СПОСОБ ОБРАБОТКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОТЕЗОВ ДЛЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ Российский патент 1998 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к предимплантационной обработке биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии.

В настоящее время разработки по повышению тромборезистентности изделий, контактирующих с кровью ведутся в двух основных направлениях: использование гидрогелей и иммобилизация физиологически активных веществ.

Использование гидрогелей представляет собой обработку поверхности материала полиалкиленгликолем [1, 2], заключающуюся в его связывании с поверхностью.

Такая обработка позволяет достичь очень короткосрочный эффект повышения тромборезистентности поверхностей материалов за счет повышения гидрофильности.

При иммобилизации физиологически активных веществ используются в основном антикоагулянты: герудин [3], гепариноподобные вещества (сульфированный хитозан) [4] и гепарин.

Наиболее надежной, эффективной, стабильной по свойствам является гепаринизация поверхности материалов.

Гепаринизация материалов и изделий проводится с использованием различных типов связывания гепарина на поверхности.

При использовании ионных механизмов [5, 6, 7, 8, 9] связывания не происходит достаточно прочного присоединения гепарина на поверхности ткани, чем определяется его быстрое вымывание с поверхности током крови. В связи с этим возникает необходимость присоединения достаточно большого количества гепарина ( от 0,05 до 50% от общей массы материала) для поддержания его оптимальной концентрации в приповерхностном слое.

Предпочтительным является более прочное ковалентное связывание гепарина [10].

Известен способ приготовления антитромбогенного материала, содержащего гепаринизированный коллаген в качестве антитромбогенного компонента [11], что обеспечивается связыванием протамина коллагена через полиэпоксидную среду и гепаринизацию коллагена за счет связывания гепарина и протамина.

Известен способ консервирования биоткани для протезирования клапанов сердца и сосудов [12], в котором производят замену традиционного консерванта - глютарового альдегида на новый сшивающий и стерилизующий агент из класса эпоксисоединений - 2-5%-ный раствор диглицидилового эфира этиленгликоля, который позволяет полностью подавить кальцификацию биоткани, повысить тромборезистентность протезов и усилить данный эффект дополнительным ковалентным присоединением гепарина путем обработки раствором гепарина с концентрацией не менее 100 МЕ/мл.

Взятый от свежезабитых животных, очищенный и отмытый от крови биоматериал погружают в 5% раствор диглицидилового эфира этиленгликоля при pH 7,4 и температуре 20^oC, где он консервируется в течение 21 суток, после чего инкубируют в течение 1 суток в растворе гепарина с концентрацией 100 МЕ/мл и хранят в 2% растворе диглицидилового эфира этиленгликоля до использования.

Наиболее эффективное и большее по количеству связывание гепарина за счет непрореагировавших с биоматериалом эпоксигрупп может быть осуществлено при использовании не моно- и диэпоксисоединений, а смесей диэпоксисоединений с полиэпоксисоединениями.

Технической задачей изобретения является повышение тромборезистентности биоткани с одновременным подавлением кальцификации.

Поставленная задача достигается применением в качестве сшивающего и стерилизующего агента смеси эпоксисоединений различного состава с последующими отмывкой в физиологическом растворе, обработкой гепарином при концентрации гепарина не менее 75 ед/мл при pH 3,0 - 8,0, температуре 20-45^oC, и этилированием.

Способ осуществляется следующим образом. Обработку материала проводят в три этапа.

1. Нативную ткань от свежезабитых животных (свиней, телят), взятую не более 6 часов с момента убоя, помещают в 2-5% раствор эпоксидных смесей, приготовленных на буфере при pH 3,0-11,0 при температуре 4-45^oC, в течение 2-21 суток. Концентрация раствора эпоксидных смесей ниже 2% не обеспечивает стерильности материала в процессе консервации, при концентрации раствора выше 5% обработка нецелесообразна, т.к. достигается полная сшивка.

Эпоксидные смеси представляют собой конкретные фракции веществ, получаемых после отгонки мономерного основного вещества (диглицидилового эфира этиленгликоля) в интервале температур вакуумной разгонки 100-120^oC (ВАИ-1) и 120-140^oC (ВАИ-2) или после отгонки основного мономера диглицидилового эфира диэтиленгликоля в интервале температур вакуумной разгонки 120-140^oC (ВАИ-3).

Использование той или иной фракции эпоксисоединений позволяет регулировать биомеханические свойства (эластичность, прочность) и биологическую порозность получаемого в результате обработки материала. Чем выше молекулярный вес фракции (ВАИ-1< ВАИ-2<ВАИ-3), тем выше биологическая порозность и упругодеформативные свойства ткани.

Обработка тканей при температуре ниже 4^oC приводит к механическому разрушению ткани за счет кристаллизации воды, при температуре выше 45^oC происходит температурная коагуляция белка.

При консервации в течение 1-21 суток происходит достаточная сшивка коллагена. Сшивающая активность консерванта зависит от состава самой фракции эпоксисоединений и от температуры консервации.

По окончании консервации фракциями эпоксисоединений в ткани остается большое количество свободных эпоксигрупп, за счет которых может быть выполнена дополнительная модификация ткани, а именно - связывание биологически активных веществ, способных повысить тромборезистентность (гепарин и др.) и антибактериальную активность за счет присоединения антимикробных препаратов, имеющих в своей структуре основные или кислотные группы.

2. Промывка ткани физиологическим раствором в течение одного часа с по меньшей мере трехкратной сменой избытка физиологического раствора и обработка раствором гепарина с концентрацией не менее 75 ед/мл при pH 3,08-8,0, температуре 20-45^oC в течение 2-16 часов. С повышением температуры необходимое время обработки гепарином уменьшается.

Проведение обработки при температуре ниже 20^oC не целесообразно, т.к. значительное увеличивается время гепаринизации, а при температуре выше 45^oC возникает возможность термического поражения тканей.

После этого осуществляют промывку до отсутствия гепарина в промывных водах. Об обмотке судят по отсутствию фиолетового окрашивания промывной воды при растворении красителя - толуидинового синего.

3. Обработка 70%-ным водным раствором этанола в течение 40 ^oC 60 минут с последующей отмывкой в физиологическом растворе с по меньшей мере двухкратной сменой раствора.

Этилирование позволяет повысить прочность связывания, тем самым увеличить количество иммобилизованного гепарина.

Для хранения обработанные протезы помещают в 2-5%-ный раствор используемого эпоксисоединения. Таким образом на 1-ом этапе обработки возникает более высокая плотность сшивки и возможность ее регулирования, а также возможность регулирования биомеханических свойств, большее средство к гепарину и способность связывания обработанной ткани с любыми биологически активными веществами, имеющими амино-, карбокси- или гидроксигруппы, в том числе и антимикробные препараты.

Пример 1. (прототип)
Образцы створок ксенобиопротезов клапанов сердца помещают в 5%-ный раствор диглицидилового эфира этиленгликоля (ДЭЭ) в буферном растворе с pH приблизительно 7,4 при 20^oC и выдерживают 21 сутки, затем промывают физиологическим раствором и обрабатывают водным раствором гепарина с концентрацией не менее 75 МЕ/мл при pH 4,5 при температуре 20^oC в течение 8 часов, затем 5-ти кратно промывают избытком дистиллированной воды.

Обработанные образцы помещают для хранения в 5%-ый раствор используемого эпоксисоединения.

Количество гепарина в образцах (в мкг) оценивают фотоколориметрически с использованием красителя толуидинового синего и рассчитывают на 1 г сухой биоткани.

В зависимости от условий обработки ДЭЭ количество присоединенного гепарина можно получить от 600± 50 до 1100 ± 100 мкг/г.

Пример 2.

Образцы створок аортальных клапанов от свежезабитых свиней помещают в 2%-ный раствор смеси (ди- и поли-) эпоксисоединений (ВАИ-1) в буферном растворе при pH 4,5 при температуре 20^oC выдерживают 21 сутки. Затем трехкратно промывают избытком физиологического раствора и обрабатывают водным раствором гепарина с концентрацией не менее 75 МЕ/мл при pH 3,0 при температуре 20^oC в течение 8 часов. После этого 5-ти кратно отмывают избытком дистиллированной воды и помещают для хранения в 2-ый раствор используемого эпоксисоединения, предварительно оценив количество гепарина в образцах биоткани (мкг/г сухой биоткани). Дистиллированная вода в примере используется только в связи с необходимостью оценки количества гепарина.

Количество гепарина в данных условиях обработки составляет 1800 ± 100 мкг/г.

Результаты обработки в зависимости от параметров условий обработки приведены в таблице.

В примерах 4, 10, 13 и 14 проводят обработку сегментов внутренней грудной артерии быка.

В примерах 13 и 14 после обработки гепарином и промывки физиологическим раствором биоткань обрабатывают 70%-ным раствором этанола в течение 1 часа, после чего отмывают биоткань в физиологическом растворе и помещают для хранения в раствор соответствующего эпоксисоединения. Количество присоединенного гепарина в примере 13 составляет 2000 ± 100 мкг/г, что превышает количество гепарина в примере 4 (1820 ± 100 мкг/г), где обработка 70%-ным раствором этанола не проводилась.

Аналогично в примере 14 количество гепарина составляет 1850 ± 100 мкг/г по сравнению с примером 10, где количество гепарина составляет 1600 ± 200 мкг/г.

Сопоставление результатов обработки биоткани известным способом и предлагаемым с использованием различных режимов показывает, что количество присоединенного гепарина, а следовательно, и тромборезистентный эффект в предлагаемом способе без этилирования в 1,6-3,0 раза, а с применением обработки этанолом эта разница увеличивается до 1,8-3,3 раза больше, чем в прототипе. Это достигается как применением специально выделенных (полученных) фракций эпоксисоединений, содержащих увеличенное количество эпоксигрупп, так и предлагаемыми технологическими приемами.

Увеличенное содержание эпоксигрупп позволяет связывать и любые другие биологически активные вещества, имеющие амино-, кабокси- или гидроксигруппы, в том числе и антимикробные препараты. При этом сохраняется высокий антикальцинозный эффект. Количество кальция в экспериментальных исследованиях в течение более, чем трех месяцев, остается на метаболическом уровне.

Источники информации
1. Заявка Японии N 3-66904, МКИ A 61 L 33/00.

2. Заявка Японии N 3-64146, МКИ A 61 L 33/00.

3. Заявка ЕПВ N 0357242, МКИ A 61 L 33/00, 1990.

4. Заявка Японии N 1-49503, МКИ A 61 L 33/00, 1989.

5. Авторское свидетельство N 261635, МКИ A 61 F 2/06, 1970.

6. Заявка Японии N 61-20309, МКИ A 61 L 33/00, 1987.

7. Заявка РСТ N 91/01767, МКИ A 61 L 33/00, 1991.

8. Заявка Японии N 61-20309, МКИ A 61 L 33/00.

9. Заявка ЕПВ N 0350161, МКИ A 61 L 33/00, 1990.

10. Заявка ЕПВ N 0351314, МКИ A 61 L 33/00, 1990.

11. Патент США N 4806595, МКИ A 61 F 2/04, 1989.

12. Патент РФ N 2008767, МКИ⁵ A 01 N 1/00, 1994.

Способ заключается в обработке нативной ткани от свежезабитых животных смесью эпоксисоединений при температуре 4 - 45^oC в течение 2 - 21 суток с последующей обработкой раствором гепарина с концентрацией не менее 75 ед/мл при температуре 20 - 45^oC в течение 2 - 16 ч и этилированием 70%-ным водным раствором этанола. Способ обеспечивает повышение тромборезистентности биоткани с одновременным подавлением кольцификации. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ обработки биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии, включающий обработку их раствором эпоксидных соединений и раствором гепарина, отличающийся тем, что обработку проводят 2 - 5%-ным раствором смеси эпоксисоединений различного состава, а после обработки раствором гепарина дополнительно выполняют обработку этанолом. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку 2 - 5%-ным раствором смеси эпоксисоединений различного состава проводят при pH 3,0 - 11,0, температуре 4 - 45^oC в течение 1 - 21 суток. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку гепарином проводят раствором гепарина с концентрацией 75 ед/мл при pH 3,0 - 8,0, температуре 20 - 45^oC в течение 2 - 16 ч. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку этанолом выполняют в течение 40 - 60 мин.