АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений энергетического обмена мозга при гипоксии.

Круг препаратов, обладающих антигипоксической активностью, ограничен. К наиболее часто применяемым относится натрия оксибутират, выраженной антигипоксической активностью обладают пирацетам и эмоксипин [1,2].

Антигипоксанты растительного происхождения в литературе отсутствуют.

Большое число случаев непереносимости синтетических лекарственных препаратов, побочные эффекты при их применении, а иногда и возникновение лекарственной болезни из-за их токсичности заставляют обращать внимание на возможность использования препаратов растительного происхождения, изыскивать новые антигипоксические средства, обладающие малой токсичностью или равной активностью с базовым препаратом, а в некоторых случаях и превышающие эту активность.

В настоящее время в медицинской практике не известно использование антигипоксантов природного происхождения, таким образом, предлагаемое средство не имеет адекватных аналогов.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является снижение побочных эффектов и повышение эффективности лечения гипоксии за счет применения предлагаемого средства, обладающего малой токсичностью и высокой эффективностью.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве антигипоксического средства используют экстракт шлемника байкальского (ЭШБ).

Таким образом, предлагаемый объект обладает "новизной", так как впервые автором предложен антигипоксант природного происхождения, использование ЭШБ в качестве антигипоксического средства является не очевидным и не вытекает явным для специалиста образом из уровня техники, поскольку это использование стало возможным благодаря выявленным у ЭШБ новым свойствам.

ЭШБ может быть использован в медицинской практике для коррекции нарушений энергетического обмена головного мозга при гипоксии. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "промышленно применимо".

Шлемник байкальский (Scutellaria Baicalensis Georgy) - многолетнее травянистое растение семейства Labiatae (Lamiaceae). Содержит ряд биологически активных веществ: флавоноиды (байкалин, байкалеин, вогонин, скутеллярин), большое количество пирокатехинов, крахмал, дубильные вещества и другие органические соединения [3]. Препарат шлемника байкальского широко употребляется в народной медицине, занимая четвертое место по частоте упоминания в рецептуре [4].

Известны свойства ЭШБ как препарата, обладающего умеренным противоопухолевым и выраженным противометастатическим действием, способного усиливать действие цитостатиков и препятствовать рецидивированию опухолей, способного стимулировать гемопоэз [5] . ЭШБ в качестве антигипоксанта в литературе не описан. Использование ЭШБ в качестве антигипоксанта стало возможным благодаря выявлению нами его новых свойств, а именно способности предупреждать нарушение функциональной активности ЦНС и системы энергопродукции головного мозга при гипоксии.

Пример 1. Влияние ЭШБ на поведение животных и обучаемость после гипоксической травмы. Гипоксическая травма изучалась на модели гипоксии гермобъема.

Эксперименты были выполнены на 280 мышах линии СВА массой тела 20-22 г. Препараты вводили зондом в желудок в виде взвеси в дистиллированной воде профилактически в течение 4 дней, предшествовавших гипоксическому воздействию и 5-й раз за 1 час до помещения животного в гермокамеру.

Для исследования было использовано два варианта методики. В первом - целью работы было изучить влияние препаратов на процесс выработки условно-рефлекторного навыка (условного рефлекса пассивного избегания - УРПИ) при ее нарушении, вызванном гипоксической травмой. При этом применялся короткий вариант гипоксического воздействия с использованием гермокамеры объемом 250 мл, выработка УРПИ осуществлялась непосредственно перед помещением в гермокамеру, животное находилось в гермокамере до появления первых судорог, после чего его извлекали и оставляли на сутки в общей клетке. Проверку сохранности рефлекса проводили через 24 часа после выработки.

Методика условного рефлекса пассивного избегания [6] основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов. Экспериментальная установка представляла из себя камеру, состоящую из двух отсеков - большого светлого и малого темного. Животное помещали в светлый отсек и через некоторое время оно переходило в темный, после чего отверстие, соединяющее оба отсека, перекрывали дверкой и на пол темного отсека, представляющий собой решетку из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 мс, частотой 5 герц и амплитудой 50 мА. Через 20 сек дверку открывали, давая животному возможность перейти в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животного вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. Для проверки выработки рефлекса животное помещали в светлый отсек в угол камеры, противоположный от входа, и наблюдали в течение 3 мин. Регистрировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода - ЛТ), суммарное время пребывания в темном отсеке, количество животных с выработанным рефлексом. Выработанным рефлекс считался в том случае, если латентное время захода превышало 150 сек. Животные, которые после помещения в светлый отсек сохраняли неподвижность и не приближались ко входу в темную часть камеры, при подсчете результатов не учитывались.

Во втором случае предполагалось исследовать течение постгипоксической энцефалопатии в отдаленные периоды после гипоксической травмы. В данном варианте использовалась гермокамера объемом 500 мл и, следовательно, более тяжелое гипоксическое воздействие.

В этом случае через 40 мин после извлечения животных из гермокамеры у них изучалось ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле, эмоциональная реакция по Brady и координация движений по методу вращающегося стержня.

Ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле представляет собой один из наиболее часто используемых методических приемов, применяемых для суждения о функциональном состоянии центральной нервной системы [6,7]. Экспериментальная установка "открытое поле" представляла собой камеру размером 40х40х20 см с квадратным полом и стенками белого цвета. Ее пол, разделенный на 16 квадратов, имел в каждом из них круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камера освещалась электрической лампой накаливания мощностью 100 ватт, расположенной на высоте 1 м от пола. Мышь помещалась в один из ее углов и в течение 2 минут регистрировали количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество умываний (груминг) и количество дефекаций по количеству фекальных шариков, вычислялся коэффициент асимметрии поведения, в виде отношения количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности, выраженного в процентах.

Эмоциональная реакция оценивалась по методу Brady и Nauta [8] для крыс в нашей модификации для мышей [9], при котором полуколичественным способом оценивалась реакция на 4 вида воздействий - захват в клетке, где животное постоянно живет, захват в руку после помещения животного на плоскую поверхность, реакция на приближение пинцета, реакция на толчок пинцетом, при этом дополнительно регистрировались дефекация с мочеиспусканием, писк и мышечное напряжение (всего 7 реакций). Каждая реакция оценивалась по 4-балльной системе, после чего все баллы суммировались, давая общую оценку эмоциональной реакции.

Вращающийся стержень представлял собой установку в виде стержня круглого сечения диаметром 2 см с шероховатой поверхностью, разделенного на 5 отрезков круглыми дисками диаметром 25 см и расположенного на расстоянии 45 см от пола камеры, стенки которой были окрашены в черный цвет. Мыши помещались на стержень строго по одному животному на отрезок, после чего он приводился во вращение со скоростью 5 об/мин. Через 30 сек стержень останавливался (этап адаптации), животным давали отдохнуть на стержне в течение 1 мин и снова приводили его во вращение, уже на 10 мин. Показателем функциональной активности являлось среднее время удержания на стержне, а также количество мышей, удержавшихся на стержне более 10 мин [10].

Через 1 час после извлечения из гермокамеры у всех животных этой серии вырабатывался рефлекс пассивного избегания, как это уже было описано выше. Проверка рефлекса производилась через 24 ч, 7-й, 14-й и 21-й день после выработки рефлекса.

Как следует из приведенных данных, гипоксическая травма вызывает в ближайшие сроки нарушения поведения, которые выражаются в резком ухудшении воспроизведения рефлекса через 24 ч после выработки (короткая гипоксия - табл. 1), снижение уровня эмоционального реагирования и нарушение координации движений (табл. 3), а также изменения в структуре ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле, которые выражаются в уменьшении представительства ряда компонентов (вертикальные стойки, норковый рефлекс) и повышении монотонии деятельности (увеличения коэффициента асимметрии). В отдаленные сроки (21-е сут) после длительного гипоксического воздействия наблюдались нарушение воспроизведения УРПИ при хорошем его воспроизведении в более ранний период и частичная гибель мышей.

Как следует из таблиц, в ранний период после гипоксической травмы ЭШБ наравне с пирацетамом улучшил практически все указанные показатели. Однако в отдаленные сроки после гипоксического воздействия эффект пирацетама был существенно ниже, чем у ЭШБ в отношении воспроизведения условного рефлекса, и несколько уступал ему по показателю отсроченной гибели (табл. 2,4).

Таким образом, ЭШБ при профилактическом введении, обладая равной с пирацетамом антигипоксической активностью в ближайшие периоды после гипоксического воздействия, существенно превосходит его по влиянию на отдаленные последствия гипоксической травмы. Полученные данные позволяют утверждать, что эффективность лечения ЭШБ будет меньше, чем при назначении имеющихся препаратов.

Пример 2. Острая токсичность ЭШБ.

Синтетические лекарственные препараты, как правило, характеризуются большей токсичностью и меньшим диапазоном терапевтического действия по сравнению с лекарствами растительного происхождения. В табл. 5 представлены полученные нами данные, характеризующие острую токсичность ЭШБ в сравнении с данными литературы по препаратам, используемым при терапии гипоксических повреждений различного генеза. Очевидно, что токсичность препарата ШБ много ниже, чем у препаратов сравнения.

Пример 3. Влияние ЭШБ на энергетический обмен головного мозга крыс при гипоксии.

Исследование проводили на белых беспородных крысах самцах массой 200-250 г. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно двукратно за 5 сут и за 1 час до эксперимента. Гипоксию гермообъема моделировали помещением животного в гермокамеру объемом 5 л на 2 часа. За время гипоксического воздействия у животных отмечено лишь изменение поведенческих реакций. Время наступления агональных явлений при данной модели патологии соответствует 3,5-4 часам.

По окончанию гипоксического воздействия животных декапитировали и выделенный головной мозг гомогенизировали. Дыхательную активность митохондрий гомогената головного мозга крыс исследовали полярографически по ранее описанной методике [13].

Среда гомогенизации: 0.12 M KCl, 0.002 М K₂CO₃, 0.01 M Hepes-буфера, 0.0002 М ЭДТА (pH - 7.2).

Среда инкубации: 0.12 M KCl, 0.002 M K₂CO₃, 0.01 M Hepes-буфера, 0.0002 М ЭДТА, 0.002 M KH₂PO₄(pH - 7.2).

Субстраты окисления: 0.0005 М янтарной кислоты, по 0.003 М глутамата и малата, 0.002 М малоната (указана конечная концентрация субстратов в полярографической ячейке).

Регистрировали скорости дыхания митохондрий гомогената до (V_4п, после (V_4о) и во время цикла фосфорилирования добавленной АДФ (V₃). АДФ вносили в ячейку в количестве 100 мкмолей.

В группе животных, не получавших препарата, после действия гипоксии при окислении сукцината отмечено увеличение скорости дыхания митохондрий во всех метаболических состояниях. Контролируемого дыхания (V_4п) до и после цикла фосфорилирования на 76 и 130% соответственно, фосфорилирующего дыхания (V₃) на 100%. Коэффициент АДФ/О, отражающий сопряженность процесса окислительного фосфорилирования, снизился на 22%, время фосфорилирования сократилось на 37%.

Аналогичные дыхательной активности митохондрий мозга наблюдались при окислении НАД-зависимых субстратов.

Выявленные изменения указывают на снижение энергетического контроля метаболизма в митохондриях мозга в ответ на гипоксию - развитие низкоэнергетического сдвига [14].

Профилактическое введение препаратов шлемника байкальского, натрия оксибутирата, эмоксипина позволило предотвратить развитие низкоэнергетического сдвига в ответ на гипоксию. В частности, независимо от типа окисляемого субстрата отмечено лишь небольшое увеличение скоростей дыхания органелл (V_4п на 10%, V₃ на 35%, V_4о на 31% при окислении сукцината и на 12%, 17% и 0% при окислении НАД-зависимых субстратов). Препараты предотвратили снижение во время гипоксии показателя сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О) (табл. N 6). Более того, несмотря на гипоксическое воздействие, коэффициент АДФ/О возрос до величин, превышающих таковые в интактной группе животных, что на фоне возрастания величины показателя дыхательного контроля (ДК) свидетельствует о формировании условий жесткого метаболического контроля, наличии признаков гиперкомпенсации энергозатрат [14].

Таким образом, все исследуемые препараты предотвращают нарушение энергетического метаболизма головного мозга при двухчасовом гипоксическом воздействии.

Пример 4. Влияние ЭШБ в сравнении с антигипоксантами эмоксипином и натрия оксибутиратом на время жизни животных при острой гипоксии гермообъема.

Опыты выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 23 - 25 г. Препараты вводили внутрижелудочно один раз в день в течение 3 сут. Гипоксию вызывали через сутки после последнего введения препарата. За 1 час до эксперимента животных лишали воды и корма. Гипоксию моделировали помещением животного в герметически закрытую стеклянную емкость объемом 250 мл. Время жизни регистрировали по появлению последнего агонального вдоха. (табл. N 7).

Все исследованные препараты оказывали выраженное влияние на устойчивость животных к гипоксии. Судя по величине средней продолжительности жизни, препарат ШБ оказывал более выраженное по сравнению с препаратами сравнения антигипоксическое действие.

Таким образом, экспериментальные исследования показали, что ЭШБ обладает выраженным антигипоксическим действием и следующими преимуществами в сравнении с другими антигипоксантами:
- малой токсичностью, что позволяет устранить побочные явления, вызванные использованием синтетических антигипоксантов,
- возможностью влияния на отдаленные последствия гипоксической травмы, что позволяет повысить эффективность лечения.

Литература
1. Рощина Л.Ф., Островская Р.У. Влияние пирацетама на устойчивость организма к гипоксии// Фармакология и токсикол., 1981. N 2. С. 210-213.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1986. С. 120.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Литвиненко В.И., Попова Т.П., Суслов Н.И. Шлемник байкальский. Томск, 1994. С. 23-52.

4. Там же. С. 53-63.

5. Там же. С. 131-147.

6. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения: пер. с англ/ Под ред. проф. А.С.Батуева. М.: Высшая Школа, 1991. 398 с.

7. Walsh R. N., Cummins R.A. The open-field test: a critical review // Psychol. Bull. -1976, Vol.83. P.482-504.

8. Brady J. V., Nauta W.J.H. Subcortical mechanisms in emotional behavioral affective changes following septal forebrain lessions in the albino rat.// J.comparative and physiol psychol. 1953. Vol.46. N 3. P. 339-341.

9. Суслов Н.И. Взаимодействие противоопухолевых препаратов фторафура и 5-фторурацила с психотропными препаратами аминазином и феназепамом: Дис. канд. мед. наук. М., 1983. 151 с.

10. Dunhan N.W., Myja T.S. A note a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice//J. Am.Pharm.Ass. l957. Vol.46. N 3. P. 208-209.

11. Гацура В.В., Саратиков А.С. Фармакологические агенты в экспериментальной медицине и биологии. Томск, 1977. С. 86.

12. Н. Van Hoof., Nootropil: Basik scientific and clinical data. Medical Profession prepared by UCB - Pharmaceutical Division, Brussel, 1980. P. 12.

13. Кондрашева М.Н., Григоренко Е.Б., Бабский А.М., Хазанов В.А. Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. Новосибирск, 1987. С. 40-66.

14. Кондрашова (ответственный редактор). Итоги координации исследований по теме: "Регуляция энергетического обмена и устойчивость организма". Пущино, 1975. С. 3.

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений энергетического обмена головного мозга при гипоксии. Сущность изобретения состоит в том, что используют экстракт шлемника байкальского. Предложенное средство оказывает более выраженный антигипоксический эффект по сравнению с известными антигипоксантами, и, кроме того, не зафиксированы побочные действия от приема препарата. 7 табл.

Применение экстракта шлемника байкальского в качестве антигипоксического средства.