СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A61L27/00 

Изобретение относится к технологии получения активных комплексов биологического назначения, в частности к способу получения активного комплекса биологического назначения и активному комплексу, получаемому данным способом.

Известен активный комплекс биологического назначения, включающий компонент структуры, по меньшей мере один компонент активации и формирования, по меньшей мере один компонент роста и матурации и по меньшей мере один компонент адгезии, причем компонент структуры выполнен в виде геля и/или сетчатой структуры (см. WO 91/06324, МКИ A 61 L 27/00, 1991).

Известный активный комплекс служит для получения любых желаемых биологических единиц, в частности органов живых существ.

Известный активный комплекс получают путем соосаждения индивидуальных компонентов, или путем лиофилизации, или путем ковалентного связывания индивидуальных компонентов друг с другом с последующим выделением.

Недостаток известного активного комплекса заключается в том, что его состав можно изменить лишь путем изменения соотношения индивидуальных компонентов друг к другу. Поэтому область применения и диапазон действия известного активного комплекса ограничены.

Задача изобретения заключается в создании активного комплекса биологического назначения, обладающего практически безограниченными возможностями применения и диапазоном действия.

Указанная задача решается в предлагаемом способе получения активного комплекса путем комбинации по меньшей мере двух компонентов и выделения получаемого комплекса за счет того, что перед выделением осуществляют денатурацию с получением гомогенной фазы, которая содержит по меньшей мере частично компоненты, имеющие по меньшей мере частично измененную структуру, полученную гомогенную фазу разделяют по меньшей мере на две части, и целевой комплекс получают путем ренатурации по меньшей мере одного заданного компонента по меньшей мере одной части вместе с другой частью или другими частями гомогенной фазы.

Цикл, включающий стадии денатурации и ренатурации, можно повторять несколько раз. Под "стадией ренатурации" в данном контексте следует понимать удаление средства, используемого для осуществления денатурации.

Получаемые таким образом активные комплексы имеют то преимущество, что содержащееся в них активное вещество целенаправленно освобождается лишь в организме. При этом речь может идти об одном активном веществе или же нескольких активных веществах, имеющихся в комплексе. Каждый цикл денатурации и ренатурации представляет собой своего рода прием обогащения (концентрации) соответствующего заданного активного вещества. Путем осуществления нескольких циклов любое активное вещество можно накапливать в активном комплексе так, что после введения в организм оно действует в точно определяемый и заданный период. Благодаря этому экзогенно могут применяться и такие в основном эндогенные активные вещества, которые в живом организме производятся лишь в небольших количествах и которые возможно имеются в комплексе, требуемом в качестве сырья для осуществления предлагаемого способа, лишь в качестве следов. При этом изобретением обхватывается также накапливание для получения активного комплекса нескольких активных веществ, имеющихся в исходном комплексе, независимо друг от друга в совсем разных концентрациях.

Согласно предпочтительному варианту предлагаемого способа концентрацию каждого заданного компонента снижают или же повышают в одной части гомогенной фазы, или же соответствующий компонент выделяют. При этом гомогенную фазу можно разделять на любое количество частей.

Предпочтительно гомогенную фазу разделяют на две части, концентрацию каждого заданного компонента в одной части снижают или повышают, или же данный компонент выделяют из этой части, и объединяют с другой частью гомогенной фазы.

Согласно другому предпочтительному варианту предлагаемого способа к активному комплексу добавляют по меньшей мере один дополнительный компонент, не имеющийся в исходном комплексе. Это позволяет сочетать эндогенно производимые активные вещества с другими естественными или же синтетическими активными веществами с достижением совсем новых, предопределяемых действий путем применения предлагаемого активного комплекса.

Используемый при осуществлении предлагаемого способа исходный комплекс можно получать путем взятия пробы из клеток, ткани или органа животного или человеческого происхождения. Однако его можно также получить из культур микробных или растительных клеток или организмов, или его можно получать синтетическим путем.

Кроме того, при осуществлении предлагаемого способа денатурацию исходных комплексов можно проводить обратимой, так что не происходит необратимых изменений в исходном комплексе или одном из его компонентов, что облегчает процесс ренатурации.

Предпочтительно для денатурации можно использовать кислоты, соли, хаотропные вещества, такие как, например, мочевину, детергенты и т.п. Согласно изобретению ренатурацию осуществляют путем удаления средств денатурации путем физического, химического или биологического метода.

Далее, предлагаемый способ позволяет получить активный комплекс для изготовления биологических единиц, в частности органов живых существ, причем разные индивидуальные компоненты согласованы с соответствующими целевыми клетками и служат для образования биологических единиц из собственных клеток организма.

Биологические единицы требуют определенного пространства для выполнения своих функций. Нередко для выполнения их функции необходима определенная геометрия, и биологические единицы имеют определенные границы, внутри которых они выполняют свои функции. Это равным образом относится к биологическим единицам, получаемым с применением предлагаемого активного комплекса. Используемый для получения биологических единиц активный комплекс выполняет эту функцию с помощью компонента структуры, который с одной стороны занимает место других компонентов и с другой стороны позволяет предопределить геометрическую форму, в рамках которой получаемая биологическая единица выполняет свои функции.

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту изобретения компонент структуры активного комплекса представляет собой прежде всего макромолекулярную трехмерную матрицу, которая может иметься вместе с водой и солью в виде геля разной степени набухания. В качестве примера пригодного геля для образования матрицы можно назвать протеогликановые гели. Кроме того, компонент структуры может представлять собой сетчатую структуру из волокон, например разные виды коллагенов или эластина. Далее годятся комбинации гелей с волокнами по образцу соединительных элементов из разных материалов. Для применения в разных целях, то есть для получения разных биологических единиц, компонент структуры выполняют в разной форме, например, в виде ваточного холста, твердого или жидкого геля, способных к резанию, фрезерованию, пластической деформации или литью.

Компонент структуры приспосабливают к требованиям получаемой в конечном итоге биологической единицы, так как имеется определенная специфичность между клеточными и внеклеточными компонентами биологических единиц. Поэтому в качестве источника для получения компонента структуры используют прежде всего внеклеточные материалы разных тканей или органов, например для получения кожи для производства компонента структуры используют кожные протеогликаны и волокнообразующие протеины, для получения селезенки - специфические для селезенки протеогликаны и волокнообразующие протеины, для получения кости - специфические для костей протеогликаны и волокнообразующие протеины и т. д. Компонент структуры может также содержать металлические, керамические, стекловидные, полимерные или содержащие жир носители, которые позволяют модифицировать геометрические, механические, химические или другие свойства компонента структуры. При этом носитель вместе с компонентом структуры может иметься в компактной или пористой форме, в виде мембраны или мицеллы, в вязкой форме или в жидкой форме, в зависимости от требований получения биологической единицы и выполняемой ей затем функции.

Согласно другой предпочтительной форме выполнения предлагаемого активного комплекса последний имеет образующую биологические единицы активность в основном лишь временно, то есть он выполнен так, что он поддается биологическому разложению в заданное время, и полностью исчезает после образования биологической единицы. Скорость разложения активного комплекса при этом можно предопределять путем поперечной сшивки полимерной матрицы разной степени и/или добавления ингибиторов (ферментов) и/или подавляющих иммунную реакцию веществ и/или противовоспалительных веществ. Приведенные ингибиторы могут представлять собой низкомолекулярные соединения, занимающие активный центр разлагающего фермента, или же образователи комплексов, связывающих незаменимый кофактор фермента, или нейтральные антитела. Возможны и другие механизмы ингибирования. В качестве противовоспалительных и/или подавляющих иммунную реакцию добавок можно использовать, например, ингибиторы фосфолипазы, такие как, например, стероиды, ингибиторы циклооксигеназы, такие как, например, индометацин, ингибиторы липоксигеназы как, например, нордигидрогваретовую кислоту, подавляющие иммунную реакцию вещества типа циклоспоринов и/или антитимоцитного глобулина и т.д.

Для получения биологических единиц необходимо собирать живые клетки желаемого типа в области компонента структуры. Для этого компонент структуры активного комплекса содержит один или несколько компонентов активации и формирования, с помощью которых желаемые клетки возбуждаются к направленному движению. В качестве компонента активации и формирования годятся хемотактические вещества (хемотаксины).

Пригодные в конкретном случае хемотактические вещества известны для множества клеток, и их можно выделять из человеческих, животных, растительных или микроорганических источников, или же получать путем химического синтеза или с помощью биотехнических методов. При введении в организм получаемого вне тела живого организма компонента структуры вместе с его компонентом (или компонентами) активации и формирования и/или его приведения в контакт с целевыми клетками вне тела данных компонент создает градиент концентрации, в котором ориентируются целевые клетки, причем соответствующий компонент активации и формирования взаимодействует со специфическими опознавательными структурами на целевых клетках, называемыми также рецепторами. В том случае, если получаемая биологическая единица включает несколько видов клеток, то компонент структуры содержит несколько компонентов активации и формирования в виде хемотактических веществ, число которых соответствует числу видов клеток.

Специфичность соответствующего компонента активации и формирования к разным целевым клеткам и степень хемотактической активности определяют путем исследований, в рамках которых измеряют направленное перемещение желаемых клеток под воздействием градиента хемотактического вещества через определенные фильтр-поры в закрытой камере. С помощью таких методов исследования активный комплекс можно нормировать в биологическом отношении относительно соответствующего компонента активации и формирования, что имеет важное значение получения активного комплекса в промышленном масштабе.

В качестве хемотактических веществ служат, например, пептиды, такие как, например, никотинамид-флавин-метионин-лейцин-фенилаланин и/или метаболиты арахидоновой кислоты, такие как, например, лейкотриены, с помощью которых можно привлекать определенные клетки из крови или фагоциты. Протеины, такие как, например, привлекающий мезенхимовые клетки протеин, имеют хемотактическое действие, в частности, на клетки соединительной ткани.

Кроме специфичности соответствующего компонента активации и формирования в отношении желаемых целевых клеток и степени хемотактической активности и период образования и сохранения хемотактического градиента концентрации является важной величиной. В предлагаемом активном комплексе приспосабливание данной кинетики к требованиям получения биологических единиц достигается за счет управляемого освобождения соответствующего компонента активации и формирования из компонента структуры. При этом роль играет скорость разложения самого компонента структуры, а также вид связи между компонентом структуры и соответствующим компонентом активации и формирования, например вопрос о том, является ли эта связь ковалентной или ассоциативной связью. В случае ковалентной связи достигаются более медленное образование и более длительное сохранение хемотактического градиента, чем в случае лишь ассоциативной связи за счет ионных сил или водородной связи. Однако активация клеток для получения биологической единицы чаще всего осуществляется быстрее, чем разложение компонента структуры, так как иммигрировавшие клетки в значительной степени способствуют разложению протеогликана и коллагена.

Для образования биологических единиц после иммиграции клеток в компонент структуры клетки должны фиксироваться в место компонента структуры с тем, чтобы препятствовать их эмиграции в окружающие зоны и обеспечить стабильную архитектуру получаемой биологической единицы. Для этого активный комплекс содержит один или несколько компонентов адгезии, с помощью которых иммигрировавшие клетки фиксируются в месте компонента структуры. При этом компонент адгезии прикрепляется с одной стороны к образующим биологическую единицу клеткам, а с другой стороны - к макромолекулярной сетчатой структуре компонента структуры. Такие способствующие адгезии вещества известны, и они обладают определенной специфичностью прикрепления. В качестве примеров можно называть белки типа фибронектина или ламинина, с помощью которых к компоненту структуры можно прикреплять, например, клетки соединительной ткани или эпителиальные клетки. Имеется еще множество других факторов адгезии разной специфичности, которые используют в предлагаемом активном комплексе в зависимости от получаемой биологической единицы. К ним относятся, например, молекулы адгезии клеток L-CAM, N-CAM, молекулы адгезии матрицы цитотактин, тенасцин, ламинин, фибронектин, коллаген типов IV, V, VII и синтетические пептиды, представляющие собой участки последовательности разных факторов адгезии, и белки трансмембранного соединения, такие как, например, интегрин.

Для повышения специфичности прикрепления желаемых клеток к компоненту структуры при получении биологических единиц можно использовать антитела против нежелаемых компонентов адгезии. Биологическую активность компонентов адгезии можно определять в исследованиях по адгезии разного типа (например, с помощью центробежных сил и т.п.), и таким образом ее можно нормировать для всего активного комплекса.

Часто количество клеток, хемотактически привлекаемых в зону компонента структуры для получения биологической единицы и фиксируемых с помощью пригодных способствующих адгезии веществ, недостаточно для образования биологической единицы. Кроме того, имеющиеся в одном организме для осуществления такого процесса мобильные клетки чаще всего не имеются в достаточно зрелом состоянии для выполнения всех функций биологической единицы. Часто они представляют собой исходные клетки, из которых лишь должны образоваться работоспособные, зрелые клетки получаемой биологической единицы. Для этого предлагаемый активный комплекс содержит по меньшей мере один компонент роста и/или матурации, предпочтительно в виде одного или нескольких цитокинов, под воздействием которых число иммигрировавших клеток увеличивается, и происходит матурация клеток.

Цитокины представляют собой вещества с разной химической структурой, которые отличаются тем, что они взаимодействуют с клетками и влияют на их поведение размножения и роста, а также на их матурацию и производительность при биосинтезе. То есть, цитокины проявляют подобное гормонам действие, но в отличие от последних их действие является не дистанционным, а, скорее, локальным, что имеет преимущества при получении биологических единиц, так как и здесь речь идет о локальном процессе.

Специалисту известно множество разных цитокинов разной специфичности. Их можно использовать в качестве дальнейшего компонента активного комплекса, служащего для влияния на рост клеток, их дифференциации и матурации, а также для влияния на обмен веществ иммигрировавших клеток. Специфичность цитокинов относительно определенных клеток определяется наличием соответствующих рецепторов на целевых клетках, причем взаимодействие цитокина с рецептором вызывает последующие процессы в клетке. Данные рецепторы на целевых клетках представляют собой мембранные белки, взаимодействующие с используемым хемотактическим веществом, связывающие его и вводящие его в клетку. За счет повторного использования они все заново могут связывать хемотактическое вещество.

Аналогичное поведение показывают рецепторы для используемых в конкретном случае цитокинов, так что отличается лишь специфичность при аналогичном механизме взаимодействия. В то время как связывание хемотактического вещества приводит к направленному движению целевых клеток, связывание цитокинов к рецептору целевой клетки приводит к их росту и/или дифференциации. Во многих случаях структура рецепторов еще неизвестна, так что их можно узнавать лишь по специфичности к соответствующему лиганду (хемотактическому веществу, цитокину и т.д.).

При этом необходимо учитывать, что нередко в зависимости от специфичности используемого цитокина и целевой клетки могут вызываться у клеток стимулирующие или тормозящие процессы. Желаемый для получения биологических единиц процесс, вызываемый воздействием цитокина на клетки, чаще всего связан с двойственной передачей сигналов, так что предлагаемый активный комплекс предпочтительно содержит по меньшей мере два цитокина для достижения роста и дифференциации. Многие клетки после взаимодействия с цитокином сами образуют и освобождают дальнейшие цитокины, причем они могут стимулировать или тормозить сам себя. Нередко при отдельных шагах дифференциации специфичность клеток к определенным цитокинам изменяется, или последствие взаимодействия может изменяться со стимулирующего процесса в клетке в тормозящий процесс. Свойства большого числа цитокинов известны, так что действие цитокинов в активном комплексе также поддается нормированию.

В качестве примеров для цитокинов можно называть, например, для получения крови стимулирующие колонию факторы, для получения соединительной ткани - фактор роста фибробластов, для получения кожи - эпидермальный фактор роста, для получения хрящей - индуцирующий хрящи фактор, для получения селезенки или лимфатических узлов - активирующий лимфоциты фактор и пептиды селезенки, для получения тимуса - фактор роста Т-клеток и пептиды тимуса, для получения костей - фактор роста костей и трансформирующий фактор роста, а для получения кровеносных сосудов - фактор ангиогенеза. Кроме того, используются еще следующие цитокины: интерлейкины, подобные инсулину факторы роста, опухолево-некрозный фактор, простагландины, лейкотриены, трансформирующие факторы роста, производимый от тромбоцитов фактор роста, интерфероны и производимый от клеток эндотелия фактор роста.

Так как биологические единицы часто содержат несколько видов клеток, могут иметься и комбинации. Так, например, для обеспечения биологической единицы всем необходимым важно образование кровеносных сосудов, так что для ускоренного образования данных сосудов активный комплекс может дополнительно содержать фактор ангиогенеза в качестве цитокинового компонента. Аналогично ускоренное образование нервных связей может иметь важное значение, что можно обеспечивать добавлением к активному комплексу соответствующих дополнительных цитокинов.

В нижеследующем изобретение далее поясняется посредством примеров его осуществления.

Пример 1. Получение образующего кости активного комплекса из костей крупного рогатого скота
Кости крупного рогатого скота очищают и измельчают, и из них удаляют известь. Получаемая таким образом костная матрица представляет собой исходный комплекс для осуществления предлагаемого способа. К костной матрице добавляют раствор пригодного средства денатурации, например мочевины, и размешивают при температуре 10^oC в течение 24 часов. Для денатурации принципиально годятся окислительно-восстановительные реакции, ускоренные катализатором конверсии, реакция с хаотропными солями, изменение значения pH, температуры или ионных сил, механическое воздействие, вещества, обладающие поверхностно-активным действием (детергенты). Гомогенно растворенные доли костной матрицы отделяют, например, путем фильтрации или центрифугирования. Находящуюся в гомогенной фазе долю разделяют в объемном соотношении 1:1. Одну часть разделенной таким образом денатурированной гомогенной фазы затем подвергают фракционированию, например, путем хроматографии, электрофореза, ультрафильтрации или диализа. Полученную таким образом желаемую фракцию согласно изобретению добавляют к другой части денатурированной гомогенной фазы и вместе с ней ренатурируют. Ренатурацию осуществляют путем удаления средства денатурации, например, путем фильтрации. В общем для ренатурации пригодны разные физические, химические или биологические методы. Полученный в результате ренатурации комплекс представляет собой пригодный для образования кости активный комплекс.

Пример 2
К 10 кг биологического материала, например соединительной ткани, добавляют 80 л водного раствора низкомолекулярного средства денатурации, например шестимолярной мочевины, и размешивают при комнатной температуре в течение 72 часов.

Растворенные доли отделяют от нерастворимого остатка посредством пригодного метода, например центрифугирования, и денатурированную надосадочную жидкость разделяют, например, в объемном соотношении 1:1. В первой части повышают долю низкомолекулярных активных фракций до желаемой молекулярной массы, представляющей собой, например, 30000 дальтон, и удаляют высокомолекулярную долю, например, путем фильтрации посредством пригодного ультрафильтра с использованием содержащего полые волокна фильтровального патрона.

Концентрированную таким образом, отделенную фракцию активных веществ затем не подвергают дальнейшей переработке с целью выделения активного вещества, как это делают в известном способе, а ее объединяют с другой частью денатурированной надосадочной жидкости и подают на ренатурацию в присутствии высокомолекулярного субстрата. Ренатурацию осуществляют путем удаления средства денатурации, например мочевины. При этом в результате объединения субстрата с активными веществами образуется активный комплекс, причем ренатурация субстрата содействует ренатурации активных веществ. Путем повторения цикла денатурации и ренатурации субстрат можно насыщать активными веществами до получения оптимального в отношении биологического действия активного комплекса. Для очистки активного комплекса его можно подвергать лиофилизации.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить точно заданные активные комплексы в разных целях, причем получаемый активный комплекс обладает, например, структурными, хемотактическими, адгезионными, полиферирующими или дифференцирующими свойствами.

Другие свойства могут относиться, например, к иммуногенности или токсичности, и ими можно точно управлять при осуществлении предлагаемого способа.

Другими областями применения получаемых согласно предлагаемому способу активных комплексов являются повышение биологической совместимости или обеспечение определенного взаимодействия с клетками. Например, при выращивании клеток для их применения в биоинженерии или в исследованиях важную роль играет нанесение слоя таких активных комплексов. Получаемый активный комплекс можно также применять в диагностических или терапевтических системах, например вне тела в диализаторах или оксигенаторах, а внутри тела в искусственных органах.

Изобретение относится к технологии получения активных комплексов биологического назначения. В результате осуществления изобретения увеличиваются возможности и диапазон действия активного комплекса биологического назначения. Комбинируют по меньшей мере два компонента из тканей животного и/или человеческого происхождения. Осуществляют их денатурацию преимущественно мочевиной с получением гомогенной фазы. Эту фазу разделяют на две части. Из одной части выделяют заданный компонент. Его объединяют с остальной частью. Проводят ренатурацию. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения активного комплекса биологического назначения путем комбинации по меньшей мере двух компонентов из тканей животного и/или человеческого происхождения и выделения получаемого комплекса, отличающийся тем, что перед выделением осуществляют денатурацию, получаемую при этом гомогенную фазу разделяют на две части, по меньшей мере из одной части выделяют один заданный компонент, который объединяют с остальной частью гомогенной фазы с последующей ренатурацией. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию каждого заданного компонента в одной части гомогенной фазы снижают или повышают или заданный компонент выделяют из данной части гомогенной фазы. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что концентрацию каждого заданного компонента в одной части гомогенной фазы снижают или повышают или заданный компонент выделяют из данной части гомогенной фазы и объединяют с другой частью гомогенной фазы. 4. Способ по одному из пп.1 - 3, отличающийся тем, что осуществляют обратимую денатурацию. 5. Способ по одному из пп.1 - 4, отличающийся тем, что для денатурации используют мочевину.