квадратов счетной камеры с сеткой Горяева), подвергнутых 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции в дистиллированной воде, содержащей 2,5 мМ CaCl₂. Этим способом показано, что циркулирующие в периферической крови эритроциты можно дифференцировать по их устойчивости к гипоосмотической среде на отдельные фракции и детально изучить их свойства.

Недостаток способа

- способ не позволяет оценить адренореактивность эритроцитов, в том числе адренореактивность эритроцитов фракций Ф30, Ф45, Ф60, Ф90, Ф120, так как в нем не предусмотрена оценка ОРЭ под влиянием адреналина и других адренергических средств. По этой причине, используя прототип, невозможно провести дифференциальное определение α-, β₁- и β₂-адренореактивности фракций эритроцитов, в том числе, например, Ф45.

Предлагаемый нами способ оценки α- и β₂-адренореактивности эритроцитов фракции Ф45 апробирован при исследовании крови 10 молодых мужчин, 133 небеременных женщин, 33 беременных женщин - I, II и III триместры неосложненной беременности, т.е., соответственно, на 4-11, 14-20 и 27-38 неделях, 10 рожениц - 1 период неосложненных срочных родов на 38-40 неделях.

Реализация предлагаемого способа заключается в том, что у исследуемых общепринятым способом производится забор 0,02 мл капиллярной крови (например, с помощью микропипетки гемометра Сали). Этот объем крови добавляется в пробирку, содержащую 0,2 мл 0,9% раствора NaCl, гепарин (1 МЕ/мл) и CaCl₂ (2,5 мМ); т.е. капиллярная кровь разводится в 10 раз. Затем 0,02 мл этой разведенной в 10 раз крови добавляется в пробирку, содержащую 0,4 мл 3% раствора NaCl, что дает конечное разведение крови в 200 раз и позволяет, используя классический метод микроскопического подсчета эритроцитов в счетной камере Алферова-Бюргера с сеткой Горяева, оценить исходное число эритроцитов в 1 л крови (абсолютный контроль). После этого готовится ряд из 11 пробирок. Первая пробирка содержит 0,2 мл дистиллированной воды (ДВ), в которой концентрация CaCl₂ составляет 2,5 мМ. Эта пробирка служит контролем, позволяющим оценить устойчивость эритроцитов к 45-секундной экспозиции в гипотонической среде при отсутствии в ней адренергических средств (К45). Следующие пять пробирок (со 2-й по 6-ю) содержат по 0,2 мл ДВ, в которой помимо CaCl₂ (2,5 мМ) содержится адреналин в соответствующей концентрации (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл). Эти пробирки служат для оценки влияния указанных концентраций адреналина на устойчивость эритроцитов к 45-секундной экспозиции в гипотонической среде при интактных адренорецепторах (Оадр). Остальные пять пробирок (с 7-й по 11-ю) тоже содержат по 0,2 мл ДВ, в которой помимо CaCl₂ (2,5 мМ) имеются адреноблокаторы (10^-6 г/мл), в том числе атенолол (селективный блокатор β₁-АР) и ницерголин (неселективный блокатор α-АР), и адреналин в соответствующей (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) концентрации. Эти пробирки служат для оценки влияния указанных концентраций адреналина на устойчивость эритроцитов к 45-секундной экспозиции в гипотонической среде в условиях одновременной блокады α-АР и β₁-AP, т.е. при наличии интактных β₂-АР (Оадр+бл). После подготовки пробирок к исследованию в каждую из них добавляется по 0,02 мл 10-кратного разведения крови, а ровно через 45 с (от момента добавления этой порции крови) в каждую пробирку для остановки гемолиза добавляется по 0,2 мл 6% раствора NaCl. Это приводит к конечному разведению крови в каждой пробирке в 200 раз и к созданию среды, содержащей 3% раствор NaCl. Далее производится подсчет числа негемолизированнных эритроцитов в каждой пробирке (в расчете на 1 л крови или на 80 малых квадратов сетки Горяева). Число негемолизированных эритроцитов в каждой из десяти (со 2-й по 11-ю) пробирок, т.е. Оадр и Оадр+бл можно выразить в процентах к ЧНЭ, сохранившихся при 45-секундной экспозиции крови в ДВ без адренергических средств, т.е. в 1-й пробирке (К45).

Вместо капиллярной крови можно использовать венозную кровь. Для этого 1,0 мл венозной крови вносят в пробирку, содержащую 0,1 мл раствора гепарина в концентрации 1 МЕ/мл. Для дальнейшего исследования ОРЭ и адренореактивности используют 0,02 мл гепаринизированной венозной крови, т.е. проводят с ней все те же действия, что описаны выше в отношении 0,02 мл капиллярной крови.

Способ может быть использован для оценки адренореактивности эритроцитов других фракций эритроцитов, т.е. Ф30, Ф60, Ф90 и Ф120. С этой целью для всех 11 пробирок вместо 45-секундной экспозиции в ДВ применяют соответственно 30-, 60-, 90- или 120-секундную экспозицию.

Во всех случаях рост ОРЭ происходит при активации α-АР и, в меньшей степени, β₁-АР, а снижение ОРЭ возникает при активации β₂-АР. Поэтому повышение ОРЭ под влиянием адреналина (при отсутствии в среде адреноблокаторов, т.е. в пробирках серии Оадр) расценивается как доминирование эффективности активации α-АР, а снижение ОРЭ - как доминирование эффективности активации β₂-АР. Изменение ОРЭ при блокаде α-АР и β₁-AP ницерголином и атенололом (т.е. в пробирках серии Оадр+бл) позволяет оценить вклад всех популяций АР, в том числе α-АР, β₁-АР и β₂-АР в ответ эритроцита на воздействие адреналина. В частности, усиление способности адреналина снижать ОРЭ указывает на выраженность эффекта активации β₂-АР, а отсутствие подобного явления говорит о нулевом эффекте активации этих рецепторов. Нами установлено, что сами по себе адреноблокаторы ницерголин и атенолол в концентрациях 10^-6 г/мл и по отдельности и при совместном воздействии не влияют на ОРЭ при 45-секундной экспозиции в ДВ.

Принцип, лежащий в основе заявляемого способа, может быть использован для оценки эффективности активации других рецепторов, содержащихся в мембране эритроцитов, в том числе М-холинорецепторов, но при условии, что агонист соответствующего рецептора (например, ацетилхолин), способен влиять на осмотическую резистентность эритроцитов в условиях кратковременной экспозиции эритроцитов в ДВ.

Во всех случаях при оценке адренореактивности или других видов реактивности эритроцитов для подсчета числа эритроцитов можно использовать классический визуальный метод с использованием камеры Алферова-Бюргера с сеткой Горяева (в наших исследованиях был использован микроскоп типа Биолам ЛОМО ИМ 13 при 80- и 400-кратных увеличениях), либо цитофотометрические методики, используемые в современной клинической практике.

В качестве примеров ниже приводятся данные (M±m), полученные нами при исследовании адренореактивности эритроцитов мужчин, небеременных женщин, беременных и рожениц. При этом различия оценивали по критерию Манна-Уитни, считая их достоверными при p<0,05.

Пример. 1. Адренореактивность эритроцитов мужчин. Установлено (табл.1, фиг. панель А), что при воздействии адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл на интактные эритроциты, число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) снижалось, соответственно, до 72,2±4,9*, 77,9±3,8*, 85,8±4,5*, 81,7±5,6*, 90,7±6,4*% от контроля, т.е. от К45. При этом максимальное снижение ОРЭ наблюдалось при использовании адреналина в низкой концентрации (10^-10 г/мл), а минимальное - при его использовании в высокой концентрации (10^-6 г/мл). Это означает, что адреналин снижает ОРЭ, причем величина этого снижения уменьшается с ростом концентрации адреналина. При воздействии адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) на фоне блокады α-АР ницерголином (10^-6 г/мл) и блокады β₁-АР атенололом (10^-6 г/мл), число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) составило, соответственно, 69,3±6,9*, 74,8±4,8*, 75,8±4,2*, 83,5±4,8*, 68,9±2,9*^#%. Таким образом, способность адреналина снижать ОРЭ в условиях блокады α-АР и β₁-AP достоверно возрастает. Эти данные указывают на то, что: 1) способность адреналина снижать ОРЭ связана с активацией β₂-АР. Этому препятствует активация α-АР и, в определенной степени, β₁-АР; 2) в эритроцитах мужчин доминируют β₂-АР, так как адреналин при отсутствии в среде адреноблокаторов снижает ОРЭ. Это особенно выражено при использовании адреналина в концентрации 10^-10 г/мл, которая, вероятно, является подпороговой для активации α-АР.

Пример 2. Адренореактивность эритроцитов небеременных женщин с учетом фазы менструального цикла.

Установлено (табл., фиг. панель Б и В), что у женщин в фолликулярную фазу менструального цикла адреналин при действии на интактные эритроциты достоверно снижает ОРЭ в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8 г/мл, не влияя на нее в концентрациях 10^-7 и 10^-6 г/мл. Действительно, при действии адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) составило соответственно 84,4±4,8*, 87,2±4,9*, 87,9±4,0*, 91,5±4,5 и 98,9±9,5% от контроля. Блокада α- и β₁-AP ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина в концентрациях 10^-7 и 10^-6 г/мл снижать ОРЭ. Действительно, при использовании адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл совместно с адреноблокаторами число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) составило соответственно 85,9÷5,1%*, 82,4±9,3%, 80,9±4,9%*, 87,8±6,5% и 81,9±6,5%* от контроля. В целом, эти данные указывают на то, что у женщин эритроциты содержат как α-АР и β₁-AP (при их активации ОРЭ возрастает), так и β₂-АР (при их активации ОРЭ снижается). Адренореактивность эритроцитов женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла, отличается от адренореактивности эритроцитов мужчин. Это отличие заключается в том, что у женщин эритроциты имеют более низкую эффективность активации β₂-АР, чем у мужчин.

Показано, что у женщин в лютеиновую фазу менструального цикла адреналин, воздействуя на интактные эритроциты, во всех исследуемых концентрациях (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) не влияет на ОРЭ - ЧНЭ в его присутствии составило соответственно 94,3±7,8%, 91,9±5,9%, 90,5±5,6%, 90,4±7,7 и 96,7±8,7% от контроля. Блокада α- и β₁-АР ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина снижать ОРЭ. Это достоверно выявлено при использовании адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9 и 10^-6 г/мл. Так, при действий адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) ЧНЭ составило соответственно 87,6±4,6*, 85,2±5,3*, 97,9±6,8, 86,7±4,5 и 82,1±7,2*% от контроля, т.е. от К45. В целом, эти данные указывают на то, что у женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, как и у мужчин, эритроциты содержат α-АР, β₁-AP и β₂-АР. При этом адренореактивность эритроцитов женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, существенно отличается от адренореактивности эритроцитов мужчин и от эритроцитов женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла. Это отличие заключается в более высокой эффективности активации α-АР и β₁-АР и в более низкой эффективности активации β₂-АР. В целом, примеры 1 и 2 демонстрируют, что предлагаемый способ позволяет выявить гендерные особенности адренореактивности эритроцитов, а также демонстрирует способность половых гормонов (андрогенов и прогестерона) влиять на эффективность активации АР эритроцитов. Из представленных результатов следует, что андрогены повышают эффективность активации β₂-АР эритроцитов, а прогестерон повышает эффективность активации α-АР эритроцитов.

Пример 3. Адренореактивность эритроцитов беременных женщин (I, II и III триместры физиологически протекающей беременности) Установлено (табл., фиг. панель Г), что у женщин в I триместре беременности адреналин при действии на интактные эритроциты достоверно снижает ОРЭ в концентрациях 10^-10, 10^-8 и 10^-7 г/мл, не влияя на нее в концентрациях 10^-9 и 10^-6 г/мл. Действительно, при действии адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) ЧНЭ составило соответственно 82,2±5,9*, 90,7±4,7, 84,5±5,8*, 82,9±5,7* и 89,2±11,3% от контроля. Блокада α- и β₂-АР ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина в концентрациях 10^-9 и 10^-6 г/мл снижать ОРЭ. Так, при воздействии адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) совместно с адреноблокаторами ЧНЭ составило соответственно 85,4±7,4*, 79,4±8,9*, 82,5±5,9*, 74,1±7,4* и 76,9±6,1*% от контроля. В целом, эти данные указывают на то, что в I триместре физиологически протекающей беременности у женщин, как и у мужчин и небеременных женщин, эритроциты содержат α-АР, β₁-АР и β₂-АР. При этом адренореактивность эритроцитов беременных женщин отличается от адренореактивности эритроцитов небеременных женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла. Это отличие заключается в том, что у беременных женщин возрастает эффективность активации β-АР эритроцитов, что мы объясняем ростом концентрации в крови прогестерона и эстрогенов.

Показано, что у женщин во II триместре беременности (табл., фиг. панель Д) адреналин при действии на интактные эритроциты достоверно снижает ОРЭ в концентрациях 10^-10, 10^-9 и 10^-8 г/мл, не влияя на нее в концентрациях 10^-7 и 10^-6 г/мл. Действительно, при действии адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл ЧНЭ составило соответственно 78,2±4,9*, 84,7±5,2*, 87,5±4,3*, 96,4±6,9 и 96,6±6,9% от контроля. Блокада α- и β₁-АР ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина в концентрациях 10^-7 и 10^-6 г/мл снижать ОРЭ. Так, при воздействии адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) совместно с адреноблокаторами ЧНЭ составило, соответственно, 82,0±8,1*; 84,4±7,1*; 90,2±6,8; 81,3±9,3* и 72,7±8,3*% от контроля. В целом, эти данные указывают на то, что в II триместре физиологически протекающей беременности, как в и I триместре, эритроциты содержат упомянутые выше типы АР. При этом сохраняется относительная высокая β₂-адренореактивность эритроцитов, т.е. доминирование эффективности активации β₂-АР. Это объясняется наличием в крови высоких уровней прогестерона и эстрогенов.

Показано, что у женщин в III триместре беременности (табл., фиг. панель Е) адреналин при действии на интактные эритроциты достоверно снижает ОРЭ в концентрациях 10^-10, 10^-9 и 10^-8 г/мл, не влияя на нее в концентрациях 10^-7 и 10^-6 г/мл. Действительно, при действии адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл, ЧНЭ составило соответственно 88,3±7,7*, 84,9±6,4*, 93,2±7,3*, 97,5±5,4 и 101,8±5,8% от контроля. Блокада α- и β₁-АР ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина в концентрациях 10^-8, 10^-7 и 10^-6 г/мл снижать ОРЭ. Так, при воздействии адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) совместно с адреноблокаторами ЧНЭ составило, соответственно, 74,6±7,1*, 79,4±6,6*, 75,0±5,4*#, 77,2±3,4*# и 70,8±3,3*#% от контроля. Эти данные указывают на то, что в III триместре физиологически протекающей беременности, как и в I и II триместрах, эритроциты содержат упомянутые выше типы АР. При этом сохраняется относительная высокая β₂-адренореактивность эритроцитов, т.е. доминирование эффективности активации β₂-АР. Это объясняется наличием в крови высоких уровней прогестерона и эстрогенов.

В целом, пример 3 демонстрирует наличие изменения адренореактивности эритроцитов при физиологически протекающей беременности. Они возникают уже в I триместре и сохраняются на протяжении последующих двух триместров. Эти изменения состоят в повышении эффективности активации β₂-АР, которое возникает в результате увеличения в крови уровня прогестерона и эстрогенов. Эти изменения отражают повышение эффективности активации β₂-АР в миометрии, что, согласно данным литературы (19), способствует вынашиванию беременности. Это означает, что адренореактивность эритроцитов отражает адренореактивность миометрия, а заявляемый нами способ оценки адренореактивности эритроцитов улавливает эти изменения.

Пример 4. Адренореактивность эритроцитов рожениц (I период физиологически протекающих родов)

Показано, что у рожениц (табл., фиг. панель Ж) адреналин при действии на интактные эритроциты достоверно снижает ОРЭ только в высоких концентрациях (10^-7 и 10^-6 г/мл), не влияя на нее в концентрациях 10^-10, 10^-9 и 10^-8 г/мл. Действительно, при действии адреналина в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл ЧНЭ составило соответственно 92,2±5,6; 97,9±7,7; 94,5±4,5; 88,9±3,9* и 87,2±5,6*% от контроля. Блокада α- и β₂-АР ницерголином и атенололом усиливала способность адреналина во всех исследованных концентрациях снижать ОРЭ. Так, при использовании адреналина (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл) совместно с адреноблокаторами ЧНЭ составило, соответственно 67,1±3,5*#, 65,6±4,2*#, 67,2±4,2*#, 67,4±4,3*# и 66,3±4,5*#% от контроля. Эти данные указывают на то, что эритроциты рожениц, как и эритроциты мужчин, а также эритроциты небеременных и беременных женщин содержат α-АР, β₁-АР и β₂-АР. Однако при этом адренореактивность эритроцитов существенно меняется - происходит достоверный рост эффективности активации как β₂-АР, так и α-АР и, вероятно, β₂-АР. Эти изменения можно объяснить тем, что у женщин к началу родов концентрация прогестерона достигает максимальных значений (поэтому дополнительно возрастает эффективность активации β₂-АР), и одновременно значительно увеличивается содержание эстрогенов (это приводит к значительному росту эффективности активации α-АР и, вероятно, β₁-AP). Выявленные изменения отражают повышение эффективности активации α-АР в миометрии, отмеченное ранее в литературе (19), благодаря чему возможно наступление родового процесса.

Таким образом, пример 4 подтверждает вывод о том, что адренореактивность эритроцитов отражает адренореактивность миометрия, а заявляемый нами способ оценки адренореактивности эритроцитов улавливает эти изменения.

В таблице 1 указано число негемолизированных эритроцитов при их 45-секундной экспозиции в дистиллированной воде совместно с адреналином (Адр; Э_{45 адр}) или с адреналином с блокаторами (Б; Э_{45 адр+бл.}) - ницерголином (10^-6 г/мл) и атенололом (10^-6 г/мл), в процентах к числу негемолизированных эритроцитов при их 45-секундной экспозиции в дистиллированной воде без адренергических средств.

Табл. 1 Адренергическое средство Концентрация адреналина, г/мл Р 10^-10 10^-9 10^-8 10^-7 10^-6 1 Мужчины (n=10; Э_а - 3,90±0,21×10¹²; К₄₅=2,86±0,18×10¹²) Адреналин 72,2±4,9* 77,9±3,8* 85,8±4,5* 81,7±5,6* 90,7±6,4* 10-8,6 Адр+блокаторы 69,3±6,9* 74,8±4,8* 75,8±4,2* 83,5±4,8* 68,9±2,9*# 7-10,6 2 Женщины, фолликулярная фаза цикла (n=11; Э_а - 4,04±0,19×10¹²; К₄₅=2,67±0,11×10¹²) Адреналин 84,4±4,8* 87,2±4,9* 87,9±4,0* 91,5±4,5 98,9±9,5   Адр+блокаторы 85,9±5,1* 82,4±9,3 80,9±4,9* 87,8±6,5 81,9±6,5*   3 Женщины, лютеиновая фаза цикла (n=10; Э_а - 4,12±0,18×10¹²; К₄₅=2,85±0,15×10¹² Адреналин 94,3±7,8 91,9±5,9 90,5±5,6 90,4±7,7 96,7±8,7   Адр+блокаторы 87,6±4,6* 85,2±5,3* 97,9±6,8 86,7±4,5 82,1±7,2*   4 Беременные, I триместр, 4-11 нед (n=11; Э_а - 5,52±0,18×10¹²; К₄₅=2,38±0,12×10¹²)   Адреналин 82,2±5,9* 90,7±,7 84,5±5,8* 82,9±5,7* 89,2±11,3   Адр+блокаторы 85,4±7,4* 79,4±8,9* 82,5±5,9* 74,1±7,4* 76,9±6,1*   5 Беременные, II триместр, 14-20 нед., (n=11; Э_а - 2,86±0,19×10¹²; К₄₅=2,11±0,13×10¹²)   Адреналин 78,2±4,9* 84,7±5,2* 87,5±4,3* 96,4±6,9 96,6±6,9 10-6 Адр+блокаторы 82,0±8,1* 84,4±7,1* 90,2±6,8 81,3±9,3* 72,7±8,3*   6 Беременные, III триместр, 27-38 нед. (n=11; Э_а - 3,35±0,19×10¹²; К₄₅=2,44±0,13×10¹²   Адреналин 88,3±7,7* 84,9±6,4* 93,2±7,3* 97,5±5,4 101,8±5,8 9-6 Адр+блокаторы 74,6±7,1* 79,4±6,6* 75,0±5,4*# 77,2±3,4*# 70,8±3,3*#   7 Роженицы, I период родов 38-41 нед (n=10; Э_а - 3,02±0,17×10¹²; К₄₅=2,39±0,11×10¹²)   Адреналин 92,2±5,6 97,9±7,7 94,5±4,5 88,9±3,9* 87,2±5,6*   Адр+блокаторы 67,1±3,5*# 65,6±4,2*# 67,2±4,2*# 67,4±4,3*# 66,3±4,5*#  

Где: Э_а - абсолютное число эритроцитов в 1 л крови; К₄₅ - число негемолизированных эритроцитов при их 45-секундной экспозиции в дистиллированной воде без адренергических средств, в процентах к Э_а

* - различие с числом негемолизированных эритроцитов при их 45- секундной экспозиции в дистиллированной воде (К₄₅) достоверно (p<0,05) по критерию Манна-Уитини

# - различие с числом негемолизированных эритроцитов в присутствии адреналина (О_Адр) достоверно (p<0,05) по критерию Манна-Уитини;

Р - достоверность различий между показателями, полученными при различных концентрациях адреналина; например, запись 10-8,6 означает, что значение, полученное при концентрации адреналина, равной 10^-10 г/мл, достоверно (p<0,05 по критерию Манна-Уитини) отличается от значений, полученных при использовании адреналина в концентрации 10^-8 или 10^-6 г/мл

На фиг. приведено число негемолизированных эритроцитов мужчин (панель А), небеременных женщин в фолликулярной (панель Б) или в лютеиновой (панель В) фазе менструального цикла, беременных женщин в I, II и III триместрах (панели Г, Д и Е) и рожениц (панель Ж) при экспозиции эритроцитов в дистиллированной воде (ДВ), содержащей 2,5 мМ CaCl₂ и адреналин в концентрациях 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл (светлые столбцы) и в ДВ, содержащей 2,5 мМ CaCl₂, адреналин и адреноблокаторы (10^-6 г/мл) -ницерголин и атенолол (темные столбцы). По оси абсцисс - число негемолизированных эритроцитов, выраженное в процентах от числа эритроцитов, находящийся 45 с в ДВ, содержащей 2,5 мМ CaCl₂, т.е. без адренергических средств (К45); по оси ординат - концентрация адреналина.

* - различие с контролем, т.е. с К45 достоверно по критерию Манна-Уитни.

Преимущества заявляемого способа (отличительные черты):

1. Способ позволяет оценить адренореактивность любых фракций эритроцитов, отличающихся между собой по длительности сохранения своей структуры при экспозиции в дистиллированной воде, а, следовательно, и по длительности жизни.

2. Способ позволяет оценивать дифференцированно α- и β-адренореактивность эритроцитов. При наличии селективных агонистов и адреноблокаторов способ дает возможность оценить α_1-, α₂-, β₁, β₂- и β₃-адренореактивность, т.е. эффективность активации всех видов адренорецепторов эритроцитов.

3. Способ является универсальным - не имеет половых ограничений; он может быть использован для оценки адренореактивности женщин, находящихся на любой стадии репродуктивного процесса, а также у пациентов с любым видом патологии. Поэтому он может применяться во всех областях медицины, а также в экспериментальной физиологии, фармакологии и токсикологии.

4. Способ позволяет оценивать адренореактивность эритроцитов всех видов животных и поэтому может быть использован в ветеринарии.

5. Способ достаточно легко выполним в любой клинической лаборатории, оснащенной световым микроскопом и камерами для подсчета эритроцитов. Для повышения производительности труда клинических лаборантов и научных работников можно применять современные цитофотометрические способы.

6. Способ не требует большого объема крови - для его реализации достаточно 0,04 мл капиллярной крови или 0,4 мл венозной крови.

Литература

1. Адамян Л.В., Смольникова Т.Ю., Длусская И.Г., Стрюк Р.И., Ляшко Е.С., Бейлин А.Л., Мисхин СВ., Герасимов А.Н., Брагинская С.Г. Метод оценки адренореактивности организма (β-АРМ) у беременных для прогнозирования течения родов // Проблемы репродукции. - 2006, №1. - С.91-97.

2. Бабин А.П., Циркин В.И., Гусева Е.В., Дворянский С.А., Трошкина Н.А., Костяев А.А., Круть И.Ю. Оценка адренореактивности эритроцитов женщин по изменению их осмотической резистентности на фоне адренергических средств // Актуальные вопросы акушерства и гинекологии: Сб. научных трудов, посвященный 15-летию кафедры акушерства и гинекологии КГМА. - Киров: КГМА, 2005 г. - С.5-9.

3. Бабин А.П., Трошкина Н.А., Циркин В.И., Дворянский С.А., Гусева Е.В. Оценка α- и β-адренореактивности эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адренергических средств // Артериальная гипертензия. - 2006 г. - Т.12. Приложение С.7-8.

4. Белева С.В., Вершинина Е.Ю., Корчемкина Е.В., Сухова А.Ю., Циркин B.И., Проказова Н.В., Костяев А.А. Влияние адреналина и лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) // Успехи современного естествознания. - 2006. - №8. - C.69-70.

5. Бондарчук В.В., Коровина О.В., Собченко С.А., Минеев В.Н. О бронхообструктивном синдроме при бронхоэктазиях // Терапевтический архив. - 2004. - Т.76, №12. - С 51-53.

6. Геворкян Н.А. Состояние мембрано-рецепторного комплекса эритроцитов у больных различными клинико-патогенетическими формами первичного хронического бронхита // Автореф. дис.…к.м.н. - Спб., 1995. - 19 с.

7. Длусская И.Г., Стрюк Р.И. Способ определения гиперадренергической формы гипертонической болезни. Патент РФ №2026552. БИ, 1995, №1.

8. Колобова Е.В., Дворянский С.А., Циркин В.И. Способ оценки адренореактивности эритроцитов беременных женщин по изменению скорости оседания эритроцитов на фоне их блокады β-адренорецепторов (определение β-адренозависимой СОЭ. // Патент на изобретение Ru №2120632 C1 от 20.10.98. Описание изобретения к патенту Российской Федерации. Бюллетень №29, 1998 а.

9. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. - С.119-120.

10. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии // Под ред. Е.И. Чазова - М.: Медицина, 1987. - 367 с.

11. Минеев В.Н., Жихарев С.С., Яблонская В.Н. Особенности агрегации эритроцитов при различных формах бронхиальной астмы // Врачебное дело. - 1989. - №5. - с.92-94.

12. Северин Е.С.(ред). Биохимия: Учебник - М.: ГЭОТАР - МЕД, 2003 - 784 с

13. Соминский В.Н., Окунь К.В. Повышение осмотической резистеноности эритроцитов крови под влиянием пропранолола. // Лабораторное дело. - 1981. - №9. - С.525-527.

14. Спасов А.А., Островский О.В., Дегтярев А.Н., Кучерявенко А.Ф. Изучение агрегации эритроцитов на лазерном агрегометре // Клиническая лабораторная диагностика - 2000.- №5. - С.21-23.

15. Стрюк Р.И., Длусская И.Г. Адренореактивность и сердечно-сосудистая система. - М. Медицина, 2003.- 160 с.

16. Тихомирова И.А. Роль экстрацеллюлярных, мембранных и внутриклеточных факторов в процессе агрегации эритроцитов // Автореф. дисс.…д.б.н. - Ярославль, 2006. - 47 с.

17. Трошкина Н.А., Циркин В.И., Дворянский С.А., Ивашкина Е.П. Оценка адренореактивности эритроцитов небеременных и беременных женщин с физиологически протекающей и осложненной гестозом беременностью // Пермский медицинский журнал - 2007. - Т.24, №1-2., Приложение. - С.140-145.

18. Циркин В.И., Крысова А.А., Куншин А.А. Способ оценки осмотической резистентности эритроцитов. // Патент на изобретение Ru №2419792 С1 от 07.12.2009. Описание изобретения к патенту Российской Федерации. Бюллетень №5, 2011.

19.Циркин В.И., Дворянский С.А. Сократительная деятельность матки (механизмы регуляции). - Киров, 1997. - 270 с.

20. Чекман И.С, Бударин Л.И., Нурщуенко Н.Е. и др. Взаимодействие β-адренергических средств с плазматическими мембранами миокарда // Бюл. Экспер. биологии и медицины. - 1985. - Т 85, №8. - С. - С.208-210.

Способ относится к лабораторным методам исследования в гематологии и физиологии и применяется для оценки α- и β₂-адренореактивности эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адреналина и адреноблокаторов. Сущность изобретения состоит в том, что из 0,02 мл забранной крови, разведенной в 10 раз, готовят ряд из 11 пробирок, где первая пробирка содержит 0,2 мл дистиллированной воды (ДВ) с 2,5 мМ CaCl₂ (контроль); следующие пять пробирок содержат 0,2 мл ДВ, в которых помимо 2,5 мМ CaCl₂ содержится адреналин в соответствующей каждой пробирке концентрации (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл); а остальные 5 пробирок, помимо 0,2 мл ДВ, 2,5 мМ CaCl₂ содержат 10^-6 г/мл адреноблокаторы (атенолол и ницерголин) и адреналин в соответствующей для каждой пробирки концентрации (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл). Далее в каждую из пробирок добавляют по 0,02 мл крови, а через 45 сек - по 0,2 мл 6% раствора NaCI в соотношении 1:1. Производят расчет числа негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) в каждой пробирке. Повышение ЧНЭ означает доминирование α- АР, а снижение ЧНЭ - отражает доминирование β₂-АР. 7 ил., 1 табл.

Способ оценки α- и β₂-адренореактивности (АР) эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адреналина и адреноблокаторов, включающей исследование капиллярной или венозной крови человека, микроскопический подсчет числа негемолизованных эритроцитов (ЧНЭ), экспонированных в течение 45 с в дистиллированной воде (ДВ), содержащей 2,5 мМ CaCl₂, отличающийся тем, что из 0,02 мл забранной крови, разведенной в 10 раз, готовят ряд из 11 пробирок, где первая пробирка содержит 0,2 мл дистиллированной воды (ДВ) с 2,5 мМ CaCl₂ (контроль); следующие пять пробирок содержат 0,2 мл ДВ, в которых помимо 2,5 м М CaCl₂ содержится адреналин в соответствующей каждой пробирке концентрации (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл); а остальные 5 пробирок, помимо 0,2 мл ДВ, 2,5 м М CaCl₂ содержат 10^-6 г/мл адреноблокаторы (атенолол и ницерголин) и адреналин в соответствующей для каждой пробирки концентрации (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 г/мл); далее в каждую из пробирок добавляют по 0,02 мл крови, а через 45 с - по 0,2 мл 6%-ного раствора NaCl в соотношении 1:1, далее производят расчет числа негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) в каждой пробирке, при этом повышение ЧНЭ означает доминирование α-АР, а снижение ЧНЭ отражает доминирование β₂-АР.