СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ Российский патент 1998 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к области генетики, связанной с расширением спектра исходных форм селекции путем искусственного создания новых мутантных форм растений, в частности, при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения.

Одна из основных проблем, с которыми сталкиваются при проведении трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, это нуклеазная активность прорастающей пыльцы. Проблема до настоящего времени не решена, хотя было предложено несколько вариантов ее устранения:
1. отмывка пыльцевых зерен от нуклеаз;
2. добавление к донорной ДНК иной высокомолекулярной ДНК в качестве ингибирующего субстрата для нуклеаз;
3. использование в качестве нуклеазных ингибиторов неорганических солей;
4. применение липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна.

Попытки устранения нуклеазной активности прорастающей пыльцы способами 1 - 3 не привело к сколько-нибудь значимым практическим результатам. Возможно, это было связано с тем, что воздействию подвергалось само пыльцевое зерно или нуклеазы зерна (отмывка от нуклеаз, воздействие неорганических солей и т. д. ). При этом наиболее вероятным представляется общее нарушение развития пыльцевого зерна при нарушениях отдельных этапов или механизмов этого процесса. В этом смысле способ 4 предпочтительней, т.к., применение липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна основано на естественных биологических механизмах прорастающего пыльцевого зерна и не требует подавления его нормальной жизнедеятельности. Возможно, именно поэтому трансформация по способу 4 дала наибольший процент удачных работ.

Наиболее близким к заявленному способу трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения является способ трансформации посредством опыления-оплодотворения с применением липосом для доставки экзогенной ДНК в пыльцевые зерна [1]. В этом способе сохранение экзогенного генетического материала от гидролитического расщепления нуклеазами пыльцевых зерен достигается посредством упаковки экзогенной ДНК в предварительно выделенные липосомы с последующей доставкой липосом в прорастающие пыльцевые зерна. При этом упакованный в липосомы генетический материал в процессе доставки в прорастающее пыльцевое зерно является недоступным для расщепления нуклеазами пыльцевых зерен.

Недостаток указанного способа, принятого за прототип, заключается в высоком уровне технологической сложности при подготовке и проведении процессов опыления-оплодотворения, что делает его весьма затруднительным при массовом использовании.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании универсального способа трансформации посредством опыления-оплодотворения пыльцой с экзогенным генетическим материалом, доступного для массового применения в селекционной практике.

Технический результат, который может быть получен от использования изобретения, заключается в значительном повышении эффективности трансформации посредством процесса опыления-оплодотворения, получения при этом широкого спектра наследственно измененных форм растений для нужд селекции.

Указанный технический результат достигается тем, что производят воздействие электромагнитного поля сверхвысокочастотного (СВЧ) диапазона на пыльцевые зерна, к которым добавляется экзогенный генетический материал. При этом частоту электромагнитного поля выбирают из интервала от 1000 МГц до 3000 МГц, интенсивность поля выбирают для непрерывного режима воздействия из интервала от 10² Вт/м² до 10⁴ Вт/м² и для импульсного режима воздействия из интервала от 10³ Вт/м² до 10⁶ Вт/м². При импульсном воздействии СВЧ-поля длительность импульсов выбирают из интервала от 10^-2 с до 10^-4 с, а длительность пауз во всех случаях выбирают в 100 раз большей, чем длительность импульсов.

Известно, что молекула ДНК в естественных условиях окружена гидратной оболочкой из упорядоченно расположенных молекул воды [2]. Наличие водной оболочки обусловлено возникновением водородных связей между дипольными молекулами воды и разнополярными группировками молекул ДНК. Водное окружение ДНК представляет собой несколько слоев, причем молекулы ближайшего к ДНК водного слоя обладают наибольшей силой сцепления с ДНК. По мере удаления водного слоя от ДНК сила сцепления его молекул с ДНК ослабевает из-за экранирования электростатического взаимодействия молекулами воды, более близко расположенными к ДНК, и вследствие теплового молекулярного движения, "размывающего" эффект упорядоченного расположения дальних от ДНК молекул воды. Действие нуклеаз на ДНК происходит только в водном окружении при постепенном вытеснении молекул воды от ДНК молекулами нуклеаз в тех местах, в которых нуклеазы обладают наибольшим химическим сродством к участкам ДНК. Между тем электромагнитное поле в области СВЧ-частот является резонансным для дипольных молекул воды с пиком резонанса в области 1500 - 2000 МГц. Энергия электромагнитного поля с указанной частотой максимально поглощается избирательно молекулами воды, вследствие чего они приобретают колебательное вращательное движение. Меняя интенсивность СВЧ-поля, можно подобрать такую плотность энергии СВЧ-поля, которой будет достаточно для приведения во вращательное колебательное движение молекул воды в слоях, непосредственно не примыкающих к ДНК, но недостаточно для приведения во вращательное движение молекул воды, непосредственно примыкающих к молекуле ДНК. При этом не будет нарушаться пространственная конформация молекулы экзогенной ДНК и вместе с тем вокруг нее будет создан слой вращающихся осцилляторов из молекул воды, препятствующий нормальному воздействию нуклеаз на ДНК.

Правильный выбор интенсивности СВЧ-поля в заявляемом способе имеет особое значение. Недостаточная интенсивность поля не позволит создать защитного слоя осцилляторов вокруг ДНК, избыточная интенсивность приведет к осциллированию слоя молекул воды, непосредственно примыкающих к ДНК, что неизбежно вызовет нарушение ее пространственной конформации. Расчеты показывают, что должно использоваться электромагнитное излучение (ЭМИ) с частотами от 1000 МГц до 3000 МГц с интервалами интенсивностей в непрерывном режиме облучения от 10² Вт/м² до 10⁴ Вт/м² и в импульсном от 10³ Вт/м² до 10⁶ Вт/м². При этом в импульсном режиме длительность импульсов должна будет составлять от 10^-2 с до 10^-4 с, длительность пауз между импульсами во всех случаях будет в 100 раз превышать длительность самих импульсов. Конкретный выбор параметров СВЧ-поля должен определяться конкретным объектом трансформации, так как пыльцевые зерна разных видов имеют на мембране различные наборы и концентрации нуклеаз, различное водосодержание и различные безопасные пороги интенсивностей СВЧ-поля, не приводящих к нарушению нормальных процессов жизнедеятельности.

В таблице приведены результаты деградации плазмиды pBR-322, выдержанной в питательной смеси с прорастающей пыльцой томата "Факел" в отсутствие импульсного СВЧ-поля и при облучении.

Для используемой пыльцы предварительно были подобраны параметры СВЧ-поля, не ингибирующие ее нормальное прорастание. Облучение СВЧ-полем производилось импульсно, длительность импульса составляла 10^-3 с, длительность паузы - 10^-1 с, интенсивность СВЧ-поля I была равна 10³ Вт/м², частота СВЧ-поля v была равна 2500 МГц.

Из таблицы видно, что при контакте с пыльцой в обычных условиях уже через 10 минут выдерживания наблюдалась 100% деградация плазмиды. При наличии же СВЧ-поля даже через 60 минут выдерживания степень деградации суперспирализованной формы плазмиды не превысила 25%.

Таким образом, предложен способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения, в котором сохранение в течение определенного времени экзогенного генетического материала, находящегося в контакте с прорастающей пыльцой, обеспечивается воздействием СВЧ-поля, снижающего возможность взаимодействия нуклеаз пыльцы и экзогенной ДНК на поверхности пыльцевых зерен.

Методика реализации предложенного способа трансформации растений посредством опыления-оплодотворения с сохранением экзогенного генетического материала на поверхности пыльцевого зерна посредством использования СВЧ-излучения состоит из трех обязательных этапов, при этом конкретные количественные значения величин на каждом этапе подбираются индивидуально для каждого вида пыльцы.

1. Определение нижней границы интенсивности СВЧ-поля в частотном диапазоне от 1000 МГц до 3000 МГц, не ингибирующего нормальное прорастание пыльцы, и последующее опыление-оплодотворение с ее участием.

2. Помещение планируемого экзогенного генетического материала в среду с прорастающими пыльцевыми зернами и одновременное воздействие СВЧ-поля с интенсивностью, определенной из п. 1, и с набором частот из диапазона от 1000 МГц до 3000 МГц. После каждого облучения должен быть проведен анализ целостности экзогенной ДНК, например, методом гель-электрофореза. Из серии опытов выбирается частота СВЧ-поля, при которой обеспечивается максимальное сохранение экзогенного генетического материала.

3. На основании полученных значений интенсивности и частоты СВЧ-поля можно проводить массовое опыление растений в полевых условиях. Предварительно собранная с растений и подготовленная пыльца в зависимости от вида растения может
а) помещаться в питательную смесь с одновременным добавлением в нее экзогенного генетического материала и воздействием СВЧ-поля в течение времени, достаточного для транспорта экзогенного генетического материала с поверхности внутрь пыльцевого зерна, но не превышающего время прорастания данных пыльцевых зерен, после чего пыльцевые зерна наносятся непосредственно на рыльце пестика,
б) помещаться на рыльце пестика с одновременным добавлением экзогенного генетического материала и воздействием на рыльце пестика СВЧ-поля. Этот путь представляется более предпочтительным для растений с малым временем прорастания пыльцевых зерен, например для кукурузы.

Применение заявленного способа в народном хозяйстве не представляет значительных трудностей, не связано с большими затратами на его осуществление и может иметь большое значение для экспериментального мутагенеза и селекции с целью создания новых искусственных мутантных и рекомбинантных форм растений с нужными народнохозяйственными признаками.

Источники информации
1. Ahokas H. Transfection by DNA-associated liposomes evidenced of pea pollination. // J. Hereditas. 1987, v. 106, p. 129 - 138 - прототип.

2. Давыдов А. С. Биология и квантовая механика, Киев, "Наукова думка", 1979, с. 45 - 53.

Способ предназначен для селекции растений. Ингибирование нуклеазной активности прорастающих пыльцевых зерен достигается воздействием на пыльцевые зерна сверхвысокочастотного электромагнитного поля, частота и интенсивность которого выбираются для каждого вида пыльцы по предлагаемой методике. 3 з.п.ф-лы., 1 табл.

1. Способ трансформации растений посредством опыления-оплодотворения пыльцой с экзогенным генетическим материалом, отличающийся тем, что экзогенный генетический материал добавляют к пыльце с одновременным воздействием на пыльцу электромагнитным полем сверхвысокочастотного диапазона. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что электромагнитное поле используют с частотой 1000 - 3000 МГц. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что интенсивность электромагнитного поля выбирают для непрерывного режима воздействия из интервала 10² - 10⁴ Вт/м² и для импульсного режима воздействия из интервала 10³ - 10⁶ Вт/м². 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность импульсов при импульсном режиме воздействия электромагнитного поля выбирают из интервала 10^-2 - 10^-4 с, а длительность пауз во всех случаях в 100 раз превышает длительность самих импульсов.