СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/16 A61K35/14 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для получения биологически активных препаратов и последующего использования при коррекции резистентности организма человека и сельсхозживотных.

В качестве иммунокорригирующего препарата широко известна лейкоцитарная плазма из крови свиней. Получение подобной лейкоцитарной плазмы (Информационный листок N 275-82, 1982) предусматривает стабилизацию крови животных раствором, включающим трилон Б (10,0 г), риванол (0,012 г), хлористый натрий (0,85 г) и дистиллированную воду (100,0 г). В полученную смесь добавляют 5%-ный поливиниловый спирт, отстаивают. При этом происходит отделение надосадочной жидкости, содержащей плазму крови с лейкоцитами (не менее 16 тыс/мм³), раствор стабилизатора и поливинилового спирта. К надосадочной жидкости для консервирования добавляют 10%-ный мертиолат натрия в количестве 1 мм на 1000 мл жидкости и термостатируют ее в течение 48 - 72 ч при температуре 37^oC, а в последующем охлаждают при температуре 2 - 4^oC 24 ч, центрифугируют 15 мин при 2,5 - 3,0 тыс.об/мин, образовавшийся осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость используют в качестве иммунокорригирующего препарата. К недостаткам препарата следует отнести его недостаточное иммуностимулирующее действие и низкую биоэнергетическую активность.

Известен способ получения лейкоцитарной плазмы из крови крупного рогатого скота (авторское свидетельство N 1478403, A 61 K 35/16). Способ заключается в том, что к стабилизированной вышеуказанным раствором крови добавляют в соотношении 1:10 гомогенат селезенки, обмытой 1%-ным раствором формалина, консервируют раствором мертиолата или хинозола из расчета 1 мл 10% раствора на 1 л крови (100 мкг/мл), инкубируют 48 ч, целевой продукт получают после центрифугирования и отбрасывания осадка.

Недостатком известных способов является использование при стабилизации и консервировании крови и плазмы веществ, блокирующих обменные процессы и обладающих высокой степенью цитотоксичности (ЦПД). Так, трилон обладает блокирующим действием на некоторые фериентные процессы в клетках и тканях организма (Шумаков и др./ /Фармакологическая защита трансплантата. -М.: Медицина, 1983 - 232 с.). Мертиолат, риванол, формальдегид среди применяемых в биологических препаратах химических веществ обладают наиболее высокой степенью цитотоксического действия, и с учетом приведенных данных содержание только одного мертиолата в 1 мл плазмы лейкоцитарной содержится в 10,2 раза больше, чем его ЦПД - 8 мкг/мл (Червонская и др.//Цитотоксическое действие химических веществ, содержащихся в виде примесей в некоторых медицинских иммунологических препаратах (ЖМЭИ, 1988, с. 85 - 90).

Поливиниловый спирт блокирует диффузию тканевых ферментов (Дженкинс. Методы практической биохимии. - М.: Мир, 1978, с. 233).

Согласно рекомендациям Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических веществ, в готовой продукции должны отсутствовать потенциально опасные химические вещества (ВОЗ. Серия технических докладов. - 1982. - N 638. - C. 45 - 86). Кроме абиотичности указанные компоненты не обладают биоэнергeтической активностью и при получении препаратa значительное его количество выбрасывается с осадком.

За прототип нами принят способ получения плазмы крови свиной плазмотрансфузин-1, патент N 2050157, заявка N 5018966/15 от 06.11.91.

За прототип нами взят патент Франции N 2305191, кл. A 61 K 35/16, 26.11.76, который предусматривает получение препарата преальбумина сыворотки крови человека и позволяет повысить иммунологические защитные реакции организма. При этом способ предлагает многоэтапную очистку фракции крови, включающую фильтрацию по молекулярных ситах, фракционирование сульфатом аммония, две хроматографические очистки и электрофорез, которые делают способ получения чрезвычайно трудоемким. Фракционирование (рафинирование) иммунотропныx компонентов крови приводит к утрате их способности активно влиять на неспецифическую и иммунную реактивность организма.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача создания простого и эффективного технологического процесса, который позволяет при минимальном количестве и простоте стадий получить продукт с иммуномодулирующей активностью.

Предложенный способ состоит из нескольких технически простых операций, а именно стабилизации 900 мл крови млекопитающих на 100 г раствора, содержащего, г:
Натрий цитрат - 3,01
Натрий хлорид - 0,88
Глюкозу - 4,7
Кислоту янтарную - 0,4
Калий фосфорнокислый 2-замещенный - 2,05
Воды дистиллированной - Остальное
с последующим добавлением к ней пирогенала 90 мг/л и Т-активина 60 мг/л и инкубирования 48 ч при температуре 38 - 40^oC, отделение плазмы от форменных элементов крови, центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 мин, что позволяет получить готовый продукт с иммуномодулирующими свойствами.

Если предложенную совокупность существенных признаков нарушить, а именно кровь стабилизировать небиоэнергетическим стабилизатором, инкубировать без индукторов лимфокинов-пирогенала и Т-активина в указанных дозах или с индукторами, но при температуре ниже указанного режима, иммунологическая активность плазмы, достигаемая изобретением, не проявляется.

Настоящее изобретение характеризуется:
новизной - введение в кровь животного при получении плазмы перед инкубацией пирогенала в объеме 50 - 90 мг/л и Т-активина в объеме 30 - 60 мг/л;
изобретательским уровнем, подтверждаемым прогрессивностью относительно известных способов и неочевидностью (специалисты среднего уровня не используют данный способ для получения плазмы из крови животных в качестве иммунокорригирующего препарата);
очевидной возможностью серийного производства в медицине и ветеринарии, доступностью серийного использования.

Способ осуществляется следующим образом.

Цельную кровь животного донора, благополучного по инфекционным заболеваниям, в количестве 9 частей, отбирают в стерильных условиях в стерильный стеклянный или пластиковый мерный сосуд, содержащий 1 часть стабилизирующего раствора в следующим весовом соотношении и составе:
Натрия цитрат 3-замещенный - 3,01 - 3,02
Натрия хлорид - 0,88 - 0,90
Глюкоза - 4,70 - 5,00
Кислота янтарная - 0,37 - 0,40
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,03 - 2,05
Вода дистиллированая - Остальное
К 1 л нефракционированной стабилизированной крови предварительно добавляют пирогенал Т-активин, кровь инкубируют 48 ч при температуре тела животного, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Плазму крови собирают и укупоривают во флаконы по 200 мл.

Для определения иммунобиологических свойств полученных препаратов использовали линейных мышей (CBAxC57 B1), распределенных на следующие группы:
0-внутрибрюшинно вводили плазмотрансфузин (0,5 мл),
I-внутрибрюшинно вводили плазму интерфероновую, приготовленную по примеру 1 (0,5 мл) ПИ-1,
II-внутрибрюшинно вводили плазму интерфероновую, приготовленную по примеру 2 (0,5 мл) ПИ-2,
III-внутрибрюшинно вводили плазму интерфероновую, приготовленную по примеру 3 (0,5 мл) ПИ-3,
IV-контрольная группа мышей, которой вводили стабилизирующий раствор, разведенный в 10 раз дистиллированной водой с добавлением 125 мг пирогенала и 125 мг Т-активина на 1 л раствора.

Иммунный статус мышей оценивали по следующим показателям: величине гуморального иммунного ответа мышей на эритроциты барана (количество IM-антителообразующих клеток), лейкоцитозу, количеству Т-лимфоцитов, нейтрофилов (ранних, поздних, с рецепторами к комплементу).

Полученные данные отражены в таблице.

Как видно из таблицы, испытуемый препарат (ПИ-1, ПИ-2, ПИ-3) обладает выраженным иммунотропным действием. Выявлена достоверная стимуляция IM-антителогенеза на ЭБ в наибольшей степени в третьей опытной группе, т.е. ПИ-2. При этом отмечается повышение уровня ранних и поздних нейтрофилов, EAC_н, Т-, B-лимфоцитов на фоне снижения лейкоцитов крови.

Таким образом, интерфероновая плазма, приготовленная по примеру 2, отличающаяся оптимальным соотношением компонентов, обладает высокой иммунобиологической активностью и приводит к достоверной стимуляции IM-антителообразования, а также показателей клеточного иммунитета, что позволяет использовать ее для повышения резистентности организма сельхозживотных и человека.

Пример 1. К 100 г стабилизирующего раствора следующего состава:
Натрия цитрат 3-замещенный - 3,01
Натрия хлорид - 0,88
Глюкоза - 4,57
Кислота янтарная - 0,40
Калий фосфорнокислый 2-замещенный - 2,03
Вода дистиллированная - Остальное
приливают в стерильную донорскую кровь взрослой свиньи в количестве 900 мл, к ней добавляют пирогенал 50 мг/л и Т-активин 30 мг/л, инкубируют 48 ч при температуре 38 - 40^oC, плазму собирают центрифугированием в течение 15 мин при 1500 об/мин.

Пример 2. К 100 г стабилизирующего раствора следующего состава:
Натрия цитрат 3-замещенный - 3,01
Натрия хлорид - 0,88
Глюкоза - 4,70
Кислота янтарная - 0,40
Калий фосфорнокислый 2-замещенный - 2,05
Вода дистиллированная - Остальное
приливают стерильную кровь взрослой свиньи в количестве 900 мл, к ней добавляют пирогенал 90 мг/л и Т-активин 60 мг/л, инкубируют 48 ч при температуре 38 - 40^oC, плазму собирают центрифугированием в течение 15 мин при 1500 об/мин.

Пример 3. К 100 г стабилизирующего раствора следующего состава:
Натрия цитрат 3-замещенный - 3,02
Натрия хлорид - 0,90
Глюкоза - 5,0
Кислота янтарная - 0,40
Вода дистиллированная - Остальное
приливают стерильную донорскую кровь взрослой свиньи в количестве 900 мл, к ней добавляют пирогенал 125 мг/л и Т-активин 100 мг/л, инкубируют 48 ч при температуре 38 - 40^oC, а плазму собирают центрифугированием в течение 15 мин при 1500 об/мин.

Таким образом, в отличие от плазмотрансфузина плазма интерфероновая из крови свиней обладает большей иммунобиологической активностью. Способ может широко использоваться в свиноводстве в качестве средства, повышающего резистентность организма, что в свою очередь подтверждается результатами проведенных исследований.

Сущностью способа является введение в нефракционированную стабилизированную кровь перед инкубацией 50 - 90 мг/л пирогенала и 30 - 60 мг/л Т-активина. Способ позволяет повысить иимунобиологическую активность препарата - стимуляцию гуморального и клеточного звена иммунной системы лабораторных животных при его введении, что дает возможность использовать его для повышения резистентности организма сельскохозяйственных животных и человека. 1 табл.

Способ получения иммунокорригирующего препарата из крови млекопитающих, включающий ее обработку и центрифугирование, отличающийся тем, что к стабилизированной цельной крови добавляют пирогенал в концентрации 50 - 90 мг/л, Т-активин в концентрации 30 - 60 мг/л, инкубируют и после центрифугирования собирают плазму крови, содержащую целевой продукт.