СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии.

Иммуноферментный анализ является одним из высокочувствительных методов лабораторной диагностики. При его проведении предъявляются высокие требования к технике постановки, оборудованию, оснащению лаборатории.

Значительное внимание уделяется обеспечению качества иммуноферментных тест-систем разных производителей, в том числе оно осуществляется в настоящее время на государственном уровне.

Предприятия-производители выпускают различные иммуноферментные тест-системы, в том числе для диагностики вирусных гепатитов А, В, С, D, Е, ВИЧ-инфекции, сифилиса, хламидиоза, герпеса.

Основными показателями их качества являются:

- чувствительность - способность тест-системы обнаружить минимальное количество искомого вещества. Низкая чувствительность может привести к отрицательному ложному результату;

- специфичность - способность тест-системы детектировать искомое вещество;

- воспроизводимость - способность тест-системы давать устойчиво стабильный результат при многократном тестировании одного и того же образца.

Чем выше эти характеристики, тем качественнее тест-система.

Существуют национальные критерии чувствительности и специфичности отечественных препаратов. Например, для тест-систем на HBsAg с 2003 года регламентируется чувствительность 0,1 нг/мл.

С целью контроля качества тест-систем и других диагностических препаратов, как правило, используют стандартные тест-панели.

Тест-панель представляет собой подборку контрольных образцов, в которых с помощью тест-систем, международно-признанных как референтные, подтверждено наличие или отсутствие искомого компонента.

При производстве иммуноферментных диагностических систем для определения специфических антител, например антител к возбудителям инфекционных заболеваний, аутоантител, антител к специфическим маркерам, в качестве контрольного образца традиционно используются образцы сыворотки крови человека, содержащие антитела, аналогичные определяемым (аналиты) от пациентов с перенесенным или текущим патологическим процессом (инфекционным заболеванием, аллергией или злокачественными новообразованиями). Образование специфических антител является ответной реакцией организма на циркулирование биологических агентов, вызвавших данное инфекционное заболевание или патологический процесс.

Содержащий аналит контрольный образец должен отвечать следующим требованиям: специфичность (способность связываться с антигеном) и детектируемость (возможность определения антигенов с использованием антивидовых антител).

Тест-панели выпускаются немногочисленными зарубежными фирмами.

В России доступны стандартные панели ГИСК им. Тарасовича. Это панели сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам тестируемого антигена, сделанные на основе разведений, лиофилизированные. Они дешевле зарубежных и удобны для транспортировки. Однако при производстве сыворотки подвергаются сложной технологической обработке и их уже нельзя считать естественными образцами сыворотки крови человека.

Известен также способ получения стандартной контрольной сыворотки для анализа из человеческой или животной сыворотки путем добавления определенного буфера с физиологически близким значением рН с последующей лиофилизацией (DE 3324626 А1, 1985-01-17, МПК: G 01 N 33/96, BOEHRINGER MANNHEIM GMBH). Однако такие сыворотки не обеспечивают требуемого контроля качества тест-систем и иммуноблотов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ использования иммунных сывороток, содержащих специфические антитела ко всем основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител в качестве позитивных образцов при получении стандартной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов (патент RU 2094807 С1, МПК: G 01 N 33/96, G 01 N 33/53 - Научно-производственное объединение «Вектор»).

Использование в качестве контроля образцов сыворотки крови инфекционных больных полностью отвечает всем требованиям, однако имеет ряд существенных недостатков, особенно при промышленном производстве иммуноферментных диагностикумов. К основным недостаткам относятся:

1. Использование нативных сывороток крови инфекционных больных (в данном случае ВИЧ-инфицированных) представляет собой потенциальную инфекционную опасность как при производстве, так и при использовании контрольных панелей, содержащих данные сыворотки.

2. Неоднородность исходного материала и сложность стандартизации.

3. Труднодоступность для промышленного производства (в случае редких или эндемичных заболеваний).

4. Этические проблемы (использование сыворотки крови тяжелобольных людей).

5. Высокая стоимость.

В основу настоящего изобретения поставлена следующая задача: создание контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе, содержащих специфические антитела, обладающих высокой специфичностью и детектируемостью, но в то же время инфекционно безопасных, стандартных, доступных для промышленного производства и экономически выгодных.

Задача решается разработанным способом получения контрольного образца на основе гетерологичных химерных молекул иммуноглобулинов.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что в качестве контрольных образцов при создании контрольных панелей для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем и других препаратов, а также в качестве «входного контроля» в диагностических центрах и лабораториях предлагается использовать образцы, содержащие специфические антитела, полученные химическим или биологическим методом и состоящие из целых молекул или фрагментов иммуноглобулинов иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека. Фрагментом иммуноглобулина может, например, являться фрагмент Fab, Fab', F(ab')2.

Использование «суррогатных» или эрзац контрольных образцов, содержащих специфические антитела, в производстве иммуноферментных тест-систем позволяет исключить из процесса инфекционный материал (сыворотки больного человека) при сохранении возможности использования видоспецифических детектирующих антител.

Химерные молекулы иммуноглобулинов использовались ранее в основном для диагностики ин виво и для лечения разнообразных расстройств у людей и животных.

В частности, чтобы уменьшить степень иммунологической несовместимости, были сконструированы "химерные" или "гуманизированные" антитела, сочетающие элементы структуры человеческих антител и антител животного, например мыши.

Молекула антитела человека сохраняет все элементы тяжелых и легких цепей за исключением их вариабельных N-концевых отрезков, на место которых вводят соответствующие отрезки моноклонального антитела животного. Таким образом, антитело человека становится носителем антигенсвязывающего центра антитела животного.

Более совершенным вариантом является "гуманизированное" антитело, в котором антителу животного принадлежат лишь гипервариабельные элементы, формирующие антигенсвязывающий центр.

Однако до настоящего времени из уровня техники не выявлено способов получения контрольных образцов для контроля качества иммуноферментных диагностических систем и препаратов на основе подобных молекул.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Технология получения гетерологичных химерных молекул иммуноглобулинов.

Получение иммунных сывороток

Для получения антивидовых сывороток животных (например, коз) иммунизируют путем многоточечных инфекций подкожно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 200 мкг смеси рекомбинантных антигенов в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят животному в 1, 8, 15 дни иммунизации. После 30 дней перерыва животное иммунизируют ежедневно в течение 3-х дней, вводя 150 мкг белка в 0,7 мл физиологического раствора. Через 7-9 дней проводят отбор крови из сердца.

Приготовление растворов.

0,3% раствор этакридина лактата

3,0 г этакридина лактата растворяют в 1,0 л дистиллированной воды.

0,1 М фосфатный буферный раствор, рН 6,8

Готовят два раствора:

Раствор 1. 0,2 М раствор двузамещенного фосфата натрия.

71,64 г двузамещенного фосфата натрия 12-водного или 35,61 г двузамещенного фосфата натрия 2-водного растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор 2. 0,2 М раствор однозамещенного фосфата натрия.

31,21 г однозамещенного фосфата натрия 2-водного или 27,6 г двузамещенного фосфата натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Далее смешивают 245 мл раствора 1, 255 мл раствора 2 и 500 мл дистиллированной воды.

2 М раствор глицина

150,14 г глицина растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Выделение IgG из плазмы человека или иммунного животного.

К 100 мл плазмы человека добавляют 500 мл 0,3% раствора этакридина лактата, перемешивают и выдерживают 10-12 часов при температуре 2-8°С. Раствор фильтруют и добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 4%. После растворения раствор выдерживают 16-18 часов при температуре 2-8°С. Раствор фильтруют и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 20%, тщательно перемешивают и оставляют на 16-18 часов при температуре 2-8°С. Далее раствор центрифугируют в течение 30 минут при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят в 10 мл физиологического раствора. Концентрацию выделенных IgG рассчитывают по формуле С=ОП/1,4 мг/мл, где ОП - оптическая плотность образца, измеренная на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

Получение химерных молекул иммуноглобулинов (целая молекула)

Приготовление растворов

0,1 М раствор глютаральдегида

10,01 г глютаральдегида растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Фосфатно-солевой раствор (ФСР), рН6,8

22.5 г натрия фосфорнокислого 2-х замещенного 12-ти водного и 225,0 г натрия хлористого разводят в 1,0 л дистиллированной воды.

По 2 мг IgG человека и иммунного животного смешивают и доводят 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 6,8 до объема 25 мл. Затем, осторожно помешивая, по каплям вносят 2,8 мл 0,1 М раствора глютаральдегида и выдерживают 2 часа при комнатной температуре. Раствор диализуют против фосфатно-солевого раствора на протяжении 16-18 часов при температуре 2-8°С,

Получение химерных молекул иммуноглобулинов (Получение гибридных F(ab')2 фрагментов)

Приготовление растворов

0,1 M Na-ацетатный буфер, рН 4,5

13,6 г ацетата натрия 3-х водного и 630 мл 0,1 М уксусной кислоты разводят в 1,0 л дистиллированной воды.

0,1 М Na-фосфатный буферный раствор, рН 6,0

2,19 г натрия фосфорнокислого 2-х замещенного 2-х водного и 13,68 г натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-х водного разводят в 1,0 л дистиллированной воды.

5 мМ раствор ЭДТА

1,86 г ЭДТА растворяют в 1 л 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.

0,1 М раствор 2-меркаптоэтанола

7,81 г 2-меркаптоэтанола растворяют в 1 л 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.

Получение F(ab')2-фрагментов

Раствор антител диализуют против 0,1 М Na-ацетатного буфера рН 4,5 при +5°С.

Затем в раствор антител вносят пепсин из расчета 0,2 мг на 10 мг IgG.

Смесь инкубируют при 37°С в течении 18-24 ч.

рН раствора доводят 1М NaOH до 8,0.

Раствор IgG в буфере рН 8,0 наносят на колонку с сефадексом G-150, предварительно уравновешенную 0,1 M Na-боратным буфером, рН 8,0.

б. Концентрацию F(ab)2-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения ε F(ab)2=1,48 г - 1. л. см-1

Получение гибридных F(ab')2-фрагментов

Готовят раствор, содержащий 0,3 мг F(ab')2-фрагментов IgG козы и 2-2,5 мг F(ab')2-фрагментов IgG человека в 0,45 мл 0,1 М Na-фосфатном буфере рН 6,0.

Добавляют 0,05 мл 0,1 М 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.

Смесь инкубируют при 37°С в течение 1,5 ч.

Освобождают от солей на колонке (0,9×15 см) с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 0,6 с 5 мМ ЭДТА.

Получение контрольного образца, содержащего специфические антитела.

Полученный раствор химерных молекул иммуноглобулинов или их фрагментов используют для приготовления контрольного образца. Для этого осуществляют метод кратного разведения раствора химерных молекул иммуноглобулинов в фосфатно-солевом растворе (ФСР) 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и т.п., контролируют в ИФА и выбирают раствор той степени разведения, значение оптической плотности которого не ниже 1,0.

Преимущество предлагаемого способа получения контрольных образцов химерных молекул иммуноглобулинов, содержащих специфические антитела, используемых при конструировании иммуноферментных тест-систем, при создании контрольных панелей для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем, в качестве «входного контроля» в диагностических центрах и лабораториях заключается в следующем:

1. Безопасность при производстве и использовании (исключена работа с инфекционным материалом)

2. Возможность получения стандартного материала в неограниченном количестве.

Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Способ включает получение контрольных образцов путем приготовления раствора гетерологичных химерных антител, состоящих из целых молекул или фрагментов иммуноглобулина, выделенных из сыворотки иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека в фосфатно-солевом буфере, рН 6.0, с последующим приготовлением различных разведений в указанном буфере, их контролем в ИФА и отбором разведений, значения оптической плотности которых не ниже 1,0. Изобретение обеспечивает получение контрольных образцов, содержащих специфические антитела, обладающих высокой специфичностью и детектируемостью и в то же время инфекционно безопасных, стандартных и экономически доступных. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения контрольных образцов, содержащих специфические антитела, используемых для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем и препаратов, отличающийся тем, что готовят раствор гетерологичных химерных антител, состоящих из целых молекул или фрагментов иммуноглобулина, выделенных из сыворотки иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека в фосфатно-солевом буфере, рН 6,0, разводят его методом кратных разведений в указанном буфере, контролируют в ИФА и отбирают растворы со степенью разведения, значения оптической плотности которых не ниже 1,0.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фрагмента иммуноглобулина используют фрагмент Fab, Fab', F(ab')2.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки иммунизированного животного используют антивидовую сыворотку козы.