ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК A61K48/00 C12N5/10 C12N15/63 

Изобретение относится к клеткам для применения в генной терапии, получаемым путем
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.

Введение трансфецированных ин витро соматических клеток, трансдуцированных для экспрессии биологически активного вещества, представляет собой в настоящее время широко используемый в клинической практике, а также для клинического исследования метод генной терапии. При этом используют различные клетки, включая фибробласты, лимфоциты, кератиноциты и опухолевые клетки.

Эндотелиальные клетки для этой цели впервые использовали в 1989 г. Для этого эндотелиальные клетки трансфецировали ин витро с помощью ретровирусного вектора (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989)) для экспрессии биологически активного вещества.

Такого рода трансдуцированные эндотелиальные клетки, приросшие ин витро к искусственным кровеносным сосудам из синтетического материала, после трансплантации ин виво этих искусственных кровеносных сосудов способны экспрессировать трансген (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989); Wilson и др., Science, 244, 1344 (1989)). Вследствие этого Zwiebel и Wilson предложили для целей генной терапии вводить пациентам трансдуцированные эндотелиальные клетки, сросшиеся с синтетическим материалом или коллагеновым носителем. Это предложение экспериментально осуществили Nathan и др. (PNAS USA, 92, 8130 (1995)).

В продолжение этого предложения Nabel и др. (Science, 244, 1342 (1989)) впервые изложили возможность введения суспензии трансдуцированных эндотелиальных клеток в кровоток в качестве генной терапии. Авторами показано, что эндотелиальные клетки, которые получены из сосудов живого млекопитающего путем соскабливания и трансдуцированы ин витро для экспрессии репортер-гена, после локального введения, например в кровеносные сосуды, срастаются там с местами повреждения эндотелиальных клеток и экспрессируют репортер-ген. На основании этих результатов авторами описана возможность введения генетически модифицированных эндотелиальных клеток в целях генной терапии, причем биологически активные вещества этими эндотелиальными клетками непосредственно выделяются в систему кровообращения в целях лечения системных или наследственных заболеваний. Эта идея далее была развита Bernstein и др. (FASEB. J. , 4, 2665 (1990)). Эндотелиальные клетки легких трансфецируют ин витро с помощью плазмид для экспрессии биологически активного вещества и затем вводят путем инъекции "голым" мышам внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно или в капсулу почки. У таким образом обработанных животных локально (в кистах почек) или в крови (после введения внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно) обнаруживают продуцируемое трансплантатами эндотелиальных клеток биологически активное вещество, что доказывает пригодность введения ин виво трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в целях генной терапии.

Далее, Zwiebel и др., 1992 (международная заявка с номером публикации 93/13807), и Ojeif о и др., (Cancer Res., 55, 2240 (1995)) на различных примерах показали возможность использования метода введения трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в систему кровообращения для целей генной терапии.

Zwiebel и др. (1992) трансдуцировали ин витро человеческие эндотелиальные клетки пуповины и эндотелиальные клетки из жировой ткани крыс с помощью ретровирусного вектора для экспрессии биологически активного вещества и инъецировали эти эндотелиальные клетки внутривенно животным, у которых сначала за счет инъекции облученных, выделяющих FGF клеток были вызваны локальное повреждение сосудов и ангиогенез. Они показали, что инъецированные эндотелиальные клетки локализуются в месте поражения сосуда и ангиогенеза и там экспрессируют биологически активное вещество. На этом основании авторы в своей заявке на патент описывают применение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток для экспрессии аденозиндезаминазы, факторов свертывания крови, гематопоэтических факторов роста, цитокинов, антитромботических средств, ингибиторов ферментов и гормонов.

Параллельно этим работам другими авторами усовершенствована технология выделения эндотелиальных клеток и также подробнее исследовано миграционное поведение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток.

Так, Messina и др. (PNAS USA, 89, 12018 (1992)) показали, что трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки после инъекции в систему кровообращения прикрепляются к интактному слою эндотелиальных клеток, а также могут интегрировать в него. Следовательно, с помощью этих результатов можно исключить исключительную локализацию интраваскулярно введенных эндотелиальных клеток в зонах с повреждениями сосудов и ангиогенеза. С другой стороны, показано, что инъецированные в смеси с опухолевыми клетками, трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки участвуют в ангиогенезе ложа опухолевых сосудов (Lal и др., PNAS USA, 9, 9695 (1994); Nam и др., Brain Res., 731, 161 (1996)). Этим обусловлено то, что опухолевые клетки, трансплантированные в смеси с эндотелиальными клетками, показывают ин виво отчетливое преимущество роста (Stopeck и др., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 265 (1997)).

С другой стороны, трансдуцированные эндотелиальные клетки, введенные локально, например в головной мозг или в опухоль мозга, за счет экспрессии кодируемого трансгеном биологически активного вещества могут быть фармакологически активны, соответственно, противоопухолево эффективны (Nam и др., Brain Res. , 731, 161 (1996); Quinonero и др., Gene Ther., 4, 111 (1997)). Например, Robertson и др. (Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 382 (1997)) использовали человеческие эндотелиальные клетки (HUVEC), трансдуцированные ин витро с помощью AV-вектора, для экспрессии тимидинкиназы герпесвируса, в смеси с человеческими клетками рака яичника. После введения ганцикловира, который активируется в опухоли благодаря тимидинкиназе герпесвируса в цитостатическое средство, авторы наблюдали отчетливую регрессию опухоли у "голых" мышей.

Применение эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии до сих пор, однако, в значительной мере ограничено двумя существенными областями проблем.

- Получение пригодных эндотелиальных клеток в достаточном количестве до сих пор оказывается крайне затруднительным. Аллогенные эндотелиальные клетки, правда, можно получать относительно просто из пуповины или из клеточных культур, однако, за счет их иммуногенности в реципиенте они применимы только ограниченно; во-вторых, их размножение в клеточной культуре возможно только в ограниченной мере. Аутоэндотелиальные клетки, правда, можно получать, например, механически путем "выскабливания" варикозно расширенных вен или из жировых тканей. Этот вид получения, однако, возможен не в случае всех пациентов и к тому же наносит значительный вред пациенту. Поэтому альтернативно можно получать ангиобласты или клетки-предшественники эндотелиальных клеток из периферической крови (Asahara и др., Science, 275, 964 (1997)). Необходимое для этой цели взятие крови, правда, для пациента немного обременительно, однако, выделение предполагаемых ангиобластов из мононуклеарных клеток крови и дифференциация этих ангиобластов в эндотелиальных клетках является очень дорогостоящей операцией. Так, мононуклеарные, из лейкоцитов крови (выделяют путем центрифугирования с градиентом плотности), CD34⁺ или Flk-1⁺ мононуклеарные клетки крови, которые имеются в крови только в незначительной концентрации (≤0,1%), обогащают путем иммуноадсорбции на связанных с носителем моноклональных антителах (специфических к CD34 или Flk-1). Затем эти клетки в чашках для культуры тканей, покрытых коллагеном типа 1 или фибронектином, инкубируют в течение примерно четырех недель в культуральной среде, содержащей головной мозг крупного рогатого скота, для дифференции в эндотелиальных клетках, а также для размножения. Размножение этих клеток, однако, возможно только очень ограниченно. Далее, инкубация эндотелиальных клеток с веществом головного мозга, например с головным мозгом крупного рогатого скота, вызывает значительные проблемы безопасности.

- Миграция эндотелиальных клеток и селективная экспрессия трансгена в желательной целевой области контролируются в недостаточной степени. После интраваскулярного введения эндотелиальных клеток они (как уже было описано выше) локализуются как в областях ангиогенеза, так и в покоящемся слое эндотелиальных клеток. Далее, неясно, дифференцируются ли обратно ин виво после инъекции снова в клетках-предшественниках эндотелиальные клетки, которые образовались в клеточной культуре из клеток-предшественников, и могут ли они распределяться по всему организму.

С помощью настоящего изобретения теперь решаются обе важные проблемы.

А) Изобретение заключается в
1) улучшенном, то есть простом и надежном способе выделения и культивирования мононуклеарных клеток, в особенности эндотелиальных клеток-предшественников, из крови и других, содержащих клетки жидкостей организма и применении этих клеток для профилактики или лечения заболевания;
2) выборе в специфической к клетке, в особенности специфической к эндотелиальной клетке, в случае необходимости, фармакологически контролируемой трансформации этих клеток, так что с помощью клеточной культуры можно легко получать гораздо большие количества таких клеток;
3) получении клеток, в особенности эндотелиальных клеток, в качестве векторов для эффектор-генов таким образом, что в эти клетки, полученные по пп. 1) или 1) и 2), встроен по крайней мере один эффектор-ген, который за счет выбора пригодных промоторных систем экспрессируется специфически к клетке, в особенности специфически к эндотелиальной клетке, и, в случае необходимости, путем гипоксии специфически к клеточному циклу и/или специфически к вирусу;
4) введении этих, таким образом полученных, генетически измененных клеток, в особенности эндотелиальных клеток, для профилактики или лечения заболевания.

Предметом изобретения поэтому являются клетки для применения в генной терапии, получаемые путем
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.

Ниже описываются остальные объекты изобретения, варианты осуществления изобретения, а также соответствующие примеры.

Получение эндотелиальных клеток
1) Выделение и культивирование клеток-предшественников эндотелиальных клеток
Предлагаемый согласно изобретению способ выделения клеток-предшественников эндотелиальных клеток можно разделить на следующие стадии.

Жидкости организма, содержащие клетки, с помощью известных специалисту инвазивных способов отбирают из соответствующих органов. К этим жидкостям организма, содержащим клетки, относятся, например, кровь, получаемая из вен, капилляров, артерий или пуповины, соответственно, плаценты; суспензии клеток костного мозга; суспензии клеток селезенки; суспензии клеток лимфатических узлов; суспензии перитонеальных клеток; суспензии плевральных клеток; лимфа; жидкость соединительной ткани (выступающая, например, на поверхности механически поврежденного эпидермиса).

Эритроциты, гранулоциты и другие компоненты клеток выделяют из этих жидкостей организма путем центрифугирования с градиентом плотности, а тромбоциты - путем дифференциального центрифугирования соответственно известным специалисту способам.

Таким образом выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки суспендируют в содержащей сыворотку среде для культивирования клеток. Используемая среда для культивирования клеток содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки культивируют в этой среде для культивирования клеток и дифференцируют до клеток, подобных эндотелиальным.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки инкубируют с антителом против типичных моноцитных/макрофаговых поверхностных маркеров (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68), которое связано с покрытой полисахаридом частицей железа, соответственно, оксида железа, промывают и затем таким образом нагруженные клетки получают с помощью магнита. Клетки вносят в среду для культивирования клеток, которая содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста, и далее ин витро размножают и дифференцируют в эндотелиальные клетки. Иммортализацию и/или трансфекцию осуществляют после размножения и/или дифференциации клеток ин витро.

Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения выделенные, содержащие ядро клетки предварительно инкубируют в указанной среде для культивирования клеток в течение более 1 часа для дальнейшей дифференциации и размножения. При этих условиях клетки, распознаваемые как эндотелиальные клетки-предшественники, в возрастающей мере экспрессируют типичные моноцитные/макрофаговые поверхностные маркеры (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68). Эти клетки затем выделяют, например, вместе с антителом, которое направлено против этих моноцитных маркеров (например, CD11, CD14) и которое связано с покрытой декстраном частицей железа, получают с помощью магнита. Клетки размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.

Альтернативно этому из неприлипающих мононуклеарных клеток, как, например, описывается Asahara и др., Sciense, 275, 964 (1997), выделяют CD34-положительные клетки (гематопоэтические стволовые [исходные] клетки) и ин витро размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.

В особом варианте осуществления изобретения выделенные, содержащие ядро клетки суспендируют в среде для культивирования клеток и остающиеся фагоцитирующие клетки (например, моноциты, макрофаги, гранулоциты) удаляют за счет сцепления с поверхностью, соответственно, путем фагоцитоза "нагруженных" протеином, покрытых декстраном частиц железа с помощью магнита и/или путем противоточного центрифугирования, соответственно известным специалисту способам, и содержащие остающиеся CD34-пoлoжитeльныe клетки мононуклеарные клетки культивируют в предлагаемой согласно изобретению среде для культивирования клеток и дифференцируют в подобные эндотелиальным клетки.

Чашки для культивирования клеток могут быть покрыты внеклеточным матричным компонентом (см. Связывающие и матричные факторы, например, фирмы Сигма), как, например, фибронектин. К среде для культивирования клеток добавляют или ганглиозиды, фосфолипиды и/или гликолипиды, и/или предпочтительно согласно настоящему изобретению добавляют факторы роста для эндотелиальных клеток, как, например:
- васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) и/или другие KDR или FLt-лиганды, как
- фибробластовый фактор роста (FGF_α, FGF_β), и/или
- эпидермальный фактор роста (EGF), и/или
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1, IGF-2), и/или
- β-эндотелиальный клеточный фактор роста (ECGF), и/или
- эндотелиальный клеточный фактор связывания (ECAF), и/или
- интерлейкин-3 (IL-3), и/или
- GM-CSF, и/или
- G-CSF, и/или
- интерлейкин-4 (IL-4), и/или
- интерлейкин-1 (IL-1), и/или
- колониестимулируюший фактор (CSF-1), и/или
- интерлейкин-8 (IL-8), и/или
- фактор роста, полученный из тромбоцитов, (PDGF), и/или
- γ-интерферон, и/или
- онкостатин М, и/или
- фактор, подавляющий колониеобразование лейкоцитов (LIF), и/или
- В61, и/или
- тромбоцитарный эндотелиальный клеточный фактор роста (PDEGF), и/или
- фактор стволовых клеток (SCF), и/или
- трансформирующий β-фактор роста TGF-β, и/или
- ангиогенин, и/или
- плейотрофин, и/или
- Fit-3-лиганд (FL), и/или
- Fie-2-лиганды, как, например, ангиопоэтин-1, и/или
- стромальный фактор-1 (SDF-1), и/или
- мидкины.

Развившиеся в течение времени между 6 часами и 8 неделями клетки обрабатывают дальше согласно изобретению.

Таким образом выделенные эндотелиальные клетки можно также непосредственно использовать для стимуляции эндотелизации поврежденных сосудов и для стимуляции ангиогенеза.

2) Выделение эндотелиальных клеток
Альтернативно предлагаемому согласно изобретению способу, представленному в разделе 1), эндотелиальные клетки также можно получать с помощью известных специалисту способов, например, из жировой ткани, путем выскабливания вен или путем отделения от эндотелия пуповины. Их культивирование осуществляют, как уже описано в разделе 1).

3) Иммортализация эндотелиальных клеток
Согласно настоящему изобретению в одну или несколько предлагаемых согласно изобретению неприлипших мононуклеарных клеток или эндотелиальных клеток вводят нуклеотидную последовательность протеина (компонент а), который способствует тому, что эти клетки непрерывно проходят цикл цитокинеза и таким образом становятся нестареющей, "перманентно" делящейся клеточной линией. Такие иммортализирующие нуклеотидные последовательности, соответственно, гены, уже известны. К этим нуклеотидным последовательностям относятся, например, онкогены. Согласно настоящему изобретению онкогены могут быть клеточного или вирусного происхождения. Примеры клеточных онкогенов уже представлены в виде обзора Wynford-Thomas, J. Pathol., 165, 187, (1991); Harrington и др., Curr. Opin. Genet. Developm., 4, 120 (1994); Gonos и др., Anticancer Res., 13, 1117 (1993), и Baserga и др., Cancer Surveys, 16, 201 (1993).

Такого рода онкогены можно вводить в клетку известными специалисту способами. Однако клетки в своем геноме содержат также протоонкогены, которые, согласно настоящему изобретению, можно активировать с помощью известных специалисту способов, то есть превращать в онкогены.

В особом варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин, который инактивирует протеин супрессорного гена.

Примеры супрессорных генов уже представлены в виде обзора Каrр и Broder, Nature Med. , 4, 309 (1995); Skuse и Ludlow, The Lancet, 345, 902 (1995); Duan и др. , Science, 269, 1402 (1995); Huh и др., Cancer Res., 55, 2225 (1995); Knudson, PNAS USA, 90, 10914 (1993).

Примеры гена (компонент а)), кодирующего протеин, который инактивирует продукт экспрессии супрессорного гена, приведены в табл.1.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой мутированную нуклеотидную последовательность протеина регуляции клеточного цикла, который вследствие мутации изменен так, что он может еще полностью активировать клеточный цикл, однако, в этой функции более не является ингибируемым клеточными ингибиторами. Согласно настоящему изобретению сюда относятся мутированные нуклеотидные последовательности, кодирующие циклинзависимые киназы, которые, несмотря на мутацию, сохраняют свою киназную активность, однако теряют способность связываться с клеточными cdk-ингибиторами.

Примерами компонента а) являются следующие:
- cdk-4, мутированный таким образом, что р16, р15 и/или р21 более не могут ингибировать;
-cdk-6, мутированный таким образом, что р15 и/или р18 не могут более ингибировать;
cdk-2, мутированный таким образом, что р21 и/или р27 и/или WAF-1 не могут более ингибировать.

Например, мутация cdk-4 может представлять собой обмен аргинина на цистеин в положении 24, так что этот мутированный cdk-4 обладает киназной активностью, однако более не ингибируется за счет р15 и р16 (Wulfel и др., Science, 269, 1281 (1995)).

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой трансформирующий ген, экспрессия которого регулируется самоусиливающим промоторным элементом, в случае необходимости в сочетании с фармакологически контролируемым промотором (см. по этому поводу раздел Иммортализация).

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения в эндотелиальные клетки, особенно также в клетки-предшественники эндотелиальных клеток или в клетки смеси клеток, которая содержит долю эндотелиальных клеток или клеток-предшественников эндотелиальных клеток или повышенную, по сравнению с кровью, долю положительных клеток CD34, CD11, CD11b, CD14, CD13, CD64 и CD68, вводят нуклеотидную последовательность, которая состоит из специфической к эндотелиальным клеткам промоторной или энхансерной последовательности (компонент б)) и компонента а), причем транскрипцию компонента а) активируют за счет связывания факторов транскрипции эндотелиальной клетки с компонентом б).

Для лучшего удерживания продукта экспрессии компонента а) в клеточном ядре к компоненту а) можно присоединять нуклеарный сигнал локализации (компонент в)). Достигаемое в результате этого расположение компонентов представлено, например, на чертеже.

За счет введения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей представленные на чертеже компоненты, только эндотелиальные клетки и предшественники эндотелиальных клеток, которые содержатся в гетерогенной смеси клеток, переводят в иммортализованную стадию, то есть в непрерывно делящиеся клетки, так что спустя несколько дней эти эндотелиальные клетки по количеству преобладают в клеточной культуре и спустя зависимое от условий культивирования, однако, обозримое время находятся исключительно в клеточной культуре.

С помощью этих предлагаемых согласно изобретению конструкций нуклеиновой кислоты и способа, таким образом, за относительно короткое время при небольших затратах и также из небольшого количества эндотелиальных клеток или из небольшого количества клеток-предшественников эндотелиальных клеток, а также в случае, когда они находятся в виде гетерогенной смеси клеток, можно получать большие количества единообразных эндотелиальных клеток для профилактики или лечения.

Получение ген-модифицированных эндотелиальных клеток для профилактики и/или лечения
Согласно изобретению в полученные по любому из предлагаемых в изобретении способов эндотелиальные клетки нужно вводить конструкцию нуклеиновой кислоты, которая по крайней мере содержит следующие компоненты:
- промотор (компонент г));
- структурный, ген, кодирующий биологически активное вещество, или фермент (компонент д)).

Выбор промоторных последовательностей
Согласно изобретению в качестве промоторных последовательностей нужно использовать нуклеотидные последовательности, которые после связывания факторов транскрипции активируют транскрипцию расположенного вблизи 3'-конца трансгена, как, например, структурного гена. Согласно изобретению в эндотелиальную клетку вводят по крайней мере одну специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность (компонент б)) и/или компонент г). Эту специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность можно сочетать по крайней мере с одной другой промоторной последовательностью. Выбор сочетаемой со специфическим к эндотелиальной клетке промотором промоторной последовательности (последовательностей) осуществляют в зависимости от излечиваемого заболевания. Так, дополнительная промоторная последовательность может быть неограниченно, специфически к эндотелиальной клетке и при определенных метаболических условиях индуцируема, как, например, путем гипоксии, или индуцируема или "выключаема" с помощью фармакона, активируема специфически к вирусу и/или специфически к клеточному циклу. Такого рода промоторы уже указаны в следующих заявках на патенты: заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6; 96110962.2; 97101507.8; 97102547.3; 97110995.8; а также заявки на патент ФРГ NoNo 1970430.1 и 19710643.9. Эти заявки на патент включены в настоящее описание в виде ссылки. К выбираемым промоторным последовательностям, например, относятся следующие.

1) Неограниченно активируемые промоторы и активаторные последовательности, как, например, промотор РНК-полимеразы III; промотор РНК-полимеразы II; промотор и энхансер вируса огуречной мозаики (CMV); промотор вируса дикого типа 40 (SV40-промотор).

2) Метаболически активируемые промоторные и энхансерные последовательности, как, например, индуцируемый путем гипоксии энхансер (Semenza и др., PNAS, 88, 5680 (1991); McBurney и др., Nucl. Acids Res., 19, 5755 (1991)).

3) Активируемые специфически к клетке промоторы.

Таковыми являются, например, промотор cdc258-гена, cdc25C-гена, циклин-А-гена, cdс2-гена, B-myb-гена, DHFR-гена, F2F-1-гена или, однако, связывающие последовательности образующихся во время пролиферации клеток или активированных факторов транскрипции. К этим связывающим последовательностям относятся, например, связывающие последовательности с-mус-протеинов. К этим связывающим последовательностям нужно причислить мономеры или мультимеры обозначаемой как Мус Е-Box нуклеотидной последовательности:
5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (последовательность No 2) (Blackwood и Eisenmann, Science, 251, 1211 (1991)).

4) Самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы.

В простейшем случае при сочетании одинаковых или разных промоторов один промотор может быть индуцируемым, например, в форме активируемого, соответственно, "выключаемого" тетрациклином промотора, в форме тетрациклинового оператора в сочетании с соответствующим репрессором.

Согласно изобретению, однако, промотор может быть также самоусиливающим с или также без фармакологически контролируемой промоторной единицы.

Такого рода самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19651443.6, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

5) Активируемые специфически к эндотелиальным клеткам промоторы.

К ним относятся промоторы или активаторные последовательности из промоторов или энхансеров таких генов, которые кодируют протеины, предпочтительно образующиеся в эндотелиальных клетках.

Согласно изобретению нужно использовать, например, промоторы генов следующих протеинов:
- специфический к головному мозгу, эндотелиальный глюкоза-1-транспортер;
- эндоглин;
- VEGF-рецептор-1 (flt-1);
- VEGF-рецептор-2 (flk-1, KDR);
- tie-1 или tie-2;
- В61-рецептор (Eck-рецептор);
- B61;
- эндотелии, особенно эндотелин-В или эндотелин-1;
- рецепторы эндотелина, в особенности рецептор эндотелина-В;
- манноза-6-фосфатные рецепторы;
- фактор Виллебранда;
- интерлейкин-1α, интерлейкин-1β;
- рецептор интерлейкина-1;
- фактор васкулярной клеточной адгезии (VCAM-1);
- фактор межклеточной адгезии (ICAM-3);
- синтетические активаторные последовательности.

В качестве альтернативы природным, специфическим к эндотелиальным клеткам промоторам можно использовать также синтетические активаторные последовательности, которые состоят из олигомеризованных мест связывания факторов транскрипции, предпочтительно или селективно активных в эндотелиальных клетках. Примером их является фактор транскрипции GATA-2, местом связывания которого в эндотелин-1-гене является 5'-ТТАТСТ-3' (Lee и др., Biol. Chem. , 16188 (1991); Dormann и др., J. Biol. Chem., 1279 (1992), и Wilson и др., Mol. Cell Biol., 4854 (1990)).

Сочетание одинаковых или разных промоторов
Сочетание одинаковых промоторов осуществляют, например, путем последовательного соединения нескольких промоторов в направлении считывания от 5' к 3' нуклеотидной последовательности.

Для сочетания одинаковых или разных промоторов, однако, предпочтительно используют технологии, которые уже подробно описаны в следующих заявках на патенты: заявка на патент Великобритании 9417366.3; заявка на европейский патент 97101507.8; заявка на европейский патент 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo19710643.9; 19617851.7; 19639103.2 и 19651443.6. Эти заявки на патенты включены в настоящее описание в виде ссылки. Примерами такого рода технологий являются следующие.

1) Химерные промоторы
Химерный промотор представляет собой сочетание расположенной выше, активируемой специфически к клетке, метаболически или специфически к вирусу активаторной последовательности с расположенным ниже промоторным модулем, который содержит нукдеотидную последовательность CDE-CHR или E2FBS-CHR, с которой связываются супрессорные протеины, которые благодаря этому могут ингибировать активацию последовательности, расположенной выше активаторной, в G₀- и G₁-фазе клеточного цикла (заявка на патент Великобритании 9417366.3; Lucibello и др., EMBO J., 12 (1994)).

Продолжающиеся исследования действия, в особенности промоторного элемента CDE-CHR, показывают, что зависимая от клеточного цикла благодаря CDE-CHR-элементу регуляция последовательности, расположенной выше активаторной, в значительной степени зависит от того, что активаторная последовательность факторов транскрипции активируется с помощью обогащенных глутамином доменов активации (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 3822 (1995)).

К такого рода факторам транскрипции относятся, например, Sp-1 и NF-Y.

Такой фактор консеквентно ограничивает использование промоторного элемента CDE-CHR для химерных промоторов. То же самое можно предполагать для промоторного элемента E2F-BS-CHB B-myb-гена (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995)).

2) Гибридные промоторы
Гибридные промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19639103.2. Для сочетания специфического к эндотелиальной клетке промотора по крайней мере с одним другим промотором выбирают, например, ген-конструкцию, которая в целом содержит следующие компоненты:
нуклеотидную последовательность специфического к эндотелиальным клеткам промотора в форме, в которой мутировано по крайней мере одно место связывания фактора транскрипции. Благодаря этой мутации блокируется инициирование транскрипции эффектор-гена;
трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
по крайней мере одну другую, активируемую неспецифически, специфически к клетке, специфически к вирусу, с помощью тетрациклина и/или специфически к клеточному циклу промоторную или энхансерную последовательность, которая активирует транскрипцию по крайней мере одного гена по крайней мере одного фактора транскрипции, который мутирован таким образом, что он может связываться с мутированным местом связывания (мутированными местами связывания) в специфическом к эндотелиальным клеткам промоторе и активировать его.

В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления настоящего изобретения мутация в промоторной последовательности может представлять собой, например, мутацию ТАТА-Вох cdc258-пpомотоpa.

Мутацией ТАТА может быть, например, TGTATAA. Благодаря этой мутации более нельзя распознавать место связывания ДНК нормального, связывающего ТАТА-Вох протеина (ТВР) и эффекторный ген более нельзя эффективно транскрибировать. Соответственно, кодирующая ТВР нуклеотидная последовательность должна обладать комутацией. Благодаря этой комутации ТВР связывается с мутированным ТАТА-Вох (например, в TGTATAA) и таким образом приводит к эффективной транскрипции эффектор-гена. Такого рода комутации ТВР-гена, например, описаны Strubin и Struhl (Cell, 721 (1992)) и Heard и др., (EMBO J., 3519 (1993)).

3) Множественные промоторы в сочетании с нуклеарным сигналом удерживания и нуклеарным экспорт-фактором
Эта технология уже описана в заявке на патент ФРГ 19617851.7. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.

Такого рода промотор содержит согласно изобретению следующие компоненты:
- первая, специфическая к эндотелиальным клеткам, активируемая промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию трансгена;
- трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
- нуклеарный сигнал удерживания (NRS), кДНК которого по 5'-концу прямо или косвенно связана с 3'-концом структурного гена (б);
- предпочтительно продукт транскрипции нуклеарного сигнала удерживания имеет структуру связывания нуклеарного экспорт-фактора;
- другая неспецифическая, специфическая к клетке, специфическая к вирусу, активируемая метаболически и/или специфически к клеточному циклу промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию нуклеарного экспорт-фактора;
- нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеарный экспорт-фактор (NEF), который связывается с продуктом транскрипции нуклеарного сигнала удерживания и благодаря этому способствует транспорту продукта транскрипции трансгена из клеточного ядра.

Ген, кодирующий нуклеарный сигнал удерживания, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Rev-реактивного элемента (RRE) ВИЧ-1 или ВИЧ-2, эквивалентного RRE сигнала удерживания ретровирусов или эквивалентного RRE сигнала удерживания вируса гепатита В.

Нуклеарный экспорт-фактор предпочтительно представляет собой ген, выбираемый из группы, состоящей из Rev-гена вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2, вируса Maedl-Visna, артритного вируса энцефалита Caprine, вируса инфекционной анемии лошади, вируса иммунодефицита кошек, ретровирусов, Т-клеточного лимфотрофического вируса человека или гена hnRNP-A1-протеина или гена фактора транскрипции TFIII-A.

Активатор-реактивная промоторная единица
Активатор-реактивные промоторные единицы уже подробно описаны в заявке на патент ФРГ 19617851. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.

Активатор-реактивная промоторная единица состоит из следующих компонентов:
- одна или несколько одинаковых или разных промоторных или энхансерных последовательностей, которые активируются, например, специфически к клеточному циклу, в зависимости от пролиферации клеток, метаболически, специфически к эндотели-альным клеткам или специфически к вирусу или как специфически к клеточному циклу, так и также метаболически, специфически к эндотелиальным клеткам или специфически к вирусу (так называемые химерные промоторы);
- одна или несколько одинаковых или разных активаторных субъединиц, которые находятся, смотря по обстоятельствам, ниже промоторных или энхансерных последовательностей и активируются ими при их базальной транскрипции;
- активатор-реактивный промотор, который активируется продуктами экспрессии одной или нескольких активаторных субъединиц.

В предпочтительном варианте осуществления предлагаемые согласно изобретению активатор-реактивные промоторные единицы могут представлять собой места связывания химерных факторов транскрипции из ДНК-доменов связывания, доменов взаимодействия протеин-протеин и доменов трансактивации. Все указанные в заявке места связывания фактора транскрипции могут присутствовать однократно (мономеры) или в виде нескольких копий (мультимеры, например, включающие вплоть до 10 копий).

Примером активатор-реактивного промотора, активированного двумя активаторными субъединицами, является LexA-оператор в сочетании с SV40-промотором, причем
- первая активаторная субъединица включает кДНК LexA-ДНК-связывающего протеина (Bindeprotein), кодирующего аминокислоты 1-81 или 1-202, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal 80-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4-протеина, кодирующего аминокислоты 851-881, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК "широкого" Т-антигена SV40, кодирующего аминокислоты 126-132, в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5"-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.

Другим примером активатор-реактивного промотора, активированного двумя активаторными субъединицами, является связывающая последовательность Gаl4-протеина в сочетании с SV40-пpомотором, причем
- первая активаторная единица включает кДНК ДНК-связывающего домена Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal4-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4 (аминокислоты 851-881), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.

Дальнейшим примером двух активаторных субъединиц, которые активируют активатор-реактивный промотор, состоящий из связывающей последовательности Gа14-протеина и SV40-промотора, является:
- первая активаторная единица, которая включает кДНК цитоплазматического домена CD4-Т-клеточного антигена (аминокислоты 397-435), 5'-конец которой связан с 3'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1 (аминокислоты 406-488), в свою очередь, 5'-конец которой снова связан с 3'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 16-32), и
- вторая активаторная единица, включающая кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), кДНК домена связывания ДНК Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК CD4-связывающей последовательности р56 lck-протеина (аминокислоты 1-71).

Выбор эффектор-гена
Предлагаемая согласно изобретению нукдеотидная последовательность содержит по крайней мере один эффектор-ген (компонент д)), который кодирует фармакологически активное вещество для профилактики и/или лечения заболевания. Это биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, антител или фрагментов антител, рецепторов цитокинов или факторов роста, антипролиферативно, апоптотически или цитостатически действующих протеинов, ингибиторов ангиогенеза, ингибиторов свертывания, фибринолитически действующих веществ, протеинов плазмы, дополнительно активирующих протеинов, пептидных гормонов, протеинов вирусных оболочек, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов, воздействующих на кровообращение протеинов и рибозимов.

В случае трансгена речь идет предпочтительно о структурном гене, который кодирует рибозим, инактивирующий мРНК, которая кодирует протеин, выбираемый из группы, состоящей из контрольных протеинов клеточного цикла, в особенности таких, как циклин-А, циклин-В, циклин-D1, циклин-Е, E2F1-5, cdc2, cdc25C или DP1, или вирусных протеинов, или цитокинов, или факторов роста, или их рецепторов.

В следующем варианте осуществления эффектор-ген может кодировать фермент, который расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона.

Согласно дальнейшему варианту осуществления эффектор-ген может кодировать слитый протеин лиганд-эффектор, причем лигандом может быть антитело, фрагмент антитела, цитокин, фактор роста, адгезионная молекула или пептидный гормон, а эффектор может представлять собой фармакологически активное, как описанное выше, вещество или фермент. Например, структурный ген может кодировать слитый протеин лиганд-фермент, причем фермент расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона, а лиганд связывается с поверхностью клетки, предпочтительно с эндотелиальными клетками или опухолевыми клетками.

Согласно изобретению выбор эффектор-гена и, в случае необходимости, сочетаемого со специфическим к эндотелиальным клеткам промотором, другого промоторного элемента осуществляют в зависимости от рода профилактики и/или лечения соответствующего заболевания.

Например, при следующих заболеваниях нужно выбирать нижеследующие сочетания промоторных последовательностей и эффектор-генов (более подробное описание уже представлено в следующих заявках на патенты, которые включены в настоящее описание в виде ссылки: заявки на европейские патенты NoNo
97101507.8; 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo 19710643.9; 197704301.1; 19617851.7; 19639103.2; 19651443.6; заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6 и 19701141.1).

1. Терапия опухолей
1.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.

1.2) Эффектор-гены ингибиторов пролиферации клеток, например, таких как:
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) или родственные р107 и р130 протеины;
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) и родственные р107 и р130 протеины инактивируют путем фосфорилирования. Предпочтительно нужно использовать такие гены этих ингибиторов клеточного цикла, которые обладают мутациями сайтов инактивации экспрессированных протеинов, не затрагивая, таким образом, их функции. Примеры этих мутаций описаны для р110. Аналогичным образом мутируют ДНК-последовательность р107-протеина или р130-протеина;
- протеин р53;
- протеин р53 инактивируется в клетке либо за счет связывания со специальными протеинами, как, например, MDM2, либо путем олигомеризации р53 по дефосфорилированному С-концевому серину. Таким образом, предпочтительно используют ДНК-последовательность протеина р53, С-конец которой укорочен на серин 392;
- протеин р21 (WAF-1);
- протеин р16;
- другие cdk-ингибиторы;
- протеин GADD45;
- bak-протеин.

1.3) Эффектор-гены индуцирующих свертывание факторов и ингибиторов ангиогенеза, например, таких как:
- ингибитор-1 плазминогенного активатора (PAI-1);
- PAI-2;
- PAI-3;
- ангиостатин;
- интерфероны (IFNα, IFNβ или IFNγ);
- тромбоцитарный фактор-4;
- TIMP-1;
- TIMP-2;
- ТIMP-3;
- фактор ингибирования лейкемии (LIF);
- тканевый фактор (TF) и его активные в отношении свертывания фрагменты;
- фактор Х или мутации фактора X, согласно заявке на патент D 19701141.1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

1.4) Эффектор-гены цитостатических или цитотоксических протеинов, например, таких как:
- перфорин;
- гранзим;
- интерлейкин-2;
- интерлейкин-4;
- интерлейкин-12;
- интерфероны, как, например, IFNα, IFNβ или IFNγ;
- фактор некроза опухоли (TNF), как TNFα или TNFβ;
- онкостатин М;
- сфингомиелиназа;
- магаинин и производные магаинина.

1.5) Эффектор-гены цитостатических или цитотоксических антител и слитых протеинов из антигенсвязывающих фрагментов антител с цитостатическими, цитотоксическими или возбуждающими воспаление протеинами или ферментами.

- К цитостатическим или цитотоксическим антителам относятся таковые, направленные против мембранных структур эндотелиальных клеток, которые, например, описаны Burrous и др. (Pharmac. Ther., 64, 155 (1994)), Hughes и др. (Cancer Res., 49, 6214 (1989)) и Maruyama и др. (PNAS USA, 87, 5744 (1990)). В особенности к ним причисляют антитела против VEGF-рецепторов.

- Далее, сюда относятся цитостатические или цитотоксические антитела, направленные против мембранных структур опухолевых клеток. Такого рода антитела представлены в виде обзора, например, Sedlacek и др., Contrlb. to Oncol. , 43, Karger Verlag, Мюнхен (1992). Другими примерами являются антитела против Sialyl Lewis; против пептидов опухолей, которые распознаются Т-клетками; против экспрессированных онкогенами протеинов; против ганглиозидов, как GD3, GD2, GM2, 9-O-ацетил-GD3, фукозил-GM1; против антигенов групп крови и их предшественников; против антигенов полиморфного эпителиального муцина; против антигенов протеинов теплового шока.

- Далее, сюда относятся антитела, направленные против мембранных структур лейкемических клеток. Большое количество такого рода моноклональных антител уже описано для способов диагностики и терапии (обзоры Kristensen, Danish Medical Bulletin, 41, 52 (1994); Schranz Therapia Hungarica, 38, 3 (1990); Drexsler и др., Leuk. Res., 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers., 7, 1 (1989); Stickney и др., Curr. Opin. Oncol., 4, 847 (1992); Drexsler и др., Blut, 57, 327 (1988); Freedman и др.. Cancer Invest., 9, 69 (1991)). В зависимости от типа лейкемии в качестве лигандов, например, пригодны моноклональные антитела или связывающие антигены фрагменты антител, направленные против мембранных антигенов, приведенных в табл.2.

- Гуманизацию мышиных антител, получение и оптимизирование генов Fab- и rek. Fv-фрагментов осуществляют в соответствии с известными специалисту способами (Winter и др., Nature, 349, 293 (1991); Hoogenbooms и др., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. , 36, 19 (1993); Girol, Mol. Immunol., 28, 1379 (1991), или Huston и др., Intern. Rev.Immunol., 10, 195 (1993)). Слияние rek.Fv - фрагментов с генами цитостатических, цитотоксических или возбуждающих воспаление протеинов или ферментов осуществляют равным образом соответственно известному специалисту уровню техники.

1.6) Эффектор-гены слитых протеинов из других, связывающих эндотелиальные клетки или опухолевые клетки лигандов с цитостатическими и цитотоксическими протеинами или ферментами. К лигандам относятся, например, все вещества, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами эндотелиальных клеток. Например, к ним относятся:
- антитела или фрагменты антител;
- цитокины, как, например, интерлейкин-1, или факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, которые связываются с рецепторами, экспрессированными эндотелиальными клетками, как, например, PDGF, bFGF, VEGF, TGF.

- Далее, к ним относятся адгезионные молекулы, которые связываются с активированными и/или пролиферирующими эндотелиальными клетками. К ним относятся, например, Slex, LFA-1, LECAV-1, VLA-4 или витронектин.

- Сюда относятся другие вещества, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами опухолевых или лейкемических клеток. Например, к ним относятся факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, которые связываются с рецепторами, выраженными лейкемическими или опухолевыми клетками. Такого рода факторы роста уже описаны (Обзоры Cross и др., Cell, 64, 271 (1991); Aulitzky и др., Drugs, 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res., 1, 3 (1995); Van Kooten и др., Leuk. Lymph., 12, 27 (1993)).

- Слияние генов этих связывающихся с клеткой-мишенью лигандов с цитостатическими, цитотоксическими или возбуждающими воспаление протеинами или ферментами осуществляют соответственно уровню техники известными специалисту способами.

1.7) Эффектор-гены индукторов воспалений, например, таких как:
- интерлейкин-1;
- интерлейкин-2;
- RANTES (МСР-2);
- хемотактический и активирующий фактор моноцитов (MCAF);
- интерлейкин-8;
- макрофаговый протеин-1 воспаления (MIP-1α, -β);
- нейтрофильный активирующий протеин-2 (NAP-2);
- интерлейкин-3;
- интерлейкин-5;
- фактор ингибирования лейкемии человека (LIF);
- интерлейкин-7;
- интерлейкин-5;
- эотаксин;
- интерлейкин-13;
- GM-CSF;
- G-CSF;
- M-CSF;
- фактор яда кобры (CVF) или неполные последовательности CVF, которому функционально соответствует человеческий комплементарный фактор С3b, то есть которые могут связываться с комплементарным фактором В и после расщепления за счет фактора D представляют собой С3-конвертазу;
- человеческий комплементарный фактор С3 или его неполная последовательность С3b;
- продукты расщепления человеческого комплементарного фактора C3, которые функционально и структурно подобны CVF;
- бактериальные протеины, которые активируют комплементы или вызывают воспаления, например порины Salmonella typhimurium, факторы слипания Staphylococcus aureus, модулины, особенно грамотрицательных бактерий, "главный наружный мембранный протеин" легионелл или Haemophilus influenza типа В или клебсиелл или М-молекулы стрептококков группы G.

1.8) Эффектор-гены ферментов активации предшественников цитостатических средств, например ферментов, которые расщепляют неактивные вещества-предшественники (пролекарства) с образованием активных цитостатических средств (лекарства).

Такого рода вещества и относящиеся к ним, смотря по обстоятельствам, пролекарства и лекарства уже описаны в обзоре Deonarain и др. (Br. J. Cancer, 70, 786 (1994); Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199 (1994), и Harris и др. (Gene Ther. , 1, 170 (1994)). Например, можно использовать ДНК-последовательность одного из следующих ферментов:
- тимидинкиназа герпесвируса;
- тимидинкиназа вируса ветряной оспы;
- бактериальная нитроредуктаза;
- бактериальная β-глюкуронидаза;
- растительная β-глюкуронидаза из Secale cereale;
- человеческая β-глюкуронидаза;
- человеческая карбоксипептидаза (СВ), например, СВ-А тучной клетки, СВ-В поджелудочной железы или бактериальная карбоксипептидаза;
- бактериальная β-лактамаза;
- бактериальная цитозиндезаминаза;
- человеческая каталаза, соответственно, пероксидаза;
- фосфатаза, в особенности человеческая щелочная фосфатаза, человеческая кислая фосфатаза простаты или кислая фосфатаза типа 5;
- оксидаза, в особенности человеческая лизилоксидаза или человеческая кислая D-аминооксидаза;
- пероксидаза, в особенности человеческая глутатион-пероксидаза, человеческая эозинофильная пероксидаза или человеческая пероксидаза щитовидной железы;
- галактозидаза.

2) Терапия аутоиммунных заболеваний и воспалений
2.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.

2.2) Эффектор-гены для лечения аллергий, например, таковые β-интерферона; γ-интерферона; интерлейкина-10; антител, соответственно, фрагментов антител против интерлейкина-4; растворимых рецепторов интерлейкина-4; интерлейкина-12; TGF-β,
2.3) Эффектор-гены для предотвращения отторжения трансплантированных органов, например таковые интерлейкина-10; TGF-β; растворимых рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-2; антагонистов рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-6; иммуносупрессорных антител или их V_H - и V_L -содержащих фрагментов. Иммуносупрессорными антителами являются, например, специфическое к Т-клеточному рецептору или его CD3-комплексу антитело против CD4 или CD8, далее, против рецептора интерлейкина-2, рецептора интерлейкина-1 или рецептора интерлейкина-4 или против адгезионных молекул CD2, LFA-1, CD28 или CD40.

2.4) Эффектор-гены для лечения опосредованных антителами аутоиммунных заболеваний, например, таковые TGF-β; α-интерферона; β-интерферона; γ-интерферона; интерлейкина-12; растворимых рецепторов интерлейкина-4; растворимых рецепторов интерлейкина-6; иммуносупрессорного антитела или его V_H- и V_L - содержащих фрагментов.

2.5) Эффектор-гены для лечения опосредованных клеткой аутоиммунных заболеваний, например, таковые интерлейкина-6; интерлейкина-9; интерлейкина-10; интерлейкина-13; α-фактора некроза опухоли или β-фактора некроза опухоли; иммуносупрессивного антитела или его V_H- и V_L - содержащих фрагментов.

2.6) Эффектор-гены ингибиторов пролиферации клеток, цитостатических или цитотоксических протеинов, индукторов воспалений и ферментов активации предшественников цитостатических средств.

Примеры генов, кодирующих такого рода протеины, уже указаны в разделе "Структурные гены для терапии опухолей".

В такой же форме, как там уже описано, согласно изобретению можно применять структурные гены, которые кодируют слитые протеины из антител, соответственно. Fab- или rek. Fv-фрагментов этих антител или других лигандов специфически к клетке-мишени и вышеуказанные цитокины, факторы роста, рецепторы, цитостатические или цитотоксические протеины и ферменты.

2.7) Структурные гены для лечения артрита.

Согласно изобретению выбирают структурные гены, выраженный протеин которых прямо или косвенно подавляет воспаление, например, в суставе и/или способствует восстановлению внеклеточной матрицы (хрящ, соединительная ткань) в суставе.

К ним относятся, например, следующие:
- антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1-RA), причем IL-1-RA ингибирует связывание IL-1α, β;
- растворимый рецептор интерлейкина-1, причем растворимый рецептор IL-1 связывает и инактивирует интерлейкин-1;
- интерлейкин-6, причем интерлейкин-6 повышает выделение ТIMP и пероксидов и снижает выделение интерлейкина-1 и α-фактора некроза опухоли за счет синовиальных клеток и хондроцитов;
- растворимый рецептор фактора некроза опухоли, причем растворимый рецептор фактора некроза опухоли связывает и инактивирует фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-4, интерлейкин-4 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР и повышает выделение ТIMP;
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); IGF-1 стимулирует синтез внеклеточной матрицы;
- пероксиддисмутаза;
- TIMP, в особенности TIMP-1, TIMP-2 или TIMP-3.

3) Терапия недостаточного образования клеток крови
3.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически к клетке и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.

3.2) Эффектор-гены для лечения анемии, например таковые эритропоэтина.

3.3) Эффектор-гены для лечения лейкопении, например таковые G-CSF, GM-CSF, M-CSF.

3.4) Эффектор-гены для лечения тромбоцитопении, например таковые интерлейкина-3; фактора подавления лейкемии (LIF); интерлейкина-11; тромбопоэтина.

4) Терапия поражения нервной системы
4.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.

4.2) Эффектор-гены нейрональных факторов роста, например, таковые FGF; фактора роста нервной ткани (NGF); происходящего из головного мозга нейротрофического фактора (BDNF); нейротрофина-3 (NT-3); нейротрофина-4 (NT-4); мерцательного нейротрофического фактора (CNTF).

4.3) Эффектор-гены ферментов, например, таких как тирозингидроксилаза; допадекарбоксилаза.

4.4) Эффектор-гены цитокинов и их ингибиторов, которые ингибируют или нейтрализуют нейротоксическое действие α-фактора некроза опухоли, например, таких как:
- TGF-β;
- растворимые рецепторы фактора некроза опухоли; рецепторы фактора некроза опухоли нейтрализуют α-фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 подавляет образование α-фактора некроза опухоли; γ-интерферон, интерлейкин-2 и интерлейкин-4;
- растворимые рецепторы интерлейкина-1;
- рецептор-I интерлейкина-1;
- рецептор интерлейкина-1;
растворимые рецепторы интерлейкина-1 нейтрализуют активность интерлейкина-1;
- антагонист рецептора интерлейкина-1;
- растворимые рецепторы интерлейкина-6.

5) Терапия нарушений системы свертывания крови и кровообращения
5.1) Добавочные промоторы, активируемые
- специфически к клеточному циклу и/или
- неспецифически к клетке и/или
- метаболически.

5.2) Эффектор-гены для ингибирования свертывания или для стимуляции фибринолиза, например, таковые:
- тканевого плазминогенного активатора (tPA);
- плазминогенного активатора урокиназного типа (uРА);
- гибрида tPA и иРА;
- протеина С;
- гирудина;
- ингибиторов серинпротеиназы (серфины), как, например, С-1S-ингибитор; α1-антитрипсин или антитромбин-III;
- ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI).

5.3) Эффектор-гены для стимуляции свертывания, например, таковые F-VIII; F-IX; фактора Виллебранда; F-XIII; PAI-1; PAI-2; тканевого фактора и его фрагментов.

5.4) Эффектор-гены факторов ангиогенеза, например, как VEGF, FGF.

5.5) Эффектор-гены для снижения кровяного давления, например, таковые калликреина, эндотелиальной клетки "оксид азота (NО)-синтаза".

5.6) Эффектор-гены для ингибирования пролиферации гладкомышечных клеток после повреждений слоя эндотелия, например, таковые:
- антипролиферативного, цитостатического или цитотоксического протеина или
- фермента для расщепления предшественников цитостатических средств с образованием цитостатических средств, как уже указано выше (в случае опухоли), или
- слитого протеина одного из этих биологически активных веществ с лигандом, например, антителом или фрагментами антител, специфически к мышечным клеткам.

5.7) Эффектор-гены других протеинов плазмы крови, например, таковые альбумина, C1-инактиватора; сывороточной холинэстеразы; трансферрина; 1-антитрипсина.

6) Вакцинации
6.1) Добавочные промоторы:
- неспецифические и/или
- специфические к клеточному циклу.

6.2) Эффектор-гены для профилактики инфекционных заболеваний.

Возможности получения эффективных вакцин обычным путем ограничены.

Вследствие этого разработана технология ДНК-вакцины. В случае этих ДНК-вакцин, однако, возникают вопросы в отношении степени эффективности (Fynan и др., Int. J. Immunopharm., 17, 79 (1995); Donnelly и др., Immunol., 2, 20 (1994)).

Согласно настоящему изобретению нужно ожидать большей эффективности ДНК-вакцины.

В качестве активного вещества нужно выбирать ДНК образованного возбудителем инфекции протеина, который путем провоцирования иммунной реакции, то есть путем связывания антитела и/или благодаря цитотоксическим Т-лимфоцитам, приводит к нейтрализации и/или гибели возбудителя. Такого рода так называемые нейтрализующие антигены уже используют в качестве антигенов вакцин (см. обзор Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263 (1992)).

Согласно изобретению предпочтительна ДНК, кодирующая нейтрализующие антигены следующих возбудителей:
- вирус гриппа А;
- вирус иммунодефицита человека;
- вирус Толлвута;
- герпесвирус (вирус простого герпеса);
- респираторно-синтициальный вирус;
- вирус парагриппа;
- ротавирус;
- вирус ветряной оспы (VZV);
- цитомегаловирус (CMV);
- вирус кори;
- вирус папилломы человека (HPV);
- вирус гепатита В (HBV);
- вирус гепатита С (HCV);
- вирус гепатита D (HDV);
- вирус гепатита Е (HEV);
- вирус гепатита A (HAV);
- антиген холерного вибриона;
- Borrelia burgdorferi;
- Helicobacter pylori,
- антиген малярии.

К такого рода биологически активным веществам согласно изобретению, однако, также относится ДНК антиидиотипического антитела или его антигенсвязыващих фрагментов, структуры связывания антигена которого ("гипервариабельные участки") представляют собой копии протеиновой или углеводной структуры нейтрализующего антигена возбудителя инфекции.

Такого рода антиидиотипические антитела могут заменять особенно углеводные антигены в случае бактериальных возбудителей инфекции.

Такого рода антиидиотипические антитела и продукты их расщепления описаны в обзоре Hawkins и др. (J. Immunother., 14, 273 (1993)) и Westerink и Apsella (Springer Seminars in Immunopathol., 15, 227 (1993)).

6.3) Эффектор-гены "опухолевых вакцин".

К ним относятся антигены опухолевых клеток. Такого рода антигены представлены, например, в обзоре Sedlacek и др., Contrib. to Oncol., 32, изд. Karger, Мюнхен (1988), и Contrib. to Oncol., 43, изд. Karger, Мюнхен (1992).

Другими примерами генов, соответственно, следующих антигенов, соответственно, следующих антиидиотипических антител являются:
- Sialyl Lewis;
- пептиды опухолей, которые распознаются Т-клетками;
- экспрессированные онкогенами протеины;
- антигены групп крови и их предшественники;
- антигены полиморфного эпителиального муцина;
- антигены протеинов теплового шока.

7) Терапия хронических инфекционных заболеваний
7.1) Добавочные промоторы:
- специфические к вирусу и/или
- специфические к клеточному циклу и/или
- неспецифические.

7.2) Эффектор-гены, например,
- протеина, который оказывает цитостатические, апоптотические или цитотоксические воздействия;
- фермента, который расщепляет предшественника антивирусного или цитотоксического вещества с образованием активного вещества.

7.3) Эффектор-гены антивирусных протеинов, таких как:
- антивирусно активные цитокины и факторы роста; к ним относятся, например, α-интерферон, β-интерферон, γ-интерферон, β-фактор некроза опухоли, α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-1 или TGF-β;
- антитело со специфичностью, которая инактивирует соответствующий вирус, или его V_H- и V_L - содержащие фрагменты, или его, связанные через линкер, V_H- и V_L - фрагменты, получаемое, как уже описано.

Антителами против вирусного антигена являются, например, следующие: против вируса гепатита человека В, против вируса гепатита человека С, против вируса герпеса человека, против вируса папилломы человека, против вируса иммунодефицита человека, против вируса Эпстайна-Барра, против вируса Т-клеточной лимфомы человека, против вируса Коксаки, против вируса Хантаана.

- Rev-связывающий протеин. Эти протеины связываются с Rev-РНК и ингибируют Rev-зависимые посттранскрипционные стадии экспрессии ретровирусного гена. Примерами Rev-связывающих протеинов являются: RBP9-27; RBP1-8U; RBP1-8D; псевдогены RBP1-8;
- рибозимы, которые переваривают мРНК генов контрольных протеинов клеточного цикла или мРНК вирусов. Каталитически действующие для ВИЧ рибозимы описаны в виде обзора, например, Christoffersen и др., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995).

7.4) Эффектор-гены антибактериальных протеинов
К антибактериальным протеинам относятся, например, антитела, которые нейтрализуют бактериальные токсины или опсонизируют бактерии. Например, к ним относятся антитела против менингококков С или В, coil, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus.

Сочетание одинаковых или разных структурных генов
Предметом изобретения, далее, является конструкция нуклеиновой кислоты, в которой имеется сочетание ДНК-последовательностей двух одинаковых или двух разных структурных генов. Для экспрессии обеих ДНК-последовательностей включают другую промоторную последовательность или предпочтительно кДНК "внутреннего рибосомного аминоациального сайта" (IRES) в качестве регуляторного элемента обоих структурных генов.

IRES позволяет осуществлять экспрессию двух связанных друг с другом через IRES ДНК-последовательностей.

Такого рода IRES описаны, например, Montford и Smith, TIG, 11, 179 (1995); Kaufman и др. , Nucl. Acids Res., 19, 4485 (1991); Morgan и др., Nucl. Acids Res., 20, 1293 (1992); Dirks и др.. Gene, 128, 247 (1993); Pelletier и Sonenberg, Nature, 334, 320 (1988), и Sugitomo и др., BioTechn., 12, 694 (1994).

Так, например, можно использовать кДНК IRES-последовательности вируса полиомиелита (положение ≤140-≥630 5'-UTR).

Согласно изобретению предпочтительно нужно связывать через другие промоторные последовательности или IRES-последовательность структурные гены, которые обладают аддитивным действием.

Согласно изобретению предпочтительными являются сочетания структурных генов, например, для
1) терапии опухолей:
- одинаковые или разные, цитостатические, апоптотические, цитотоксические или возбуждающие воспаление протеины или
- одинаковые или разные ферменты для расщепления предшественника цитостатического средства;
2) терапии аутоиммунных заболеваний:
- различные цитокины или рецепторы с синергическим действием для ингибирования клеточной и/или гуморальной иммунной реакции или
- разные или одинаковые TIMPs;
3) терапии недостаточного образования клеток крови:
- разные, иерархически следующие друг за другом цитокины, как, например, интерлейкин-1, интерлейкин-3, интерлейкин-6 или CM-CSF и эритропоэтин, G-CSF или тромбопоэтин;
4) терапии поражений нервных клеток:
- нейрональный фактор роста и цитокин или ингибитор цитокина;
5) терапии нарушений системы свертывания крови и системы кровообращения:
- антитромботическое средство и фибринолитическое средство (например, tPA и uРА) или
- цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин и антитромботическое или фибринолитическое средство;
- некоторые различные, синергически действующие факторы свертывания крови, например F-VIII и vWF или F-VIII и F-IX;
6) вакцинации:
- антиген и иммуностимулирующий цитокин, как, например, интерлейкин-1α, интерлейкин-1β, интерлейкин-2, GM-CSF, рецептор интерлейкина-3 или интерлейкина-4;
- различные антигены одного опухолевого типа или различных опухолевых типов;
7) терапии вирусных инфекционных заболеваний:
- антивирусный протеин и цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин;
- антитела против различных поверхностных антигенов одного вируса или нескольких вирусов;
8) терапии бактериальных инфекционных заболеваний:
- антитела против различных поверхностных антигенов и/или токсинов микроба.

Вставка сигнальных последовательностей и трансмембранных доменов
Подробное описание технологии уже представлено в заявках на патенты ФРГ NoNo 19639103.2 и 19651443.6, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

1) Для усиления трансляции в 3'-конец промоторной последовательности и непосредственно в 5'-конец стартового сигнала (ATG) сигнальной, соответственно, трансмембранной последовательности можно вставлять нуклеотидную последовательность GCCACC или GCCGCC (Kozak, J. Cell Biol., 108, 299 (1989)).

2) Для облегчения выделения продукта экспрессии структурного гена, при известных условиях содержащуюся в ДНК-последовательности структурного гена гомологичную сигнальную последовательность можно заменять гетерологичной, улучшающей внутриклеточное выведение сигнальной последовательностью.

Так, например, можно вставлять сигнальную последовательность иммуноглобулина (ДНК-положение ≤63-≥107; Riechmann и др., Nature, 332, 323 (1988)) или сигнальную последовательность СЕА (ДНК-положение ≤33-≥134; Screwe и др., Mol. Cell Blol. , 10, 2738 (1990); Berling и др., Cancer Res., 50, 6534 (1990)) или сигнальную последовательность гликопротеина человеческого респираторно-синтициального вируса (кДНК из аминокислот ≤38-≥50 или 48-65; Lichtenstein и др., J. Gen. Virol., 77, 109 (1996)).

3) Для анкеровки биологического активного вещества в клеточной мембране, образующей биологически активное вещество трансдуцированной, клетки можно вводить, альтернативно или дополнительно к сигнальной последовательности, последовательность трансмембранного домена.

Так, например, между промоторной последовательностью и последовательностью структурного гена можно вставлять трансмембранную последовательность человеческого, стимулирующего макрофаговую колонию фактора (ДНК-положение: ≤1485-≥1554; Cosman и др., Behring. Inst. Mitt., 83, 15 (1988)) или ДНК-последовательность сигнального и трансмембранного участка человеческого респираторно-синцитиального вирусного (RSV)-гликопротеина G (аминокислоты 1-63 или их неполные последовательности, аминокислоты 38-63; Vijaya и др., Mol. Cell Biol. , 8, 1709 (1988); Lichtenstein и др., J.Gen. Virol., 77, 109 (1966)) или ДНК-последовательность сигнального и трансмембранного участка нейраминидазы вируса гриппа (аминокислоты 7-35 или неполная последовательность аминокислот 7-27; Brown и др., J. Virol., 62, 3824 (1988)).

4) Для анкеровки биологически активного вещества в клеточной мембране образующих биологически активное вещество, трансдуцированных клеток, однако, можно вставлять также нуклеотидную последовательность гликофосфолипидного анкера.

Вставку гликофосфолипидного анкера осуществляют в 3' - конец нукдеотидной последовательности структурного гена и дополнительно можно осуществлять к вставке сигнальной последовательности.

Гликофосфолипидные анкеры, например, для СЕА, N-CAM и других мембранных протеинов, как, например, Thy-1, описаны (см. обзор Ferguson и др., Ann. Rev. Blochem., 57, 285 (1988)).

5) Другой возможностью анкеровки биологически активных веществ в клеточной мембране согласно настоящему изобретению является использование ДНК-последовательности для слитого протеина лиганд-биологически активное вещество. Специфичность лиганда этого слитого протеина направлена против мембранной структуры клеточной мембраны выбранной клетки-мишени.

5.1) К лигандам, которые связываются с поверхностью клеток, относятся, например, антитела или фрагменты антител, направленные против структур на поверхности, например,
- эндотелиальных клеток, в особенности к ним причисляют антитела против VEGF-рецепторов или против рецепторов кинина;
- или мышечных клеток, как антитела против актина, или антитела против рецепторов ангиотензина-II, или антитела против рецепторов факторов роста, как, например, против EGF-рецепторов, или против PDGF-рецепторов, или против FGF-рецепторов, или антитела против рецепторов эндотелина-А.

К лигандам также относятся антитела или их фрагменты, которые направлены против специфических к опухоли или ассоциированных с опухолью антигенов опухолевой клеточной мембраны. Такого рода антитела уже описаны.

Мышиные моноклональные антитела предпочтительно нужно использовать в гуманизированной форме. Fab- и rek.Fv-фрагменты и продукты их слияния получают, как уже описано, с помощью известной специалисту технологии.

5.2) К лигандам относятся, далее, все биологически активные вещества, как, например, цитокины или адгезионные молекулы, факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, медиаторы или пептидные гормоны, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами соответствующих выбранных клеток (клеток-мишеней). Например, к ним относятся:
- лиганды эндотелиальных клеток, как интерлейкин-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGTGGβ (Pusztain и др. , J. Pathol., 169, 191 (1993)) или кинин и производные или аналоги кинина;
- далее, к ним относятся адгезионные молекулы. Такого рода адгезионные молекулы, как например, Slex, LFA-1, VAC-1, LeCAM-1, VLA-4 или витронектин и производные или аналоги витронектина, уже описаны для эндотелиальных клеток (обзоры Augustin-Voss и др. , J. Cell Blol., 119, 483 (1992); Paul и др., Cancer Vetast. Rev., 9, 175 (1990); Honn и др., Cancer Vetast. Rev., 11, 353 (1992); Varner и др., Cell Adh. Commun., 3, 367 (1995)).

Изобретение поясняется подробнее следующими примерами, не ограничивающими его объема.

Получение и применение конструкции нуклеиновой кислоты
Конструкции нуклеиновых кислот предпочтительно состоят из ДНК. Под термином "конструкции нуклеиновых кислот" нужно понимать искусственные образования из нуклеиновой кислоты, которые могут транскрибироваться в клетках-мишенях. Они предпочтительно вставлены в вектор, причем особенно предпочтительны плазмидные векторы или закомплексованные с невирусными носителями плазмиды (Fritz и др., Hum. Gene Ther., 7, 1395 (1996); Sоlоdin и др., Biochem., 34, 13537 (1995); Abdallak и др., Hum. Gene Ther., 7, 1947 (1996); Ledley, Hum. Gene Ther. , 6, 1129 (1995); Schofield и др., Вr. Med. Bull., 51, 56 (1995); Behr, Bioconj. Chem., 5, 382 (1994); Gotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Hodgsan и др., Nature Biotechnol., 14, 339 (1996)). Векторы вводят в клетку-предшественник эндотелиальных клеток или в эндотелиальные клетки с помощью известных специалисту технологий (Cotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Scheffield и др., Br. Med. Bull., 51, 56 (-1995); Ledley, Hum. Gene Ther., 6, 1129 (1995)).

Согласно другому варианту осуществления предлагаемые согласно изобретению конструкции нуклеиновых кислот вставляют в вирусный вектор (Weir и др., Hum. Gene Ther. , 7, 1331 (1996); Flotte и др., Gene Ther., 2, 357 (1995); Efstathion и др. , Br. Med. Bull., 51, 45 (1995); Kremer и др., Br. Med. Bull. , 51, 31 (1995); Vile и др., Br. Med. Bull., 51, 12 (1995); Randrianarison и др. , Biologicals, 23, 145 (1995); Jolly, Cancer Gene Ther., 1, 51 (1994)) и трансфецируют с помощью этих эндотелиальных клеток. Таким образом трансдуцированные клетки вводят пациентам наружно иди внутрь, локально, в полость тела, в орган, в кровообращение, в дыхательный путь, в желудочно-кишечный тракт, в мочеполовую систему, в полость раны или внутримышечно или подкожно.

Благодаря предлагаемым согласно изобретению конструкциям нуклеиновых кислот структурный ген может экспрессироваться в эндотелиальных клетках или клетках-предшественниках эндотелиальных клеток специфически к клетке и, в случае необходимости, также специфически к вирусу, при определенных метаболических условиях, и/или специфически к клеточному циклу, и/или индуцированно за счет лекарственного средства, причем в случае структурного гена речь идет предпочтительно о гене, который кодирует фармакологически активное вещество иди фермент, который расщепляет неактивный предшественник фармакона с образованием активного фармакона.Структурный ген может быть выбран таким образом, что фармакологически активное вещество или фермент экспрессируются в виде слитого протеина с лигандом, и этот лиганд связывается с поверхностью клеток, например, пролиферирующих эндотелиальных или опухолевых клеток.

Изобретение ниже описывается более подробно с помощью фигуры и примеров, однако, не ограничивающих его объема.

На чертеже изображена конструкция нуклеиновой кислоты для трансформации клеток
Примеры для пояснения сущности изобретения
1) Культивирование эндотелиальъных клеток из СD34-положительных клеток крови без использования фибронектина и головного мозга крупного рогатого скота
СD34-положительные клетки крови, выделенные по методике, описанной Asahara и др., Science, 275, 964 (1997), культивируют в культуральной среде (среда 199) при температуре 37^oС и в атмосфере с 5% диоксида углерода,
- либо, как описано Asahara (смесь а)), в пластмассовых чашках, покрытых фибронектином и при добавке экстракта из головного мозга крупного рогатого скота (100 мкг/мл);
- либо согласно настоящему изобретению (смесь б)) в пластмассовых чашках без фибронектинового покрытия и без добавки экстракта из головного мозга крупного рогатого скота, однако, с добавкой VEGF и bFGF (фирма Сигма; 1 об.% каждого), смотря по обстоятельствам, при добавке фетальной телячьей сыворотки (FKS, 20%).

Спустя 6 дней с помощью микроскопа определяют долю адгезивно растущих, образующих веретенообразные и капилляроподобные структуры клеток, а долю эндотелиальных клеток находят путем маркировки с помощью специфических к эндотелиальным клеткам антител (анти-СD31, анти-vWF, анти-Flik-1) путем анализа при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ). Никакого различия в количестве и морфологии этих клеток между смесью а) и смесью б) не обнаружено. В серии испытаний обеих смесей доля эндотелиальных клеток колеблется в диапазоне 1-10%, что подтверждает, что добавка факторов роста VEGF и bFGF может заменять покрытие чашек для культивирования фибронектином и добавку экстракта из головного мозга крупного рогатого скота.

2) Культивирование эндотелиальных клеток из мононуклеарных клеток крови
Из 120 мл крови путем центрифугирования с градиентом плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки.

Эти клетки высевают в чашки для культивирования соответственно смеси б) и культивируют в течение 6 дней при температуре 37^oС и в атмосфере с 5% диоксида углерода.

Спустя 6 дней определяют долю эндотелиальных клеток, как описано выше в п.1). В различных сериях опытов она составляет 2-20%.

3) Культивирование эндотелиальных клеток из CD14-положительных клеток крови.

Из 120 мл крови здорового донора путем центрифугирования с градиентом плотности фиколла (Ficoll-Paque, Pharmacia, Uppsala) выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 60 минут в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки крови. Таким образом выделенные, неприлипшие мононуклеарные клетки (NMZ) содержат 0,3-0,05% CD34-положительных и 5-10% СD14-положительных (моноциты и моноцитоподобные клетки) клеток.

Используют мононуклеарные клетки из расчета по 1•10⁶ клеток на 1 мл среды 199, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки (и то, и другое фирмы Гибко) и 100 мкг ECGS (Harbor Bioproducts, Норвуд, Марокко) или VEGF (Рерrо Techn. , Лондон, Англия), и инкубируют в течение 1-3 часов при 37^oС в покрытых фибронектином (Harbor Bioproducts, Норвуд, Марокко) пластмассовых чашках. За счет этой инкубации увеличивается доля CD14-положительных клеток с 5-10% до 25-30%.

Мононуклеарные клетки отделяют путем осторожной промывки и CD14-положительные или CD11-положительные клетки выделяют с помощью магнитных шариков, покрытых анти-CD14, соответственно, анти-CD11 (CD14/CD11 Micro Beads, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Германия), согласно инструкциям изготовителя.

Мононуклеарные клетки, содержащие примерно ≥80% CD14-положительных клеток, в указанной среде 199, дополненной фетальной телячьей сывороткой и ECGS или VEGF, инкубируют в покрытых фибронектином пластмассовых чашках при температуре 37^oС во влажной атмосфере с 5% диоксида углерода.

Клетки в культуре исследуют спустя 6 часов, 3 дня и 5 дней с помощью моноклональных антител и путем полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой.

Спустя 6 часов уже обнаруживают маленькие мононуклеарные CD14-положительные клетки, которые положительны к специфическим к эндотелиальным клеткам маркерам: ацетил-LDL-peцепторам, CD34, Flk-1 и фактору Виллебранда. На третий день эти клетки проявляют сильные признаки пролиферации.

На 5-й день можно наблюдать прилипшие большие зернистые овальные клетки и веретенообразные клетки, которые все несут указанные маркеры эндотелиальных клеток, но более не содержат СD14-маркера.

Как только эти эндотелиальные клетки срастаются, они дополнительно экспрессируют VE-кадгерин. Спустя 1-2 недели в культуре эндотелиальных клеток находятся более 80% клеток.

4) Специфическая к эндотелиальным клеткам трансформация и культивирование эндотелиальных клеток из мононуклеарных клеток крови.

Из 120 мл крови путем центрифугирования с градиентом
плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки крови. Эти клетки крови доводят до концентрации 1х10⁷ на 1 мл культуральной среды, высеивают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen) инкубируют в течение 10 минут при температуре 37^oС.

Комплекс получают согласно инструкциям изготовителя Суперфекта.

Предлагаемая согласно изобретению плазмида содержит в направлении считывания от 5'-конца к 3'-концу следующие ДНК-последовательности:
- промотор человеческого эндоглин-гена (NS1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- кДНК человеческой циклинзависимой киназы-4 (cdk-4) с мутацией в кодоне-24 [обмен аргинина (СGТ) на цистеин (TGT).; и др., Science, 269, 1281 (1997)];
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) от SV40 ["широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991)].

Связывание отдельных составных частей конструкции осуществляют через пригодные сайты рестрикции, которые имеются за счет амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на концах различных элементов. Связывание осуществляют с помощью известных специалисту, специфических к сайтам рестрикции ферментов и ДНК-лигаз. Эти ферменты имеются в продаже. Таким образом полученный нуклеотид однократно клонируют с помощью этих ферментов.

После инкубации мононуклеарных клеток крови с комплексом Суперфект/плазмида клетки крови промывают и культивируют в среде для культивирования клеток, как описано в разделе 2.

Спустя 6 дней определяют долю эндотедиальных клеток, как описано в разделе 1. В различных сериях опытов она колеблется в диапазоне 10-60%.

5) Получение и применение трансдуцированных эндотелиальных клеток в качестве векторов
Выделенные, трансдуцированные и размноженные, как описано в разделе 4), эндотелиальные клетки высевают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из другой, предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen), инкубируют в течение 10 минут при температуре 37^oС.

Этот комплекс получают согласно инструкциям изготовителя Суперфекта.

Предлагаемая согласно изобретению плазмида содержит в направлении считывания от 5'-конца к 3'-концу следующие ДНК-последовательности.

Активаторная субъединица А)
- промотор cdk25C-reHa (нуклеиновые кислоты 290 до +121; Zwicker и др., EMBO J., 14, 4514 (1995); Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995));
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кислый домен трансактивации (TAD) HSV-1 VP16 (аминокислоты 406-488; Triezenberg и др., Genes Developm., 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995));
- кДНК цитоплазматической части CD4-глипротеина (аминокислоты 397-435; Simpson и др., Oncogene, 4, 1141 (1989); Maddon и др., Cell, 42, 93 (1985)).

Активаторная субъединица В)
- промотор человеческого эндоглин-гена (нуклеиновые кислоты 1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132 PKKKRKV (последовательность No3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кДНК домена связывания ДНК протеина Gal4 (аминокислоты 1-147; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Blol., 10, 2916 (1990);
- кДНК связывающей последовательности CD4 протеина р56 lck (аминокислоты 1-71; Shaw и др.. Cell, 59, 627 (1989);
Turner и др., Cell, 60, 755 (1990); Perlmutter и др., J. Cell Biochem., 38, 117 (1988)).

Активатор-реактивные промоторы
- 10х связывающая последовательность Ga14-протеина связывания с нуклеотидной последовательностью 5'-CGGACAATGTTGACCG-3' (последовательность No 4; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916 (1989));
- базальный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (изд.) "DNA Tumor Viruses" (Cold Spring- Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory).

Эффектор-ген
- кДНК человеческой β-глюкуронидазы (нуклеотидная последовательность 93-1982; Oshlrna и др., PNAS USA, 84, 65 (1987)).

Действие описанной активаторной последовательности следующее:
- промотор cdc258 регулирует специфически к клеточному циклу транскрипцию комбинированных кДНК домена активации VP16 и цитоплазматической части CD4 (активаторная субъединица А));
- промотор человеческого эндоглин-гена регулирует специфически к эндотелиальным клеткам транскрипцию комбинированных кДНК ДНК-протеина связывания Gal4 и CD4-связывающей части протеина р56 lck (активаторная субъединица В));
- продукты экспрессии активаторных субъединиц А и В димеризуются за счет связывания CD4-домена с доменом р56 lck;
- димерный протеин представляет собой химерный фактор транскрипции активатор-реактивного промотора (ДНК-последовательность Gа14-домена связывания/промотора SV40) для транскрипции эффектор-гена (=люцифераза-ген).

Связывание отдельных составных частей конструкции осуществляют через пригодные сайты рестрикции, которые за счет ПЦР-амплификации имеются на концах различных элементов. Связывание осуществляют с помощью известных специалисту специфических к сайтам рестрикции ферментов и ДНК-лигаз. Эти ферменты имеются в продаже.

Таким образом полученную нуклеотидную конструкцию с помощью этих ферментов однократно клонируют в плазмидном векторе рХР2 (Nordeen, BioTechniques, 6, 454 (1988)). После инкубации мононуклеарных клеток крови с комплексом Супер-фект/плазмида клетки крови промывают и культивируют в среде для культивирования клеток, как описано в разделе 2.

Спустя 6 дней определяют количество β-глюкуронидазы, продуцированное эндотелиальными клетками, с помощью 4-мети-лумбеллиферил-β-глюкуронида в качестве субстрата.

Для проверки специфичности к клеточному циклу эндотелиальные клетки синхронизируют путем удаления метионина через 48 часов в G₀/G₁. Содержание ДНК в клетках определяют по окрашиванию с помощью красителя 33258 фирмы ХЕХСТ в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (Lucibello и др., ЕМВО J., 14, 132 (1995)).

Получают следующие результаты.

В трансфецированных эндотелиальных клетках нельзя определить никакого увеличения содержания β-глюкуронидазы по сравнению с нетрансфецированными фибробластами.

Трансфецированные эндотелиальные клетки отчетливо экспрессируют больше β-глюкуронидазы, чем нетрансфецированные эндотелиальные клетки.

Пролиферирующие эндотелиальные клетки (ДНК>2S; S=набор хромосом) выделяют отчетливо больше β-глюкуронидазы, чем синхронизированные в G₀/G₁ эндотелиальные клетки (ДНК=2S).

Таким образом, описанная активатор-реактивная промоторная единица приводит к специфической клетке, зависимой от клеточного цикла экспрессии структурного гена β-глюкуронидазы.

Эндотелиальные клетки согласно настоящему изобретению после локального введения, например, в место опухоли, или после внутричерепного, соответственно, субарахноидального введения или системного, предпочтительно внутривенного или внутриартериального введения, делают возможным то, что эти эндотелиальные клетки располагаются предпочтительно в областях с повреждением сосудов и за счет специфичности к клеточному циклу и специфичности к эндотелиальным клеткам активатор-реактивной промоторной единицы только пролиферирующие эндотелиальные клетки преобладающе, если не исключительно, выделяют β-глюкуронидазу. Эта β-глюкуронидаза расщепляет теперь инъецированный, хорошо совместимый доксорубицин. Он подавляет пролиферацию эндотелиадьных клеток и действует цитостатически на эти клетки, а также на соседние опухолевые клетки. Благодаря этому приходят к торможению роста опухоли.

Изобретение относится к генной терапии и касается способа получения генетически измененных клеток. Сущность изобретения заключается в выделении клеток из крови или жидкостей организма, культивировании полученных клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, на выбор иммортализацию полученных клеток путем трансформации онкогеном, выбранным из группы, состоящей из мутированного cdk-4, cdk-6 и cdk-2, активации протоонкогена или инактивации супрессорного гена, трансфекции полученных клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии. Преимущество заключается в создании эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии. 17 з.п.ф-лы, 1 ил. , 2 табл.

1. Способ получения генетически измененных клеток, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии: а) выделение клеток из крови или жидкостей организма, содержащих клетки; б) культивирование полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста; в) на выбор иммортализацию полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, который мутирован таким образом, что генный продукт, вырабатываемый онкогеном, еще может полностью активировать клеточный цикл, однако эта активация клеточного цикла более не ингибируется клеточными ингибиторами, в частности онкоген выбран из группы, состоящей из мутированных cdk-4, cdk-6 и cdk-2, активации протоонкогена или инактивации супрессорного гена путем трансформации клеток с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, который инактивирует по крайней мере один генный продукт, вырабатываемый супрессорным геном, и г) трансфекцию полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки являются CD34-, CD14-, CD11-, CD11b-, CD13-, CD64- или CD68- положительными или эндотелиальными клетками. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что клетки являются клетками крови венозной, капиллярной, артериальной, пуповины или плаценты, клетками костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, перитонеального пространства, плеврального пространства, лимфы, вен, артерий, капилляров и/или жидкости соединительной ткани. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что фактор роста на стадии б) выбирают из группы, состоящей из ECGF, FGF_αFGF_β, VEGF, ECAF, IGF-1, IGF-2, SC-3, EGF, SCF, TGF, ангиогенина, плейотрофина и Flt-3-лиганда. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что онкоген представляет собой нуклеотидную последовательность cdk-4, в положении 24 мутированную таким образом, что первоначально кодированный аргинин заменен на цистеин. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что протеин, инактивирующий генный продукт, вырабатываемый супрессорным геном, выбирают из группы, состоящей из ElA-протеина аденовируса, ElB-протеина аденовируса, "широкого" Т-антигена SV40-вируса, E6-протеина вируса папилломы, Е7-протеина вируса папилломы, MDM-2-протеина и протеина, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность LXDXLXXL-II-LXCXEXXXXXSDDE, в которой Х означает заменимую аминокислоту и -II- означает любую аминокислотную цепь из 7-80 аминокислот. 7. Способ по любому из пп. 1, 5 или 6, отличающийся тем, что клетка представляет собой эндотелиальную клетку и используемый для трансформации онкоген или используемая для инактивации супрессорного гена нуклеотидная последовательность связаны со специфической к эндотелию активаторной последовательностью, которая регулирует транскрипцию онкогена или указанной нуклеотидной последовательности. 8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что конструкция нуклеиновой кислоты на стадии г) содержит по крайней мере одну неограниченно активируемую, специфическую к эндотелиальным клеткам, специфическую к вирусу, метаболически активируемую и/или активируемую специфически к клеточному циклу активаторную последовательность и по крайней мере один эффектор-ген, экспрессия которого регулируется активаторной последовательностью. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что экспрессия эффектор-гена регулируется по крайней мере двумя одинаковыми или разными активаторными последовательностями. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что вторую активаторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей вирусов, таких, как вирус гепатита В человека, вирус гепатита С человека, вирус герпеса человека, вирус папилломы человека, вирус Эпстайна-Барра, вирус N-клеточной лимфомы человека, вирус огуречной мозаики или вирус иммунодефицита человека; промоторных или энхансерных последовательностей, активированных путем гипоксии или с помощью специфических к клеточному циклу активаторных последовательностей генов cdc25C, cdc25B, циклина А, cdc2, E2F-1, B-myb и DHFR; связывающих последовательностей факторов транскрипции, которые зависят от клеточной пролиферации или активированы, как мономеры или мультимеры Myc E-Вох. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий биологически активное вещество, выбранное из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, факторов роста, рецепторов цитокинов, хемокинов или факторов роста, антипролиферативно, или цитостатически, или апоптотически действующих протеинов, антител, фрагментов антител, ингибиторов ангиогенеза, пептидных гормонов, факторов свертывания, ингибиторов свертывания, фибринолитических протеинов, пептидов или протеинов, воздействующих на кровообращение, протеинов плазмы крови и антигенов возбудителей инфекции, или клеток, или опухолей, причем выбранный антиген провоцирует иммунную реакцию. 12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий фермент, который расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона. 13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий слитый протеин лиганд-биологически активное вещество или слитый протеин лиганд-фермент, причем лиганд выбран из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, антител, фрагментов антител, пептидных гормонов, медиаторов, клеточных адгезионных протеинов и протеинов, связывающих LDL-рецептор. 14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что вводимая в эндотелиальную клетку конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК. 15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что конструкция нуклеиновой кислоты встроена в вектор. 16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор. 17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что вектор представляет собой вирусный вектор. 18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что получают клетки для эндотелизации поврежденных сосудов.

Приоритет по пунктам:
21.07.1997 по пп. 1, 3-17;
26.11.1997 по пп. 2 и 18.