БИОЛОГИЧЕСКИЙ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ОРГАНОГЕНЕЗА Российский патент 1997 года по МПК A61L27/00 

Изобретение относится к активным комплексам биологического назначения, в частности к активному комплексу биологического назначения, пригодному для использования получения биологических единиц, преимущественно органов живых организмов.

Известен активный комплекс биологического назначения, включающий компонент структуры, представляющий собой поддающийся биологическому разложению полимер, компонент активации и формирования, представляющий собой хемотактическое вещество, и компонент роста (см. заявку GB N 2215209 A, м.кл. A 61 L 27/00, 1989 г.).

Известный активный комплекс служит для устранения биологических дефектов, в частности для образования костей и хрящей.

Задачей изобретения является развитие активного комплекса, пригодного для получения любых предопределяемых биологических единиц, преимущественно органов живых организмов.

Указанная задача решается в предлагаемом активном комплексе, включающем компонент структуры по меньшей мере один компонент активации и формирования и по меньшей мере один компонент роста и матурации, за счет того, что он дополнительно содержит по меньшей мере один компонент адгезии, причем компонент структуры выполнен в виде геля и/или сетчатой структуры.

Гель, в частности, представляет собой макромолекулярную трехмерную матрицу. Сетчатая структура предпочтительно выполнена из протеогликанов и/или коллагена и/или эластина.

Дальнейшие признаки изобретения поясняются в нижеследующем и приведены в подпунктах формулы изобретения.

Предлагаемый активный комплекс взаимодействует с клетками и возбуждает их к образованию биологической единицы. Для этого активный комплекс (имплантат) получают вне тела живого организма, что возможно также в промышленном масштабе, например, в рамках серийного производства, а затем его приводят в контакт с клетками, которыми образуется желаемая биологическая единица, а именно в пригодном месте, где размещен активный комплекс, или в самом теле живого организма, или же вне тела, например, в культуре клеток. При этом предлагаемый активный комплекс в желаемом месте образования биологической единицы приводят в контакт с массой живучих, работоспособных и специфических клеток. Как известно, биологические единицы обычно состоят из специфических клеток и образуемого клетками внеклеточного материала, однако лишь сами клетки проявляют собственную метаболическую активность. Так как предлагаемый активный комплекс предоставляет все сигналы, необходимые для производства биологической единицы, изобретение делает возможными собирание и связывание необходимых для этого клеток с желаемой геометрией в месте наличия активного комплекса, их размножение и матурацию в зависимости от того, какие функции они должны выполнять. Благодаря тому, что активный комплекс содержит пригодный компонент для каждой отдельной стадии образования биологических единиц, обеспечивается их получение в целом.

Кроме того, с помощью предлагаемого активного комплекса собственные клетки тела можно использовать для получения биологической единицы, так что отпадают известные проблемы, связанные с обычными трансплантациями. В частности, предотвращается опасность передачи болезней, а также отпадает необходимость долговременного подавления иммунной реакции, имеющей тяжелые побочные последствия, и живой организм сам остается генетически однородным.

Для выполнения своих функций биологические единицы нуждаются в определенном пространстве. Нередко выполнение их функций связано с определенной геометрией, и биологические единицы имеют определенные пределы, в которых они выполняют свои функции. Это тем же образом относится и к биологическим единицам, получаемым с помощью активного комплекса согласно основному пункту формулы изобретения. Используемый для получения биологических единиц активный комплекс выполняет данную функцию с помощью компонента структуры, с одной стороны, имеющего занимающую место функцию, и с другой стороны, позволяющего предопределение геометрической формы, в пределах которой образуемая биологическая единица выполняет свои функции.

Компонент структуры приспосабливают к требованиям получаемой биологической единицы, т.к. имеется определенная специфичность между клеточными и внеклеточными компонентами биологических единиц. Поэтому источниками для получения компонента структуры являются в основном внеклеточные материалы разных тканей и органов, т.е. для образования, например, кожи, для получения компонента структуры используют кожные протеогликаны и волокнообразующие протеины, для получения селезенки - специфические для селезенки протеогликаны и волокнообразующие протеины, для получения костей специфические для костей протеогликаны и волокнообразующие протеины и так далее. Компонент структуры также может содержать металлические, керамические, стекловидные, полимерные или содержащие жиры носители, с помощью которых можно модифицировать геометрические, механические, химические или другие свойства компонента структуры. При этом носитель вместе с компонентом структуры может иметься в компактной или пористой форме, в виде мембраны или мицеллы, в вязкой форме или в жидкой форме, в зависимости от требований получения биологической единицы и ее функций.

Согласно другой предпочтительной форме выполнения предлагаемого активного комплекса последний имеет образующую биологические единицы активность в основном лишь временно, т.е. он выполнен так, что он поддается биологическому разложению в предопределенное время, и полностью исчезает после образования биологической единицы. Скорость разложения активного комплекса при этом можно предопределять путем поперечной сшивки полимерной матрицы разной степени и/или добавления ингибиторов (ферментов) и/или подавляющих иммунную реакцию веществ и/или противовоспалительных веществ. Приведенные ингибиторы могут представлять собой низкомолекулярные соединения, занимающие активный центр разлагающего фермента, или же образователи комплексов, связывающих эссенциальный софактор фермента, или нейтральные антитела. Возможно и другие механизмы ингибирования.

В качестве противовоспалительных и/или подавляющих иммунную реакцию добавок можно использовать, например, ингибиторы фосфолипазы, как, например, стероиды, ингибиторы циклооксигеназы как, например, индометацин, ингибиторы липоксигеназы, как, например, нордигидрогваретовую кислоту, подавляющие иммунную реакцию вещества типа циклоспоринов и/или типа антитимоцитного глобулина и т.д.

В рамках указанной задачи получения биологоических единиц необходимо собирать живые клетки желаемого типа в области компонента структуры. Для этого компонент структуры активного комплекса содержит один или несколько компонентов активации и формирования, с помощью которых желаемые клетки возбуждаются к направленному движению. В качестве компонента активации и формирования годятся хемотактические вещества (хемотаксины). Пригодные в конкретном случае хемотактические вещества известны для множества клеток, и их можно выделять из человеческих) животных, растительных или микроорганических источников, или же получать путем химического синтеза или с помощью биотехнических методов. При введении в организм получаемого вне тела живого организма компонента структуры вместе с его компонентом (или компонентами) активации и формирования и/или его приведении в контакт с целевыми клетками вне тела данный, компонент создает градиент концентрации, в котором ориентируются целевые клетки, причем соответствующий компонент активации и формирования взаимодействует со специфическими опознавательными структурами на целевых клетках, называемыми также рецепторами. В том случае, если получаемая биологическая единица включает несколько видов клеток, то компонент структуры содержит несколько компонентов активации и формирования в виде хемотаткических веществ, число которых соответствует числу видов клеток.

Специфичность соответствующего компонента активации и формирования к разным целевым клеткам и степень хемотактической активности определяют путем исследований, в рамках которых измеряют направленное перемещение желаемых клеток под воздействием градиента хемотактического вещества через определенные фильтр-поры в закрытой камере. С помощью таких методов исследования активный комплекс можно нормировать в биологическом отношении относительно соответствующего компонента активации и формирования, что имеет важное значение для получения активного комплекса в промышленном масштабе.

D rfxcndttvjnfrnbxtcrb\ dtotcnd cke;fn, например, пептиды как, например, никотинамид-флавин-метионин-лейцин-фенилаланин и/или метаболиты арахидоновой кислоты как, например, лейкотриены, с помощью которых можно привлекать определенные клетки из крови или фагоциты. Протеины как, например, привлекающий мезенхимовые клетки протеин, имеют хемотактическое действие, в частности, на клетки соединительной ткани.

Кроме специфичности соответствующего компонента активации и формирования в отношении желаемых целевых соединений и степени хемотактической активности и период образования и сохранения хемотактического градиента концентрации является важной величиной. В предлагаемом активном комплексе приспосабливание данной кинетики к требованиям получения биологических единиц достигается за счет управляемого освобождения соответствующего компонента активации и формирования из компонента структуры. При этом роль играет скорость разложения самого компонента структуры, а также вид связи между компонентом структуры и соответствующим компонентом активации и формирования, например, вопрос о том, является ли эта связь ковалентной или ассоциативной связью. В случае ковалентной связи достигаются более медленное образование и более длительное сохранение хемотактического градиента, чем в случае лишь ассоциативной связи, за счет ионных сил или водородной связи. Однако активация клеток для получения биологической единицы чаще всего осуществляется быстрее, чем разложение компонента структуры, т.к. иммигрировавшие клетки в значительной степени способствуют разложению протеогликана и коллагена.

Для образования биологических единиц, после иммиграции клеток в компонент структуры, клетки должны фиксироваться в месте компонента структуры с тем, чтобы препятствовать их эмиграции в окружающие зоны и обеспечить стабильную архитектуру получаемой биологической единицы. Для этого активный комплекс содержит один или несколько компонентов адгезии, с помощью которых иммигрировавшие клетки фиксируются в месте компонента структуры. При этом компонент адгезии прикрепляется, с одной стороны, к образующим биологическую единицу клеткам, а с другой стороны к макромолекулярной сетчатой структуре компонента структуры. Такие способствующие адгезии вещества известны, и они обладают определенной специфичностью прикрепления. В качестве примеров можно называть белки типа фибронектина или ламинина, с помощью которых к компоненту структуры можно прикреплять, например, клетки соединительной ткани или эпителиальные клетки. Имеется еще множество других факторов адгезии разной специфичностью, которые используют в предлагаемом активном комплексе в зависимости от получаемой биологической единицы. К ним относятся, например, молекулы адгезии кеток L-GAM, N-CAM, молекулы адгезии матрицы цитотактин, тенасцин, ламинин, фибронектин, коллаген типов IV, V, VII, и синтетические пептиды, представляющие собой участки последовательности разных факторов адгезии, и белки трансмембранного соединения, как, например, интегрин.

Для повышения специфичности прикрепления желаемых клеток к компоненту структуры при получении биологических единиц можно использовать антитела против нежелаемых компонентов адгезии. Биологическую активность компонентов адгезии можно определять в исследованиях по адгезии разного типа (например, с помощью центробежных сил и т.п.), и таким образом ее можно нормировать для всего активного комплекса.

Часто количество клеток, хемотактически привлекаемых в зону компонента структуры для получения биологической единицы и фиксируемых с помощью пригодных способствующих адгезии веществ, недостаточно для образования биологической единицы. Кроме того, имеющиеся в одном организме для осуществления такого процесса мобильные клетки чаще всего не имеются в достаточно зрелом состоянии для выполнения всех функций биологической единицы. Часто они представляют собой исходные клетки, из которых лишь должны образоваться работоспособные, зрелые клетки получаемой биологической единицы. Для этого предлагаемый активный комплекс содержит по меньшей мере один компонент роста и/или матурации, предпочтительно в виде одного или несколько цитокинов, под воздействием которых число имигрировавших клеток увеличивается, и происходит матурация клеток.

Цитокины представляют собой вещества с разной химической структурой, которые отличаются тем, что они взаимодействуют с клетками и влияют на их поведение размножения и роста, а также на их матурацию и производительность при биосинтезе. То есть, цитокины проявляют подобное гормонам действие, но в отличие от последних их действие является не дистанционным, а, скорее, локальным, что имеет преимущества при получении биологических единиц, т.к. и здесь речь идет о локальном процессе.

Специалисту известно множество разных цитокинов с разной специфичностью. Их можно использовать в качестве дальнейшего компонента активного комплекса, служащего для влияния на рост клеток, их дифференциацию и матурацию, а также для влияния на обмен веществ иммигрировавших клеток. Специфичность цитокинов относительно определенных клеток определяется наличием соответствующих рецепторов на целевых клетках, причем взаимодействие цитокина с рецептором вызывает последующие процессы в клетке. Данные рецепторы на целевых клетках представляют собой мембранные белки, взаимодействующие с используемым хемотактическим веществом, связывающие его и вводящие его в клетку. За счет повторного использования они все заново могут связывать хемотактическое вещество.

Аналогичное поведение показывают рецепторы для используемых в конкретном случае цитокинов, так что отличается лишь специфичность при аналогичном механизме взаимодействия. В то время как связывание хемотактического вещества приводит к направленному движению целевых клеток, связывание цитокинов к рецептору целевой клетки приводит к их росту и/или дифференциации. Во многих случаях структура рецепторов еще неизвестна, так что их можно узнавать лишь по специфичности к соответствующему лиганду (хемотактическому веществу, цитокину и т.д.).

При этом необходимо учитывать, что нередко в зависимости от специфичности используемого цитокина и целевой клетки могут вызываться у клеток стимулирующие или тормозящие процессы. Желаемый для получения биологических единиц процесс, вызываемый воздействием цитокина на клетки, чаще всего связан с двойственной передачей сигналов, так что предлагаемый активный комплекс предпочтительно содержит два цитокина для достижения роста и дифференциации. Многие клетки после взаимодействия с цитокином сами образуют и освобождают дальнейшие цитокины, причем они могут стимулировать или тормозить сам себя. Нередко при отдельных шагах дифференциации специфичность клеток к определенным цитокинам изменяется, или последствие взаимодействия может изменяться со стимулирующего процесса в клетке в тормозящий процесс. Свойства большого числа цитокинов известны, так что действие цитокинов в активном комплексе также поддается нормированию.

В качестве примеров для цитокинов можно называть, например, для получения крови стимулирующие колонию факторы, для получения соединительной ткани
фактор роста фибробластов, для получения кожи эпидермальный фактор роста, для получения хрящей индуцирующий хрящи фактор, для получения селезенки или лимфатических узлов активирующий лимфоциты фактор и пептиды селезенки, для получения тимуса фактор роста Т-клеток и пептиды тимуса, для получения костей фактор роста костей и трансформирующий фактор роста, а для получения кровеносных сосудов фактор ангиогенеза. Кроме того, используются еще следующие цитокины: интерлейкины, подобные инсулину факторы роста, опухолево-некрозный фактор, простагландины, лейкотриены, трансформирующие факторы роста, производимый от тромбоцитов фактор роста, интерфероны и производимый от клеток эндотелия фактор роста.

Так как биологические единицы часто содержат несколько видов клеток, могут иметься и комбинации. Так, например, для обеспечения биологической единицы всем необходимым важно образование кровеносных сосудов, так что для ускоренного образования данных сосудов активный комплекс может дополнительно содержать фактор ангиогенеза в качестве цитокинового компонента. Аналогично ускоренное образование нервных связей может иметь важное значение, что можно обеспечивать добавлением к активному комплексу соответствующих дополнительных цитокинов.

Принципиальная структура предлагаемого активного комплекса для получения биологических единиц в значительно упрощенном виде представлен на приложенном чертеже. При этом сплошными линиями показана сетчатая структура волокнообразующих протеинов, вместе с изображенным в виде точек протеогликаневым гелем образующет компонент структуры предлагаемого активного комплекса. Треугольники символически обозначают компонент активации и формирования в виде хемотактического вещества, которое, как указывают две стрелки, частично выходит из активного комплекса. Крючкообразные символы стоят за компонент адгезии, а С-образные символи за компонент роста и матурации (цитокины), служащий для образования биологической единицы желаемыми целевыми клетками и для обеспечения ускоренного образования кровеносных сосудов и нервных связей.

В нижеследующем изобретение подробнее поясняется с помощью двух примеров его выполнения.

Пример 1. Получение кожи в качестве биологической единицы (органогенез кожи).

Кожу человеческого или животного происхождения механически освобождают от эпидермальных компонентов. Получаемую собственно кожу обезжируют в шестикратном по объему количестве смеси хлороформа и метанола в соотношении 1 1, замораживают в жидком азоте и измельчают в морозильной мельнице до получения частиц величиной 400 1000 мкм. Затем кожные частицы при охлаждении сушат в высоком вакууме (0,05 торр), суспендируют в 4 М водном растворе хлорида гуанидиния и размешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Нерастворимые компоненты удаляют, и растворимую долю исчерпывающе диализуют водой. Осажденную макромолекулярную сетчатую структуру протеогликанов и коллагена кожи промывают и при охлаждении сушат в высоком вакууме. Получаемый холст представляет собой предлагаемый компонент структуры активного комплекса для вызова органогенеза кожи, в который затем вносят компонент адгезии, хемотактический компонент (компонент активации и формирования) и компонент роста и матурации (цитокины). В качестве компонента адгезии для органогенеза кожи в компонент структуры вводят фибронектин, а именно, путем осаждения, например этиловым спиртом, из водного раствора в присутствии компонента структуры, или путем совместной лиофилизации. Одновременно таким же методом в компонент структуры вводят и другие компоненты. Для органогенеза кожи при этом используют фактор роста фибробластов, а также эпидермальный фактор роста с тем, чтобы облегчить рост эпидерма. В случае получения кожи на поверхность наносят дополнительный фактор адгезии с тем, чтобы облегчить прикрепление клеток эпителия. Для этого используют ламинин, специфически обеспечивающий прикрепление клеток эпителия. Получаемый таким образом активный комплекс вместе с подавляющим иммунную реакцию веществом используют для ограногенеза кожи, например, для регенерации дефектов кожи.

Пример 2. Получение костей в качестве биологической единицы (органогенез костей).

Кости человеческого или животного происхождения освобождают от мягкой ткани, кондилы отделяют, диафизу кости разрезают в продольном направлении и удаляют костный мозг. Получаемые участки кости обезжируют в шестикратном по объему количестве смеси хлороформа и метанола в соотношении 1 1, замораживают в жидком азоте и измельчают в морозильной мельнице до получения частиц величиной 400 1000 мкм. Затем с помощью 0,5 N соляной кислоты из костных частиц удаляют минеральные вещества, водой промывают до нейтральности и при охлаждении сушат в высоком вакууме.

Получаемые костные частицы суспендируют в 4 М водном растворе хлорида гуанидиния и размешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Нерастворимые компоненты удаляют, и растворимую долю исчерпывающе диализуют водой. Осажденную макромолекулярную сетчатую структуру протеогликанов и коллагена кости промывают и сушат в высоком вакууме. Получаемый холст представляет собой предлагаемый компонент структуры активного комплекса для вызова органогенеза кости, в который затем вносят компонент адгезии, компонент активации и формирования и компонент роста и матурации (цитокины).

В качестве компонента адгезии служит способствующее адгезии вещество, получаемое из растворенной в хлориде гуанидиния фракции. Данное вещество обеспечивает прикрепление остеобластов и их исходных клеток к компоненту структуры. Компонент активации и формирования представляет собой протеин, также выделяемый из кости, причем активный компонент определяют путем исследований по Бойдену и Каммеру. Компонент адгезии и компонент активации и формирования вместе с компонентом структуры образуют комплекс, обеспечивающий активацию и прикрепление образующих кость клеток. Комплекс получают путем осаждения или лиофилизации компонентов.

Для двойственной передачи сигнала роста и матурации в активный комплекс вводят основной фактор роста фибробластов и трансформирующий бета-фактор роста. С целью усиления эффекта к активному комплексу можно добавлять антитело против катаболических цитокинов, например, кахексии. Концентрация цитокинов в активном комплексе находится, например, в порядке 10 частей на миллион.

Объектом изобретения является активный комплекс, включающий компонент структуры по меньшей мере один компонент активации и формирования и по меньшей мере один компонент роста и матурации, отличительная особенность которого заключается в том, что для получения биологических единиц, в частности органов живых организмов, он дополнительно содержит по меньшей мере один компонент адгезии, причем компонент структуры выполнен в виде геля и/или сетчатой структуры. Биологический активный комплекс может быть использован для органогенеза, 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Биологический активный комплекс для органогенеза, содержащий структурный компонент, представляющий собой трехмерную матрицу, компонент роста, представляющий собой фактор, стимулирующий рост клеточной колонии, адгезивный компонент белковой природы, отличающийся тем, что он дополнительно содержит компонент активации и формирования, относящийся к группе хемотаксических пептидов или метаболитов арахидоновой кислоты, при этом компоненты взяты в физиологически приемлемых соотношениях. 2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что структурный компонент содержит металлические, и/или керамические, и/или стекловидные, и/или полимерные, и/или жиросодержащие носители в компактной и/или пористой форме, в виде мембраны и/или мицеллы, в деформируемой и/или вязкой, и/или жидкой форме. 3. Комплекс по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что адгезивный компонент представляет собой протеин типа фибронектина, тенасцина, цитотактина, ламинина, хондонектина, коллагена типов IV, V, VII, N-САМ, L-САМ или интегрина, или комбинацию указанных протеинов. 4. Комплекс по меньшей мере по одному из пп. 1 3, отличающийся тем, что компонент роста содержит факторы, способствующие ускоренному образованию в получаемом органе кровеносных сосудов, такие как, например, факторы ангиогенеза, и/или нервов, такие как, например, факторы роста нервов.