Способ генетической трансформации растений Советский патент 1992 года по МПК C12N15/87 

Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано в селекции культивируемых растений.

Известен способ генетической трансформации растений, включающий проведение Ь4икроинъекции чухсеродной ДНК в протопласты растений.

Известен также способ, согласно которому экзогенную ДНК вводят в протопласты растений методом электропорации.

Однако указанные способы мало пригодны для многих однодольных растений, в частности злаковых. Применение данных способов затруднено тем. что для злаковых обычно сложно получить растение из протопластой.

Известен также способ генетической трансформации, предусматривающий vicпользование бактерий Agrobacterium

tumefaclens для переноса генов с помощью векторов, основанных на Т1-плазмиде.

Такой способ практически неприемлем для однодольных растений, поскольку A.tumefaciens не обладает вирулентностью по отношению к ним.

Известен способ генетической трансФормации растений, например табака, заключающийся в том. что пыльцу проращивают на среде, содержащей экзогенную ДНК ввиде Т1-плазмиды. Проросшую пыльцу наносят на рыльце пестика. Затем клетки ткани анализируют на нопалинсинтетазную активность, на основе чего судят о генетической трансформации.

Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому рыльца растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды. содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности к

канамицииу. Методом электропорации вводят плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыляют и селекцию трансформантов в полученном потомстве проводят по устойчивости к канамицину.

Однако известные способы неприемлемы для растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранения, например кукурузы и других злаковых.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, заключающийся в том, что с растений кукурузы собирают пыльцу, готовят пасту из смеси: пыльца, раствор.сахарозы, экзогенная ДНК, Экзогенную ДНК выделяют из линий кукурузы, содержащих в себе маркерные гены окраски эпидермиса семян. Приготовленную смесь наносят на рыльца пестиков растений. Частоту трансформации оценивают по частоте появления на початках окрашенных зерен.

Недостатки этого способа заключаются в том что

трансформация носит невекторный характер;

отсутствует легко селектируемый мар-. керн уй ген, наличие которого позволило бы быстро и эффективно отобрать трансформанты;

отсутствует возможность получения достаточного количества семян, необходимых для анализа, ввиду их слабой завязываемости.

Цель изобретения - увеличение эффективности трансформации.

Способ включает обработку рыльца пестика растений смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе Т -плазмид, например, серии PGV, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам, npvi этом плазмиду смешивают с раствором сахарозы, борной кислотой и Са(МОз)2, причем смесь сразу же наносят на рыльце пестика и немедленно производят опыление, а отбор трансформированных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, г/л: Са(ЫОз)2 0,S; КН2Р04 0,2; MgO-i х 7Н20 0,2; KNOa 0,2; FeP04 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл.

Готовят смеси следующего состава: 0,40,5 М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Ca(N03)2; РН 5,5-6,8; 40-100 мкг/мл плазмидной ДНК (например, PGV1501), содержащей ген устойчивости к канамицину.

П р им 6 р 1. В смесь, включающую 0,4 М сахарозы, 0,018% борной кислоты, 0,04% Са(МОз)2, (рН 5,5-5,8), непосредственно перед нанесением на рыльце пестиков вводят плазмидную ДНК (PGV 1501), содержащую ген устойчивости к канамицину, в количестве 70 мкг/мл. На каждый початок кукурузы

линии Rfs (предварительно изолированный) сразу же наносят 200 мкл смеси, после чего немедленно опыляют его же пыльцой. После созревания семена проращивают на среде Кнопа. Затем 1-2-дневные проростки переносят на среду Кнопа, содержащую канамицин в концентрации 400 мкг/мл. Через 10-14 сут. растения, прошедшие отбор на этой среде, переносят з грунт в условиях климокамеры (20 люкс - 16 ч, температура

днем 28 ±1°С, ночи19 ± 1°С) и доращивают для пересадки в открытый грунт.

Часть растений на стадии проростков анализируют методом блотгибридизации по Саузерну для доказательства интеграции в

геном растения интересующего гена.

Частота трансформантов, полученных при использовании предлагаемого способа, составляет около 0,6%.

Пример 2. В смесь, содержащую 0,45

М сахарозы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Ca(N03)2, рН 5,5-5,8, вносят плазмидную ДНК, содержащую ген устойчивости к канамицину. Смесь наносят на рыльце пестика томата и немедленно опыляют. Созревшие семена проращивают на среде Кнопа с канамицином (100 мкг/мл). При использовании сорта томата Факел частота трансформации составляет 1,45%.

В прототипе на один ген частота

трансформации составляет около 0,3%, т.е. получен,чая в результате использования предлагаемого способа частота трансформации в 2 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформанто.в методом блот гибридизации по Сауэерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроился в растительный геном,

Таким образом, оценка следующих поколений предполагаемых трансформантов отбором на селективных средах и методом блот-гибридизацми показывает эффективность данного метода трансформации.

Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Способ позволяет также сократить время между сбором пыльцы, приготовлением смеси и опылением растений, что не вызывает ощутимого воздействия физических факторов и нуклеаз на ДНК, пыльцу и пыльцевые трубки (механические разрывы, деградация и др.). Способ может быть использован для целенаправленной трансформации генома растений.

Формула изобретения

Способ генетической трансформации растений, включающий смешивание экзогенной ДНК с пыльцой растения, нанесение полученной смеси на рыльце пестика в растворе сахарозы, отбор трансгенных растений, отличающийся тем, что, с целью увеличения эффективности трансформации, в качестве экзогенной ДНК используют

вектор на основе Т1-плазмиды, несущей устойчивость к антибиотикам и встроенный ген. смешиваниес пыльцой проводят в растзоре 0,4-0,5 М сахарозы, 0,017-0,020% борной кислоты, 0,038-0,042% Са(МОз)2, рН 5,5-5,8, после нанесения на рыльце пестика немедленно проводят опыление,а отбор трансгенных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мя.

0

Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано вселекции культивируемых растений. Цель изобретения - увеличение эффективности трансформации. Способ заключается в том, что определенные гены переносят в геном растенмя посредством вектора на основе Ti-плазмиды. содержащей маркерный ген (устойчивость к антибиотику), причем опыление проводят после нанесения плаз- мидной ДНК в растворе сахарозы, борной кислоты и Са(ЫОз)2, а отбор трансформантов проводят на еелективных средах, в частности среде Кнопа. содержащей канамицин. Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Частота трансформации составляет 0.6-1.45%.