СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ПУТЕМ ОПЫЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N15/82 

Изобретение относится к способу трансформации размножающихся путем опыления растений посредством введения экзогенной ДНК в незрелые и культивированные in vitro пыльцевые зерна.

Известны способы трансформации растения, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки (Goodman и др. Science 236; 48-53, 1987). Agrobacterium tumefaciens представляет собой наиболее используемый "вектор". Однако использование этих бактерий ограничено определенным кругом хозяев. Применение A. tumefaciens в качестве вектора зависит также от регенерации in vitro культивированных соматических клеток, с тем чтобы продуцировать трансгенные растения, которые в состоянии образовывать трансгенные потомки. Прямая трансформация через электропорацию, липосомы, микроинъекцию и с помощью других физико-химических методов зависит от применения протопластов в качестве целевых клеток. Регенерация из протопластов однако затруднительна, и в случае многих видов невозможна.

В качестве альтернативы для трансформации предложена другая целевая клетка пыльцевое зерно. Согласно Hess D. Plenum Press, Нью-Йорк, 519/537 (1975), можно включать в зрелую пыльцу чужеродную ДНК и вносить эту чужеродную ДНК в яйцеклетку с помощью естественного опыления и оплодотворения. Подобным образом облученная рентгеновскими лучами пыльца должна быть в состоянии транспортировать фрагменты облученного генома в яйцеклетку. Pandey, Nature 256; 310-313:1975). Dewet /WO 85/01856/ сообщил, что кукурузная пыльца, которая трансформирована ДНК, включает эту ДНК при прорастании и после опыления транспортирует в яйцеклетку.

Несмотря на потенциальное большое значение трансформации через пыльцу до сих пор еще ни в одном случае не удалось повторить результаты Hess Pandey и De wet в других лабораториях. Так, например, Engvild /Theor Appl. 69, 457-461, 1985/ не смог воспроизвести опыты Pandey. При опытах Hess (1975) и De wet включение экзогенной ДНК в пыльцевое зерно и ее генетическое и молекулярное обнаружение представляют собой критический момент аргументации. Фенотипическое и физиологическое обнаружение недостаточны (Hess: в: Genetic manipulation in plant breeding de Gruyter, Берлин, Нью-Йорк, 803-811, 1986). Также опыты Sanford и др. (Biotechnology and ecology of pollen (Mulcahy D. ed) Springer, Heidelberg, Нью-Йорк, 71-75, 1985) показали, что совместное культивирование зрелой пыльцы Nicotiana langsdorfii c агробактериями не приводит к переносу. В обширных опытах Negrotiu, Heberle-Bors и Potrykus (там же, 65-70, 1986) не удалось перенести ген неомицинфосфатотрансферазы, который придает резистентность к канамицину, (Shillito и др. Biotechnology, 3, 1099-1103, 1985) в зрелую пыльцу. С помощью методов, которые соответствуют новейшему уровню техники, следовательно, невозможно подтвердить утверждения Hess и De wet. То, что результаты Hess и De wet не получены при осуществлении, можно объяснить тем, что зрелые пыльцевые зерна тотчас начинают образовывать пыльцевые трубки, как только они попадают в необходимую для переноса гена водную среду. Зачастую они тогда более не способны к оплодотворению, т.е. время, которое имеется в распоряжении для переноса гена, слишком короткое.

Parredy и др. в Planta 170, 141-143 (1987) описали культивирование и созревание незрелых кукурузных "метелок" (мужские соцветия) in vitro. Их опыляли с помощью изолированной зрелой пыльцы; и из опыленных растений получали семена. При этом не смогли привести приведенное с помощью генетической маркировки доказательство успешного оплодотворения.

Культивирование незрелых пыльцевых зерен возможно без обволакивающей их природной питательной ткани (эндоспермы), далее, что в эти изолированные незрелые пыльцевые зерна во время различных стадий созревания можно вносить чужеродные гены, и что опыленные, оплодотворенные растения с помощью вызревших пыльцевых зерен можно доводить до нормального образования семян, до прорастания и до размножения.

Предметом изобретения является способ трансформации размножающихся путем опыления растений, который отличается тем, что из тычинок отбирают незрелые пыльцевые зерна в питательный раствор, который содержит все необходимые для культивирования и поддержания способности созревания пыльцевых зерен питательные и ростовые вещества, и удаляют окружающую ткань;
изолированные незрелые пыльцевые зерна культивируют в питательном растворе, который содержит существенные для культивирования и поддержания способности созревать питательные и ростовые вещества;
в пыльцевые зерна во время культивирования in vitro и созревания переносят чужеродный генный материал,
трансформированные пыльцевые зерна in vitro доводят до полного созревания,
опыляют с помощью трансформированных пыльцевых зерен и получают из них семена.

Благодаря переносу гена в изолированные, незрелые пыльцевые зерна, созреванию in vitro и применению пыльцы в качестве универсального супервектора появляется совершенно новая стратегия переноса гена в растениях. По сравнению с другими методами этот способ существенно упрощен, так как сильно сокращается фаза клеточной культуры и отпадает регенерация с неприятным сопровождающим появлением сомаклональных вариаций. С помощью этого нового способа можно трансформировать также растения, которые до сих пор были недоступны для переноса генов: так, например, многие виды зерновых, бобовых и деревьев, не регенерируемых из отдельных клеток или протопластов.

Стремятся изменить генетически растения так, чтобы повышался урожай, чтобы растения становились резистентными по отношению к заболеваниям и повреждениям, чтобы они были толерантны против холодов, нагревов, сухости, пересола, недостатка питательных веществ, чтобы они достигали большего питательного качества, продуцировали нового вида промышленные вещества, или фиксировали свой собственный азот или другим образом не зависели от удобрений.

Существенным для изобретения является то, что пыльцевые зерна без окружающей их ткани изолируют, культивируют так, чтобы переносимый ген-материал имел, в связанной с вектором или в "голой" форме, прямой контакт с пыльцевым зерном. Если культивируют именно полные мужские соцветия, то из-за препятствия и благодаря обширной обволакивающей ткани невозможно с помощью доступных методов переноса (А.tumefaciens), электропорация, микроинъекция и т. п.) транспортировать таким образом гены в пыльцевые зерна.

Дальнейшим существенным отличительным признаком изобретения является применение незрелых пыльцевых зерен. Благодаря этому все время имеется в распоряжении in vitro созревание для переноса гена. Перенос в незрелое пыльцевое зерно может осуществляться на различных стадиях зрелости, в зависимости от вида растения. В особенности в случае переноса гена с помощью векторов речь идет о том, что генный материал по возможности должен преодолевать немногие клеточные стенки, чтобы попасть в геном ядер спермия и при оплодотворении стать частью зиготного генома. Перенос осуществляют предпочтительно в одноядерные микроспоры, однако также можно его осуществлять во время первого митоза пыльцы, на ранней двухъядерной стадии, до тех пор, пока генеративные клетки еще прилипают к пыльцевым стенкам, или также дополнительно в случае тех растений, которые в стадии зрелости обладают двухъядерной пыльцой (зерновые), на стадии незадолго до или во время второго митоза пыльцы.

В частности, способ осуществляется следующим образом, причем в качестве модельной системы применяется табак (Nicotiana tabacum): Система применима для всех размножающихся путем опыления растений, в особенности для однодольных и двудольных культурных растений, как пшеница, кукуруза, рис, бобовые, масличные, овощные растения, плодовые и лесные растения.

В предварительном испытании определяется стадия развития пыльцы желательных растений, обычно путем выделения пыльника, получения препарата-отпечатка и наблюдения в микроскоп после добавки, например, карминуксусной кислоты.

Если пыльца достигла желательной стадии, что пыльцевые зерна выделяют при асептических условиях, так выдавливают в питательную среду из пыльников, пассажируют через сито, промывают, центрифугируют и снова суспендируют.

Плотность клеток для пыльцевых зерен в более ранней стадии развития должна быть выше, чем для пыльцевых зерен в более поздней стадии развития. Она составляет в случае табака с 2-ядерными пыльцевыми зернами примерно 10⁵/мл, для одноядерных микроспор примерно вдвое выше.

Применяемая питательная среда содержит все необходимые для культивирования и поддержания способности созревания пыльцевых зерен питательные и ростовые вещества. В зависимости от растений при этом могут получаться различные составы, так что она выполняет функцию питательной ткани (Tapetum). В качестве основных составных частей питательная среда содержит при этом сахар, питательные вещества, минеральные соли и витамины, причем рН значение составляет примерно 6,5-7,5.

В случае одноядерных микроспор культивирование происходит вплоть до двухъядерной стадии в среде, обогащенной в значительной степени сахаром, например сахарозой, и другими питательными веществами. Например, можно добавлять дополнительные питательные вещества в форме воды кокосового ореха. Если пыльцевые зерна достигли двухъядерной стадии, то их можно переводить в менее богатую питательными веществами среду.

По окончании созревания in vitro получают пыльцевые зерна для опыления. Для этой цели их центрифугируют, промывают и в водной среде или высушенными наносят для опыления на цветы, из которых заранее удалены тычинки. Из опыленных с помощью in vitro cозревших пыльцевых зерен растений общеизвестным способом можно получать семена, которые способны прорастать.

Для переноса гена во время культивирования in vitro переносимый чужеродный генный материал в составе обычного вектора, такого, как, например, A. tumefaciens или в виде "голой" ДНК вносится в пыльцевые зерна путем прямого переноса с помощью электропорации, микроинъекции или других физико-химических методов. Выражение "чужеродный генный материал" обозначает любой, образующийся вне трансформируемого пыльцевого зерна генный материал. После прошедшего созревания получают пыльцевые зерна описанным образом для опыления.

В качестве доказательства успешного созревания in vitro пыльцевые зерна растений табака с 2-мя маркерными генами (KANR, NOS) заставляют вызревать in vitro, и с помощью этих пыльцевых зерен опыляют нормальные исходные типы растений. Полученные семена стерилизуют и доводят до прорастания в содержащей канамицин среде для прорастания. Сегрегация по Менделю маркерных генов обнаруживается путем подсчета ростков в селективной среде. Ростки, которые проросли на не содержащей канамицин среде, согласно обнаружению нопалина в бумажном электрофорезе высокого напряжения, обладают также сегрегацией по Менделю NOS-гена. Это является доказательством того, что in vitro появились созревшие пыльцевые зерна, которые осуществляют оплодотворение, и при этом не происходит контаминации пыльцой других растений.

В качестве доказательства экспрессии внесенного путем трансформации во время культивирования in vitro чужеродного гена, в ферментном тесте обнаруживается активность хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ-активность) в гомогенате из трансформированных пыльцевых зерен.

Дополнительно к САТ-гену, применяется также цитохимически обнаруживаемый ген, бета-глюкозуронидазный ген (GUS-ген). При этом агробактерии после сокультивирования с пыльцой удаляются путем ежедневной промывки с помощью антибиотика Клафорана или погибают. В цитохимическом тесте (синее окрашивание пыльцы) можно обнаружить свыше 50% синей созревшей in vitro пыльцы. Неинфицированная пыльца или пыльца, которая инфицируется с помощью агробактерий, без или соответственно, с нефункциональным GUS-геном, не показывает после добавки субстрата никакого синего окрашивания. Флюориметрический тест показывает сильную GUS-активность в GUS-трансформированной пыльце, так также в пыльце GUS-трансформированных растений, которые служат в качестве положительного контроля. Пыльца, которая не инфицирована или инфицирована с помощью не содержащих GUS-гена агробактерий, не обладает никакой GUS-активностью. Также инфекция с помощью агробактерий без инфекционного гена, но со сложным GUS-геном в Т-ДНК не приводит ни к какой GUS-активности в пыльце (цитохимически и флюорометрически).

Из вышесказанного можно сделать вывод, что перенос гена осуществляется в пыльце за счет Agrobacterium tumefaciens. Другим указанием успешного переноса гена в пыльце является заметное присоединение (прилипание) агробактерий к поверхности пыльцы с образованием целлюлозных фибрилл (снимок с электронного микроскопа).

П р и м е р 1. Определение стадии развития пыльцы.

Цветы табака различной длины собирают, пыльники асептически изолируют, пять пыльников вместе с каплей карминуксусной кислоты (4% кармина в 45%-ной уксусной кислоте) наносят на предметный носитель и получают препарат, изготовляемый путем раздавливания объекта. Стадия развития пыльцы определяется спустя полчаса под микроскопом.

П р и м е р 2. Изолирование пыльцевых зерен.

Пыльцевые зерна табака изолируют так, что пыльники при асептических условиях с AMGLU-среде (1) осторожно выдавливают с помощью стеклянной палочки на чашку для наблюдения в микроскоп, и результирующую пыльцевую суспензию пропускают через сито 75 ммк и промывают дважды в AMGLU-среде. Напоследок пыльцевую суспензию центрифугируют при 6500 об/мин на центрифуге Эппендорфа.

П р и м е р 3. Пыльцевая культура для созревания ранних двухъядерных пыльцевых зерен.

Ранние двухъядерные пыльцевые зерна табака изолируют и устанавливают плотность клеток в AMGLU-среде 10⁵/мл. 1 мл пыльцевой суспензии культивируют на чашках Петри при 25^оС в темноте. Спустя 2-5 дней в зависимости от точной стадии развития пыльцевых зерен пыльцевые зерна созревают и их можно собирать.

П р и м е р 4. Пыльцевая культура для созревания одноядерных микроспор.

Одноядерные микроспоры табака культивируют в MR 24-среде (2) при плотности клеток 2 · 10⁵/мл. Как только пыльцевые зерна достигнут двухъядерной стадии (спустя 2-5 дней в зависимости от точного возраста), их отделяют центрифугированием и культивируют далее в MIS-среде (3), до тех пор, пока не закончится созревание. Очень хорошие результаты достигаются также при культивировании в MR 26-среде (2'). Как только пыльцевые зерна достигли двухъядерной стадии (спустя 3 дня), к ним добавляют такой же объем M2S-среды. Спустя следующий день пыльцевые зерна отделяют центрифугированием и культивируют далее в M2S-среде (3') при плотности клеток 10⁵/мл, до тех пор, пока не закончится созревание (один день).

П р и м е р 5. Опыление и обнаружение оплодотворения.

Пыльцевые зерна табака отделяют центрифугированием, промывают в ВК-среде (Brewbaker и Kwack, 1963) и устанавливают плотность клеток 1,25 · 10⁶/мл. Из цветов, которые раскрыты (красные верхушки цветов), удаляют еще закрытые пыльники. Как только цветы раскрываются, на рыльце цветка наносят капли объемом 4 мкл пыльцевой суспензии с помощью пипетки объемом 20 мкл, так, чтобы рыльца были полностью покрыты пыльцевой суспензией. Эти операции осуществляют при условиях неподвижного воздуха и удаленности других растений такого же вида. Как только капли на рыльце высохнут, рыльца и столбики покрывают соломиной длиной 4 см, чтобы предотвратить постороннее оплодотворение. Растения затем помещают в оранжерею.

П р и м е р 6. Сбор урожая семян, прорастание семян и генетический тест.

В качестве доказательства того, что созревшие in vitro пыльцевые зерна получаются опылением и оплодотворением, пыльцевые зерна трансгенных растений созревают in vitro и опыляют этими пыльцевыми зернами нормальные исходные типы растений. В качестве маркер-гена трансгенное растение содержит ген неомицинфосфотрансферазоев (резистентность против канамицина) и ген непалинсинтазы. Также осуществляется самооплодотворение и взаимное скрещивание с созревшими in vitro исходным типами пыльцы.

Полученные согласно примеру 5 зрелые семенные коробочки (коричневые и сухие) собирают и выделяют семена, так, что срезают кончик коробочки и семенные зерна непосредственно вносят в емкости Эппендорфа. Семена стерилизуют поверхностно в течение 5 мин в NaOCl-растворе (3% свободного хлора), дважды промывают стерильной водой и наносят на среду для проращивания семян с канамицином (4). Спустя 4 недели подсчитывают число Кап^R и Кап^S ростков. В вышеприведенном опыте скрещивания оба взаимных cкрещивания дают сегрегацию Кап^R: Кап^S 1:1. Ростки, которые выросли без канамицина, согласно Nopalin-тесту путем бумажного электрофореза высокого напряжения показывают сегрегацию NOS^-: NOS^- 1:1. Самооплодот- ворение с помощью созревших in vitro исходных типов, как и ожидалось, дает 0:1 сегрегацию для обоих маркер-генов. Самооплодотворение с помощью созревшей пыльцы in vitro трансгенных растений дает сегрегацию 3:1.

П р и м е р 7. Временная экспрессия САТ-гена.

Агробактерии (A. tumefaciens без опухолевого гена, САТ-геном, соединенным с 35S-промотором предварительно инкубируют в течение дня в среде Аурия. Пыльцевые зерна в ранней двухъядерной стадии изолируют и культивируют в AMGLU-среде. Суспензию бактерий с помощью AMGLU-среды устанавливают при 0,2 на ОД₅₈₀. После дальнейшего разбавления с помощью AMGLU-среды 1:10 добавляют 20 мкл суспензии бактерий к 1 мл пыльцевой суспензии. После 24-х часов сокультивирования, для убивания агробактерий добавляют 1 мкл Клафорана (1g/2 мл) на мл. Спустя два последующих дня собирают пыльцевые зерна и готовят экстракт. Для этого на мл пыльцевой суспензии добавляют 1,5 мл кальциевого промывного раствора (5); рН 5,6; центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин и промывают с помощью Трис-буфера (0,25 М, рН 7,8). После центрифугирования пыльцевой осадок смешивают с 200 мкл Трис-буфера и гомогенизируют на льду с помощью ультразвука (3 х 15 с). После нахождения в течение 10 мин на льду бактерии сами не обладают никакой САТ-активностью, культура агробактерий в бульоне Luria через полный цикл роста не показывает никакой САТ-активности.

П р и м е р 8. Экспрессия GUS-гена в табачной пыльце.

Агробактерии штамма LBA 4404 (A. tumefaciens, с геном бета-глюкуронидазы (GUS-), соединенным с 35S-промотором и терминатором, (Matzke и Matzke в Plant Molecular Biology 7, 357-365, 1986)) предварительно инкубируют в бульоне Luria в течение одного дня. Пыльцевые зерна в поздней одноядерной стадии изолируют и в MR 26-cреде устанавливают содержание их 0,2 при ОД₅₈₀. После следующего разбавления с помощью MR 26-среды 1:10 добавляют 20 мкл суспензии бактерий к 1 мл пыльцевой суспензии. Спустя 14-20 ч сокультивирования отделяют центрифугированием, и пыльцу промывают трижды содержащей клафоран (1 г/2 мл) MR 26-средой и культивируют далее. Вплоть до созревания пыльцы каждый день меняют содержащую клафоран среду. 40 мкл последней среды (M2S c клафораном) помещают в бульон Luria. В нем не происходит никакого роста бактерий.

Созревшую пыльцу отделяют центрифугированием и часть включают в MR 26-среду. После добавки X-Glu (5-бром-4-хлор-3- индолилглюкуронид) до конечной концентрации 1 мМ и инкубации при 37^оС в течение 4-12 ч (Jeffenson in Plant Malecular Biology Reporter т. 5, N 4, 387-405, 1987) можно обнаружить образование индиго отделяют центрифугированием надосадочную жидкость, которую хранят при минус 20^оС.

САТ-тест осуществляют как описано Sleigh (Anal. Biochem. 56, 251-156, 1986). 30 мкл экстракта смешивают с 20 мкл хлорамфеникола (8 ммоль), 30 мкл трис-буфера и 20 мкл ¹⁴С-маркированного ацетил-СоА (5 Uci) мл в 0,5 мМ холодном ацетил-СоА). После инкубации при 37^оС в течение 1 ч ацетилированный хлорамфеникол встряхивают с этилацетатом (2 х 100 мкл) и измеряют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Радиоактивность (cpm) в САТ-тесте экстрактов из табачной пыльцы после сокультивирования с А. tumefaciens:
cp Пыльца в AMGLU-среде 400
Пыльца с агробакте- риями AMGLU-среде 6000
Пыльца с активирован-
ными ацетозирингоном
агробактериями в AMGLU- среде 6000
Только агробактерии в AMGLU-среде 500
Только культивирование
ацетозирингоном агробактерий в AMGLU-среде 500
Сильный сигнал радиоактивности показывает, что агробактерии пыльцевых клеток успешно инфицированы и Т-ДНК должна попадать для экспрессии (транскрипции) в клеточные ядра растущих клеток.

В качестве дальнейшего контроля, чтобы показать, что агро-(продукт бета-глюкуронидазы из X-Glu), руководствуясь синим окрашиванием пыльцы в микроскопе. Более, чем 50% живой, созревшей пыльцы показывает синее окрашивание.

Вторую часть сокультивированной и созревшей in vitro пыльцы проращивают в GK-среде (как ВК-среда, однако двойная концентрация борной кислоты). В пыльцевых сумках проросшей пыльцы также можно обнаружить GUS-активность.

В контрольном опыте пыльцу инфицируют с помощью штамма агробактерий LBA 4404, который содержит в своей Т-ДНК GUS-ген без промотора. (Drs. Matzke, Зальцбург). Эта пыльца после созревания in vitro и добавки X-Glu не показывает никакого синего окрашивания. Также агробактерии, которые не содержат никакого GUS-гена, а содержат KAN₃₅-ген, после сокультивирования с пыльцой и добавки X-Glu, не показывают никакого синего окрашивания. Также пыльца, которая инфицирована агробактериями, после добавки X-Glu не показывает никакого синего окрашивания.

Пыльца GUS₃₅-трансформированных растений (через диск листа), которые служат в качестве положительного контроля, показывает синее окрашивание. Другой штамм агробактерий, который содержит функциональный GUS₃₅-ген в Т-ДНК, однако не проявляет свою вирулентную функцию (би- нарный вектор без Ti-плазмиды), не показывает никакой GUS-активности в пыльце.

Из третьей части пыльцы готовят экстракт. Для этой цели отделяют центрифугированием 4 · 10⁵ пыльцы и вносят в буфер для экстракции (6). Пыльцу "размалывают" с помощью стеклянных шариков и при одновременной обработке ультразвуком. Флюорометрический GUS-тест осуществляют как описано Jefferson. 50 мкл экстракта доливают с помощью буфера для экстракции до 1 мл и смешивают с MUG (4-метил-умбеллиферил-глюкуронид) до конечной концентрации 1 мм. Все 10 или 30 с отбирают аликвоты по 200 мкл и ферментную реакцию прекращают с помощью 800 мкл Na₂CO₃ (0,2 M). Во флюориметре измеряют экстинкцию при 455 нм после возбуждения с помощью 365 нм и пересчитывают в концентрации в μ М/мл, руководствуясь стандартными растворами с MUG.

Флюориметрически измеренная ферментная активность в μ М/мл спустя 10, 20 и 30 мин бета-глюкуронидазы из экстрактов табачной пыльцы после сокультивирования с А. tumefaciens:
10 мин 20 мин 30 мин
Стандарт 1 1,0 1,0 1,0
Стандарт 2 0,1 0,1 0,1
Пыльца без агробактерий 0,016 0,020 0,019
Пыльца сокультивированная с
GUS₃₅ агробактериями пыльца,
сокультивированная с KAN_35S
агробактериями 0,023 0,019 0,021
Пыльца с GUS_35S c "бинарным
вектором" без Ti-плазмиды 0,022 0,023 0,018
Пыльца трансгенных
GUS + растений 0,051 0,085 0,121
Культуральная среда:
(1) AMGLU-среда: макросоли Миллера
MS-микросоли
сахароза (0,25 М)
глутамин (440 мг/л)
рН 7
(2) MR 24-среда: MSмакросоли
MSмикросоли
сахароза (0,5 М)
глутамин (440 мг/л)
вода кокосового ореха (2 об.)
лактальбумин-гидролизат (200 мг/л)
инозитол (100 мг/л)
рН 7
(2') MR 26-среда: как и MR 24-cреда, только
лактальбумингидролизат (1 г/л).

(3) MIS среда: макросоли Миллера
М. микросоли
Fe EDTA (10^-4 M)
сахароза (0,25 М)
рН 7
(3') M2S-среда: Kyo и Harada соли (в Planta
186, 427-432, 1986) сахароза (0,25 М)
рН 7
(4) Среда для проращивания семян: MS макросоли
MS микросоли
Fе EDTA (10^-4 M)
Сахароза (1 мас.)
агар (0,8 мас.)
канамицин О₄ (50 мг/л)
рН 5,5
(5) Кальциевый промывной раствор: CaCl₂ · 2H₂O (0,16 M)
MES-буфер (0,5 мас.)
рН 5,6
(6) Буфер для экстракции: NaPO₄ (50 мМ, рН 7)
2-меркаптоэтанол (10 мМ)
Na₂ EDTA (10 мМ)
натрий-лаурил-саркозин (0,1%)
Тритон Х-100 (0,1%)

Использование: биотехнология растений, а именно к способу трансформации растений, размножающихся путем опыления. Сущность изобретения: способ трансформации размножающихся путем опыления растений состоит в том, что выделяют незрелые пыльцевые зерна в стадии одноядерных микроспор или во время пыльцевого метода, или на стадии двухъядерных микроспор, пока генеративная клетка прилипает к стенке пыльцы, удаляют окружающую ткань, экзогенную ДНК вводят в незрелые пыльцевые зерна, помещенные в питательную среду, доводят in vitro до полного созревания, затем опыляют растения - реципиенты трансформированными пыльцевыми зернами.

СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ПУТЕМ ОПЫЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ, предусматривающий введение экзогенной ДНК в пыльцевые зерна и опыление растений - реципиентов трансформированными пыльцевыми зернами, отличающийся тем, что перед введением экзогенной ДНК у растений выделяют незрелые пыльцевые зерна в стадии одноядерных микроспор, или во время пыльцевого листоза, или в ранней стадии двухъядерных микроспор, пока генеративная клетка прилипает к стенке пыльцы, удаляют окружающую ткань, экзогенную ДНК вводят в незрелые пыльцевые зерна, помещенные в питательную среду, а затем доводят их in vitro до полного созревания.