Изобретение касается выделения, описания и использования возбудителя таинственного заболевания свиней. В изобретении используется открытие фактора, вызывающего заболевание, и проводится определение его геномной организации, геномной нуклеотидной последовательности и белков, закодированных геномом, что делается с целью защиты от инфекций и диагностики инфекций, в частности защиты от инфекций таинственного заболевания свиней и диагностики таких инфекций, и с целью получения вакцинных составов и диагностических наборов, предназначенных для использования либо в случае таинственного заболевания свиней, либо в случае заболеваний, вызванных другими патогенными микроорганизмами или факторами.
Известный уровень техники
Зимой и ранней весной 1991 г. свиная индустрия Дании понесла урон от внезапного появления нового заболевания среди племенных свиноматок. Большинство свиноматок проявляло анорексию, у некоторых происходил выкидыш на поздней стадии беременности (примерно на 110 день), происходила мертворожденность или рождались мумифицированные плоды, и некоторые свиноматки характеризовались проявлением лихорадочного состояния. Иногда обнаруживались свиноматки с синеватыми ушами; по этой причине заболевание получило название "Абортус блаув (синеватость плода)" (" Abortus Blauw"). Заболевание у свиноматок часто сопровождалось появлением респираторного расстройства и смертью их поросят и часто появлением респираторного заболевания и замедлением роста у подросших поросят и откармливаемых свиней.
Причина этой эпизоотии была не известна; однако симптомы напоминали симптомы аналогичного заболевания, возникшего в Германии с конца 1990 г., и напоминали симптомы так называемой "Таинственной болезни свиней" (Mystery Swine Disease"), как она наблюдалась с 1987 г. на Среднем Западе Соединенных Штатов Америки и в Канаде (Aill, 1990). Для обозначения этой болезни использовались различные другие названия: в Германии она известна как "Эпизоотический поздний аборт у свиньи" (Seuchenhaften Spаtabort der Sehweine"), а в Северной Америке она также известна как "Таинственная свиная болезнь" (Mysterious Pig Disease" ), "Таинственный репродуктивный синдром" (Mysterious Reproductive Syndrome") и "Свиной бесплодный и респираторный синдром" ("Surne Jufirtelity and Respiratory Syndrome"). В Северной Америке Лула (Loula, 1990) описал общие клинические признаки болезни следующим образом:
1) отказ от пищи, слабые животные всех возрастов;
2) выкидыши, рождения мертвого плода, слабые поросята, появления мумифицированного плода;
3) послеопоросные респираторные проблемы;
4) проблемы, связанные с размножением.
Не был еще идентифицирован этиологический фактор, но вирус энцефаломиокардита, свиной парвовирус, вирус псевдобешенства, вирус свиного гриппа, вирус бычей вирусной диареи, вирус свиной холеры, свиные энтеровирусы, вирус заболевания, подобного гриппу, хламиды, лептоспиры - все они были уже названы в качестве возможной причины (Loula, 1990; Mengeling and Lager, 1990; среди других).
Краткое изложение существа изобретения
Изобретение дает состав вещества, включающего в себя выделенный фактор Лелистада (Lelystad), который является причинным фактором таинственной болезни свиней, причем упомянутый фактор Лелистада является в существенной мере соответствующим изоляту фактора Лелистада (CDI-NL-2.91), внесенному на хранение 5 июня 1991 г. Институтом Пистера, Париж, Франция, депозитный номер 1-1102. Слова "в существенной мере соответствующим" относятся к вариациям, которые встречаются в природе, и к искусственным вариациям фактора Лелистада, особенно к тем, которые еще допускают обнаружение способами, подобными гибридизации, способу полимеризной цепной реакции и способу иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, проводимым с использованием специфических в отношении фактора Лелистада материалов, таких как специфическая в отношении фактора Лелистада ДНК или специфические антитела.
В состав вещества могут входить живой, убитый или ослабленный выделенный фактор Лелистада; рекомбинантный вектор, выделенный из фактора Лелистада; выделенная часть или компонента фактора Лелистада; выделенный или синтетический белок, (поли)пептид или нуклеиновая кислота, выделенные из фактора Лелистада; рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая включает в себя нуклеотидную последовательность, выделенную из генома фактора Лелистада; (поли)пептид с аминокислотной последовательностью, выделенной из белка фактора Лелистада, в случае чего (поли)пептид продуцируется клеткой, способной продуцировать его в силу своего генетического сочетания с надлежащей рекомбинантной ДНК; выделенное или синтетическое антитело, которое специфически распознает часть или компоненту фактора Лелистада; или рекомбинантный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, включающую в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или антигенный пептид, выделенный из фактора Лелистада.
На ДНК-уровне изобретение, в частности, дает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, точнее рекомбинантную ДНК которая включает в себя специфическую в отношении фактора Лелистада нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 1. Желательно, чтобы упомянутая специфическая в отношении фактора Лелистада нуклеотидная последовательность выбиралась из какой-либо последовательности, ограниченной рамками открытого считывания, как это показано на фиг. 1.
На пептидно-белковом уровне изобретение, в частности, дает пептид, включающий в себя специфическую в отношении фактора Лелистада аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1.
Изобретение далее дает вакцинный состав, предназначенный для вакцинации животных, в частности, млекопитающих, точнее поросят или свиней, с целью защиты их от таинственной болезни свиней, включающий в себя фактор Лелистада, либо живой, либо убитый, либо ослабленный; или рембинантный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, включающую в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белковый или антигенный пептид, выделенный из фактора Лелистада; антигенную часть или компоненту фактора Лелистада; белок или антигенный полипептид, выделенный из фактора Лелистада, или пептид, мимикрирующий антигенную компоненту фактора Лелистада, и надлежащий носитель или адъювант.
Изобретение также дает вакцинный состав, предназначенный для вакцинации животных, в частности, млекопитающих, точнее поросят и свиней, с целью защиты их от заболевания, вызванного патогенным микроорганизмом, включающим в себя рекомбинантный вектор, выделенный из фактора Лелистада, нуклеиновую кислоту рекомбинантного вектора, включающего в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или антигенный пептид, выделенный из патогенного микроорганизма, и надлежащий носитель или адъювант.
Изобретение далее дает диагностический набор, предназначенный для обнаружения нуклеиновой кислоты из фактора Лелистада в образце, в частности в биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, мокрота, слюна или ткань, взятые у животного, в частности у млекопитающего, точнее у поросенка или свиньи, включающий в себя нуклеиновокислотную пробу или праймер, которые включают в себя нуклеотидную последовательность, выделенную из генома фактора Лелистада, и надлежащие средства обнаружения, позволяющие обнаруживать нуклеиновую кислоту.
Изобретение также дает диагностический набор, предназначенный для обнаружения антигена из фактора Лелистада в образце, в частности в биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, мокрота, слюна или ткань, взятые у животного, в частности у млекопитающего, точнее у поросенка или свиньи, включающий в себя антитело, которое специфически распознает часть или компоненту фактора Лелистада, и надлежащие средства обнаружения, позволяющие обнаруживать антиген.
Изобретение также дает диагностический набор, предназначенный для обнаружения антитела, которое специфически распознает фактор Лелистада в образце, в частности в биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, мокрота, слюна или ткань, взятые у животного, в частности у млекопитающего, точнее у поросенка или свиньи, включающий в себя фактор Лелистада, антигенную часть или компоненту фактора Лелистада, белок или антигенный полипептид, выделенный из фактора Лелистада, или пептид, мимикрирующий антигенную компоненту фактора Лелистада, и надлежащие средства обнаружения, позволяющие обнаруживать антитело.
Изобретение также касается способа установления наличия у животного, в частности у млекопитающего, точнее у поросенка или свиньи, возбудителя таинственной болезни свиней, включающего в себя приготовление образца, в частности биологического образца, такого как кровь или сыворотка крови, мокрота, слюна или ткань, взятые у животного, и выявление наличия нуклеиновой кислоты, отвечающей фактору Лелистада, антигена, отвечающего фактору Лелистада, или антитела, специфически распознающего фактор Лелистада, где упомянутый фактор Лелистада является этиологическим фактором таинственного заболевания свиней и в основном соответствующим изоляту фактора Лелистада (CDI-NL-2.91), внесенного на хранение 5 июня 1991 г. Институтом Пастера, Париж, Франция, депозитный номер 1-1102.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение является результатом совместных усилий Центрального ветеринарного института и Региональных служб охраны здоровья животных Нидерландов в их стремлении найти причину нового заболевания в виде "Таинственной болезни свиней". Фермы, на которых свиньи оказались подверженными новому заболеванию, посещали участковые ветеринары Региональных служб охраны здоровья животных. Больных свиней, образцы, взятые у больных свиней, и сыворотки свиноматок, взятые в острый период заболевания и в период выздоровления, направляли для выделения вируса в Региональные службы охраны здоровья животных и в Центральный ветеринарный институт. Парные сыворотки заболевших свиноматок тестировали на наличие антител, направленных против десяти известных свиных вирусов. Были выделены три различных вируса: вирус энцефаломиокардита, свиной энетровирус типа 2, свиной энтеровирус типа 7 и неизвестный фактор, фактор Лелистада. Свиноматки, которые были зарегистрированы зараженными этой болезнью, характеризовались в основном сероконверсией в фактор Лелистада и редко в какой-либо из иных вирусных изолятов или известных вирусных патогенных микрообразований. С целью экспериментального воспроизведения таинственной болезни свиней восемь беременных свиноматок были инокулированы интраназально фактором Лелистада на 84-й день беременности. Одна свиноматка родила семь мертвых и четырех живых, но очень слабых поросят на 109-й день беременности; четверо живых поросят умерли через день после рождения. Еще одна свиноматка родила на 116-й дань три мумифицированных плода, шесть мертвых поросят и трех живых поросят; два живых поросенка умерли в течение дня. Третья свиноматка родила на 117-й день два мумифицированных плода, восемь мертвых и семь живых поросят. Другие свиноматки опоросились примерно на 115-й день и характеризовались менее тяжелыми репродуктивными потерями. Среднее число живых поросят от всех восьми свиноматок при рождении составило 7,3, а среднее число мертвых поросят при рождении было 4,6. Антитела, направленные против фактора Лелистада, были обнаружены в 10 из 42 образцов сыворотки, взятых до того, как поросята начали сосать. Фактор Лелистада был выделен из трех поросят, умерших вскоре после рождения. Эти результаты свидетельствуют в пользу вывода, что фактор Лелистада является причинным фактором появления таинственной болезни свиней.
Фактор Лелистада развивается с цитопатическим эффектом в легочных макрофагах свиней, и он может быть идентифицирован по окрашиванию при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа с использованием постинфекционных сывороток свиней с номерами с 829 и b 822 или с использованием любых иных постинфекционных сывороток SPF - свиней, перечисленных в табл. 5. Антитела, направленные против фактора Лелиcтада, могут быть идентифицированы по методикам косвенного окрашивания при проведении иммунопероксидаз номонослойного анализа. Фактор Лелистада не развивается в любой иной клеточной системе, подвергнутой тестированию. Фактор Лелистада не нейтрализуется гомологическими сыворотками или сыворотками, направленными против совокупности известных вирусов (табл. 5). Фактор Лелистада не гемоглютинирует с эритроцитами, подвергнутыми тестированию. Фактор Лелистада характеризуется размером менее 200 нм, поскольку он проходит через фильтр с порами этого размера. Фактор Лелистада обнаруживает чувствительность к хлороформу. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что фактор Лелистада не является пока еще идентифицированным как принадлежащий к определенной вирусной группе или к иному микробиологическому виду. Он был внесен на хранение 5 июня 1991 г. под номером 1-1102 в Институте Пастера, Франция.
Теперь установлены геномная организация, нуклеотидные последовательности и полипептиды, установленные из таковых, у фактора Лелистада. Эти данные совместно с данными других исследователей (см. ниже) оправдывают классификацию фактора Лелистада (здесь далее называемого также вирусом Лелистада, ЛВ) как члена новой семьи вирусов Артеривиридов. В качестве вируса-прототипа этой новой семьи предлагается взять вирус лошадиного артериита (Eguine Arteritis Virus (EAV)), который станет первым членом новой семьи, для которого стали доступными данные по стратегии репликации генома и его организации (de Vries et al., 1990, и имеющиеся там ссылки). На основании сопоставления полученных данных о последовательностях с данными, имеющимися для вируса элевации лактатдегидрогеназы (Lactate Dehydrogenase - Elevateug Virus (LDV; Godeny et al. , 1990) может быть высказано предложение считать вирус элевации лактатдегидрогеназы также членом Артеривиридов.
Приведенные геномная организация и трансляционная стратегия Артеривиридов представляются достаточными для помещения этой новой семьи вирусов в суперсемью коронавирусов (Snijder et al., 1990a).
Общим у артеривирусов является то, что их главными целевыми клетками у соответствующих хозяев являются макрофаги. Было показано, что репликация вируса элевации лактатдегидрогеназы ограничивается макрофагами их хозяина, мыши, тогда как эта определенная склонность в отношении макрофагов не была еще пока выявлена у вируса лошадиного артериита и вируса Лелистада.
Артеривирусы представляют собой сферические заключенные в оболочку частицы, имеющие диаметр 45 - 60 нм и содержащие иносаэдрический нуклеокапсид (Brinton - Darnell and Plagemann, 1975; 1971; Hyllseth, 1973).
Геном Артеривирид состоит из положительной спиральной полиаденилированной РНК-молекулы с размером примерно в 12000 - 13000 оснований (Brinton - Darnell and Plagemann, 1975; van der Zeijst et al., 1975). Лошадиный артериитный вирус репликатирует через находящийся в 3'-месте набор из шести субгеномных кислот мРНК с размерами, находящимися в области от 800 до 3600 оснований, которые составляют лидерную последовательность, идущую от 5'-конца геномной РНК, которая соединяется с 3'-концевыми основными последовательностями (de Vries et al., 1990).
Здесь было показано, что геномная организация и репликационная стратегия у вируса Лелистада являются схожими с таковыми у вируса лошадиного артериита, коронавирусов и торовирусов, тогда как геномные размеры у последних вирусов являются совершенно отличными от таковых у вируса Лелистада и вируса лошадиного артериита.
Геном у вируса Лелистада состоит из геномной РНК-молекулы с длиной примерно от 14500 до 15500 оснований (оценка произведена на нейтральном агарозном геле), которая репликатирует через находящийся в 3'-месте набор из субгеномных кислот РНК. Субгеномные кислоты РНК состоят из лидерной последовательности, длина которой пока еще остается неизвестной, которая исходит из 5'-конца геномной РНК и которая сливается с основными последовательностями, исходящими из 3'-конца геномной РНК (фиг. 2).
Нуклеотидная последовательность у геномной РНК вируса Лелистада была определена из анализа перекрывающихся кДНК-клонов. Консеквентная последовательность из 15088 пар оснований была получена покрытием почти полного генома вируса Лелистада (фиг. 1). У этой последовательности было идентифицировано 8 кадров открытого считывания: кадр открытого считывания 1A, кадр открытого считывания 1B и кадры открытого считывания от 2 до 7.
Считают, что кадры открытого считывания 1A и 1B кодируют вирусную репликазу или полимеразу, тогда как кадры открытого считывания от 2 до 6 кодируют структурную вирусную мембрану (оболочку), т.е. связанные с ней белки. Считают, что кадр открытого считывания 7 кодирует структурный вирусный нуклеокапсидный белок.
Поскольку продукты, отвечающие кадрам открытого считывания 6 и 7 у вируса Лелистада, обнаруживают значительную схожесть соответственно с продуктами из областей VpX и VpI у вируса эливации лактатдегидрогеназы, можно полагать, что последовательности, отвечающие кадрам открытого считывания 6 и 7, должны быть также сильно консервативными среди антигенных вариантов вируса Лелистада.
Полная нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 1, и все последовательности и белковые продукты, кодированные кадрами открытого считывания от 1 по 7 и, возможно, другие кадры открытого считывания, находящиеся на последовательности, показанной на фиг. 1, являются особенно пригодными для разработки вакцины, независимо от вкладываемого здесь смысла, и для разработки диагностических инструментов, независимо от вкладываемого здесь смысла. Все возможные варианты и модификации хорошо известны специалистам, работающим в этой области техники.
Поскольку теперь представляется возможным определенно идентифицировать фактор Лелистада, т.е. причинный фактор таинственной болезни свиней, можно теперь провести тестирование на зараженность свиней фактором Лелистада. Такие диагностические тесты пока еще никто не проводил.
Тест может быть проведен посредством выделения вируса в макрофагах или в иных системах клеточной культуры, в которых может развиваться фактор Лелистада, и окрашивания инфектированных культур антителами, направленными против фактора Лелистада (такого как постинфекционные сыворотки с 829 или b 822); однако могут быть также разработаны и применены другие типы диагностических тестов.
Например, можно использовать методики прямого или косвенного иммуногистологического окрашивания, т. е. проводить анализ с использованием антител, направленных против фактора Лелистада, который подвергается воздействию метки с флюоресцентными соединениями, такими как изотиоцианат, или воздействию метки с ферментами, такими как пероксидаза хрена обыкновенного. Эти методики могут быть использованы для обнаружения антигена фактора Лелистада в тканевых срезах или в иных образцах, взятых у свиней, подозреваемых в заболевании таинственной болезнью свиней. Антителами, необходимыми для этих тестов, могут быть антитела с 829 иди b 822 или иные поликлональные антитела, направленные против фактора Лелистада, но могут быть также использованы и моноклональные антитела, направленные против фактора Лелистада.
Далее, поскольку определены природа и организация генома у фактора Лелистада и нуклеотидная последовательность у этого генома, могут быть идентифицированы специфические нуклеотидные последовательности фактора Лелистада и они могут быть использованы для создания олигонуклеотидных последовательностей, которые могут быть использованы в качестве проб или праймеров в диагностических методиках, таких как методика с гибридизацией, методика с полимеразной цепной реакцией или любые иные методики, разработанные для специфического обнаружения нуклеотидных кислотных последовательностей.
Можно также провести тестирование на антитела, направленные против фактора Лелистада. Из табл. 5 видно, что у экспериментально зараженных свиней быстро появляются антитела, направленные против фактора Лелистада; и из табл. 4 видно, что у свиней, относящихся к этой области, также быстро проявляются антительные реакции, направленные против фактора Лелистада.
Таким образом, теперь также можно установить, были ли свиньи заражены ранее фактором Лелистада. Такое тестирование представляется исключительно важным при определении отсутствия фактора Лелистада у свиней или свиных стад, или свиных популяций, или у свиней целых регионов или стран. Тест может быть проведен с использованием иммунопероксидазномонослойного анализа, как это было описано ранее; но при этом могут быть также разработаны и применены другие типы диагностических тестов, направленных на обнаружение антител, направленных против фактора Лелистада.
Специфические для фактора Лелистада белки, полипептиды и пептиды или пептидные последовательности, мимикрирующие антигенные компоненты фактора Лелистада могут быть использованы в таких тестах. Такие белки могут быть выделены из самого фактора Лелистада; однако такие белки могут быть также приготовлены способами с использованием рекомбинантной ДНК или с использованием пептидного синтеза. При проведении этих тестов могут быть использованы специфические поликлональные и (одновременно или по отдельности) моноклональные антитела, направленные против фактора Лелистада, или специфические компоненты фактора Лелистада и (одновременно или по отдельности) использованы клеточные системы, зараженные фактором Лелистада, или клеточные системы, экспрессирующие антиген фактора Лелистада. Антитела могут быть, например, использованы в качестве средства иммобилизации антигена фактора Лелистада (твердую поверхность покрывают антитела, после чего антиген фактора Лелистада связывают антителом), что сопровождается достижением повышенной специфичности у теста, или могут быть использованы в конкурентном анализе (меченое антитело и неизвестное антитело, находящиеся в образце, конкурируют в отношении имеющегося антигена фактора Лелистада).
Далее, описанные выше диагностические возможности могут быть применены для тестирования других животных, таких как млекопитающие, птицы, насекомые или рыбы, или растений, или иных живых созданий с целью установления возможности их заражения фактором Лелистада или родственными факторами, с целью установления у них наличия такой инфекции в момент тестирования или с целью выявления их возможной зараженности в прошлом.
Поскольку теперь фактор Лелистада идентифицирован как причинный фактор таинственной болезни свиней, может быть приготовлена вакцина, предназначенная для защиты свиней от этого заболевания. Такая вакцина может быть просто приготовлена выращиванием фактора Лелистада в свиных легочных макрофаговых культурах или в иных клеточных системах, в которых развивается фактор Лелистада. Фактор Лелистада может быть подвергнут или не подвергнут очистке и убит установленными способами, такими как инактивация формалином или ультрафиолетовым светом. Инактивированный фактор Лелистада может быть затем соединен с адъювантами, такими как стимуляторы Фрейнда (Freund), или гидроксидом алюминия, или иными веществами; и этот состав может быть затем введен свиньям.
Мертвые вакцины могут быть также приготовлены с использованием белковых препаратов фактора Лелистада, выделенных из зараженных фактором Лелистада культур или выделенных из клеточных систем, специфически экспрессирующих белок фактора Лелистада, что достигается применением ДНК-рекомбинантных методик. Такие субъединицы фактора Лелистада должны быть затем обработаны так, как это указывалось выше. Это приведет к получению субъединичной вакцины.
Вакцины, содержащие даже еще меньшие компоненты фактора Лелистада, такие как полипептиды, пептиды или пептиды, мимикрирующие антигенные компоненты фактора Лелистада, являются также приемлемыми для использования в качестве мертвой вакцины.
Мертвые вакцины, направленные против таинственной болезни свиней, могут быть также приготовлены способами с применением рекомбинантной ДНК, в случае которых геном фактора Лелистада или части такового встраивают в векторные системы, такие как вирус коровьей оспы, вирус герпеса, вирус псевдобешенства, аденовирус, бакуловирус, или в иные приемлемые векторные системы, которые, тем самым, могут экспрессировать антиген фактора Лелистада в надлежащих клеточных системах. Антигеи фактора Лелистада, взятый из этих систем, может быть затем использован для создания вакцины, как это говорили выше; и свиньи, вакцинированные такими продуктами, будут проявлять защитные иммунные реакции, направленные против фактора Лелистада.
Вакцины, направленные против таинственной болезни свиней, могут также основываться на живых препаратах фактора Лелистада. Поскольку, как это представляется, серьезно страдают от заражения фактором Лелистада только молодые поросята и беременные свиноматки, можно использовать неослабленный фактор Лелистада, выращенный в свиных легочных макрофагах, в качестве вакцины для более старших поросят или племенных подсвинок. Этим способом свиноматки могут быть защищены от таинственной болезни свиней до начала их беременности, в результате чего они окажутся защищенными от выкидышей и мертворождений и от появления врожденных инфекций у поросят. Кроме того, материнское антитело, которое эти вакцинированные свиноматки передадут своему потомству, будет защищать их потомство от этой болезни.
Ослабленные вакцины (модифицированные живые вакцины), направленные против таинственной болезни свиней, могут быть приготовлены серийно переносом фактора Лелистада в свиные легочные макрофаги, затем в легочные макрофаги иных видов или в иные клеточные системы, или в иных животных, таких как кролики, что делается до тех пор, пока не теряется их патогенность.
Живые вакцины, направленные против таинственной болезни свиней, могут быть также получены способами с применением рекомбинантной ДНК, в случае чего геном фактора Лелистада или части такового встраивают векторные системы, такие как вирус коровьей оспы, вирус герпеса, вирус псевдобешенства, аденовирус, или в иные приемлемые векторные системы, которые, тем самым, могут экспрессировать антиген фактора Лелистада. Свиньи, вакцинированные такими живыми векторными системами, будут затем проявлять защитные иммунные реакции, направленные против фактора Лелистада.
Сам фактор Лелистада подходит, в частности, для использования в качестве живой векторной системы. Инородные гены могут быть вставлены в геном фактора Лелистада и могут быть сделаны экспрессирующими соответствующий белок при заражении макрофагов. Эта клетка, которая является клеткой, представляющей антиген, будет воздействовать на инородный антиген и представлять его в B-лимфоцитах и Т-лимфоцитах, которые станут выступать с надлежащими иммунными реакциями.
Поскольку фактор Лелистада является, по-видимому, очень клеточно-специфическим и, возможно, также очень видоспецифическим, эта клеточная система может оказаться очень безопасной системой, которая не причиняет вреда другим клеткам или видам.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 изображает нуклеотидную последовательность генома вируса Лелистада. Показана выведенная аминокислотная последовательность, отвечающая идентифицированным кадрам открытого считывания. Метионины, закодированные (предполагаемыми) ATG-стартовыми сайтами, указываются жирным шрифтом, а предполагаемые сайты N- гликозилирования даются подчеркиванием, Показаны различия у нуклеотидной и аминокислотной последовательности, как это идентифицировано посредством определения последовательности расположения аминокислотных остатков у различных кДНК-клонов. Подчеркиванием выделена нуклеотидная последовательность у праймера 25, который был использован в гибридизационных экспериментах (см. фиг. 2 и раздел "Результаты").
Фиг. 3 изображает организацию генома у вируса Лелистада. Клоны кДНК, которые были использованы для определения нуклеотидной последовательности, указаны в верхней части фиг.2. Части клонов, которые были идентифицированы посредством определения последовательности расположения аминокислотных остатков, указываются черным. В нижней части фиг.2 показаны кадры открытого считывания, идентифицированные у нуклеотидной последовательности, и показан субгеномный набор кислот мРНК, кодирующих эти кадры. Пунктирными линиями на этих кадрах открытого считывания представлены иные возможные сайты инициирования (ATG-сайты), отвечающие этим кадрам. Лидерная последовательность у геномных и субгеномных кислот РНК дается зачерченным прямоугольником.
Фиг. 3 изображает характеристики роста фактора Лелистада:
пустые квадратики - титр у свободного от клетки вируса;
зачерненные квадратики - титр у вируса, ассоциированного c клеткой;
сплошная линия - выраженный в процентах цитопатический эффект.
Материалы и методы
Сбор образцов
Образцы и свиней собирали на фермах, где в стадах, по-видимому, имели место эпизоотии таинственной болезни свиней. Важными критериями при выборе фермы с отнесением ее к разряду зараженных таинственной болезнью свиней были следующие критерии: наличие свиноматок, отказывающихся от пищи, наличие мертворожденных плодов и выкидышей, слабое потомство, респираторное заболевание и смерть среда поросят. Исследованию были подвергнуты образцы четырех групп, взятые у свиней;
1) тканевые образцы и мазок со слизистой оболочки рта, взятые у поросят с этим заболеванием (табл. 1A);
2) образцы крови и мазки со слизистой оболочки рта, взятые у свиноматок с этим заболеванием (табл. 1B и 4);
3) тканевые образцы, назальные мазки и образны крови, собранные у свободных от специфического патогенного микроорганизма свиней, экспериментально зараженных посредством контакта со свиноматками с этим заболеванием; или
4) тканевые образцы, назальные мазки и образцы крови, собранные у свободных от специфического патогенного микроорганизма свиней, экспериментально зараженных посредством инокуляции образцами крови, взятыми у свиноматок с этим заболеванием (табл. 2 и 5).
Приготовление образцов
Образцы, необходимые для выделения вируса, получали от поросят и свиноматок, которые по клиническим данным подозревались в заболевании таинственной болезнью свиней, и от экспериментально зараженных свиней, свиноматок и их поросят, не содержавших этого специфического патогенного микроорганизма.
Тканевые образцы срезали на криостатном микротоме, и срезы подвергали прямому иммунофлюоресцентному тестированию с конъюгатами, направленными против различных свиных патогенных микроорганизмов,
Образцы тканей в виде 10%-ной суспензии готовили в буферном солевом растворе Хэнка (Hank's BSS ) с добавлением антибиотиков, и оральные и назальные мазки помещали в буферный солевой раствор Хэнка с добавлением антибиотиков. После выдержки в течение одного часа при комнатной температуре суспензии осветляли центрифугированием в течение 10 мин при 6000 G, и надосадочные жидкости хранили при -70oC для дальнейшего использования. Лейкоцитные фракции отделяли от этилендиаминтетрауксусной кислоты или от крови гепарина, как это описано ранее (Wensvoort and Terpstra, 1988), и хранили при -70oC. Плазму и сыворотку, предназначенные для выделения вируса, хранили при -70oC.
Сыворотку для проведения серологии брали у свиноматок, которых подозревали, что они находятся в острой фазе протекания таинственной болезни свиней; парную сыворотку брали через 3 - 9 недель. Кроме того, сыворотки брали у экспериментально зараженных свиней, не имевших ранее этого специфического патогенного микроорганизму, что делали через определенные промежутки времени; и молозиво и сыворотку брали у экспериментально зараженных свиноматок и их поросят. Сыворотки, необходимые для проведения серологии, хранили при -20oC.
Клетки
Свиные легочные макрофаги получали из легких свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней в возрасте 5 - 6 недель и из легких взрослых свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиноматок, взятых из собственного стада Центрального ветеринарного института. Легкие промывали от пяти до восьми раз фосфатно-солевым буферным раствором. Каждую аликвоту промывной воды собирали и центрифугировали в течение 10 мин при 300 G. Результирующий клеточный остаток от центрифугирования снова промывали фосфатно-солевым буферным раствором и вновь суспендировали в среде, предназначенной для содержания клеточной культуры (160 мл среды 199 с добавлением 20 мл 2,95%-ного триптозофосфата, 20 мл сыворотки плода коровы и 4,5 мл 1,4%-ного бикарбоната натрия), доводя концентрацию до 4•107 клеток в 1 мл. Клеточную суспензию затем медленно смешивали с равным объемом диметилсульфоксидной смеси (6,7 мл указанной выше среды, 1,3 мл сыворотки плода коровы, 2 мл 97%-ного диметилсульфоксида), фасовали в ампулы на аликвоты по 2 мл и хранили в жидком азоте.
Макрофаги, взятые из одной ампулы, готовили для клеточной культуры двухкратной промывкой раствором MEM Эрла (Earle's MEM) и вновь суспендировали в 30 мл среды роста (среда МEM Эрла с добавлением 10%-ной сыворотки плода коровы, пенициллина в количестве 200 ед/мл, 0,2 мг/мл стрептомицина, 100 ед/мл микостатина и 0,3 мг/мл глутамина). Клетки линии РК-15 (Американская коллекция типовых культур микроорганизмов, CCL 33) и клетки линии SK-6 (Kasza et al. , 1972) выращивали так, как это описано у Уэнсвурта и др. (Wensvoort et al., 1989). Второстепенные свиные почечные (РК2) клетки выращивали в среде MEM Эрла при добавлении 10%-ной сыворотки плода коровы и указанных выше антибиотиков. Все клетки выращивали в камере, предназначенной для выращивания клеточных культур, что делали при 37oC и содержании диоксида углерода в 5%.
Методики выделения вирусов
Выделение вирусов проводили согласно установленным методикам при использовании клеток PK2, РК-15 и SК-6 и свиных легочных макрофагов. Первые три разновидности клеток выращивали в склянках на 25 мл (Грейнера (Greiner)) и инокулировали опытным образцом, когда захват монослойным покрытием достигал 70 - 80%. Макрофаги засевали в аликвотах на 100 мкл, находящихся на микротитраторных пластинах на 96 углублений (Грейнер), или при больших объемах в надлежащих склянках и инокулировали опытным образцом в пределах одного часа после засевания. Культуры просматривали ежедневно на наличие цитопатических эффектов и замораживали при -70oC, когда цитопатический эффект доходил до 50 - 70% или после 5 - 10 дней развития культуры. Дальнейшие пассажи производили на замороженном-оттаявшем материале пассажного уровня 1 и 2 или выше. Некоторые образцы инокулировали также на девятый-двенадцатый день куриными яйцами с развивающимся эмбрионом. Аллантоиновую среду субинокулировали два раза при использовании инкубационного интервала в три дня; и собранные клетки третьего пассажа, выросшие в культуре, обследовали проведением гемагглютинации при 4oC с использованием эритроцитов цыпленка и проведением иммуносорбентного анализа с ферментной меткой для специального обнаружения нуклеопротеида вирусов гриппы A (De Boer et al., 1990).
Серология
Сыворотки тестировали проведением тестов по гемагглютинирующему ингибированию с целью изучения развития антитела, направленного против вируса гемагглютинирующего энцефалита и вирусов свиного гриппа H1N1 и H3N2, что делали согласно прописи Мазурела (Masurel, 1976). Начальные разбавления сывороток в тестах по гемагглютинирующему ингибированию составляли 1:9, после чего сыворотки разбавляли вдвое.
Сыворотки тестировали в установленных иммуносорбентных анализах с ферментной меткой на антитела, направленные против гликопротеидов gI вируса псевдобешенства (PRV; Van Oirschot et al., 1988), свиного парвовируса (PPV; Westenbrink et al., 1989), вируса бычьей вирусной диареи (BVDV; Westenbrink et al. , 1986) и вируса свиной холеры (HCV; Wensvoort et al., 1988). Начальные разбавления в тестах с иммуносорбентным анализом с ферментной меткой составляли 1:5, после чего сыворотки разбавляли вдвое.
Сыворотки тестировали на нейтрализацию антител, направленных против доз 30 - 300 TCID50 вирусов энцефаломиокардита, свиных энтеровирусов и фактора Лелистада, что делали согласно прописи Терпстра (Terpstra, 1978). Начальные разбавления сывороток в тестах по нейтрализации сыворотки составляли 1:5, после чего сыворотки разбавляли вдвое.
Сыворотки тестировали на связывание с фактором Лелистада, проводя иммунопероксидазномонослойный анализ. Фактор Лелистада (LA; код CDI-NL-2.91) засевали на микротитраторных пластинах при добавлении 50 мл среды для выращивания, содержащей 100 TCID50 фактора Лелистада, в углубления микротитраторной пластины, содержащей свежезасеянные легочные макрофаги. Клетки выращивали в течение двух дней и затем фиксировали, поступая так, как это описано в литературе (Wensvoort, 1986). Тестируемые сыворотки разбавляли в соотношении 1: 10 смесью, содержащей 0,15 М хлорида натрия, 0,05% твина 80,4% лошадиной сыворотки, или разбавляли еще сильнее, производя последовательные четырехкратные разбавления с добавлением в углубления, и затем инкубировали в течение одного часа при 37oC. Овечьи-антисвиные иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена обыкновенного (фирма DAKO), разбавляли тем же самым буферным раствором и использовали при втором инкубировании, которое проводили в течение одного часа при 37oC, после чего пластины окрашивали, поступая так, как это описано в литературе (Wensvoort et al., 1986). Интенсивное красное окрашивание цитоплазмы у инфектированных макрофагов указывало на наличие связывания сывороток с фактором Лелистада.
Методики идентификации вирусов
Идентичность цитопатических изолятов устанавливали определением плавучей плотности в хлориде цезия, оценкой размера частиц в негативно окрашенных препаратах посредством электронной микроскопии, определением чувствительности изолята к хлороформу и нейтрализацией цитопатического эффекта у изолята сыворотками с известной специфичностью (табл. 3). Всякий раз, когда изолят оказывался специфически нейтрализованным сывороткой, направленной против известного вируса, считали, что изолят является представительным для этого известного вируса.
Изоляты, которые обнаруживали цитопатический эффект на макрофаговых культурах, также подвергали исследований окрашиванием с проведением иммунопероксидазномонослойного анализа в условиях постинфекции сыворотками от свиней с 829 или b 822. Изоляты реинокулировали на макрофаговых культурах и фиксировали на второй день после инокуляции до проявления изолятом цитопатического эффекта. Всякий раз, когда изолят обнаруживал реактивность в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа с постинфекцией сыворотками от свиней с 829 или b 822, считали, что изолят является представительным для фактора Лелистада. Представительные образцы других изолятов, выращенных в макрофагах или в неинфицированных макрофагах, также подвергали окрашиванию этими сыворотками, что делали с целью проверки специфичности сывороток.
Дальнейшая идентификация фактора Лелистада
Фактор Лелистада подвергали дальнейшему изучению методом гемагглютинации, проводимой при 4oC и при 37oC с использованием красных кровяных телец O, взятый у цыпленка, морской свинки, свиньи, овцы или человека. При проведении гемагглютинационных исследований в качестве положительного контрольного теста использовали тест с вирусом свиного гриппа, подтип H3N2.
Связывание свиных антисывороток, специфически направленных против вируса псевдобешенства, вируса передаваемого гастроэнтерита, вируса свиной эпидемической диареи, вируса гемагглютинирующего энцефалита, вируса африканской лихорадки свиней, вируса свиной холеры и вируса свиного гриппа типа H1N1 и H3N2, бычьих антисывороток, специфически направленных против вирусов бычьего герпеса типа 1 и 4, вируса злокачественной герпетической лихорадки, вируса парагриппа 3, бычьего респираторно-синцитиального вируса и вируса бычьего лейкоза, и птичьих антисывороток, специфически направленных против вируса лейкоза птиц и вируса инфекционного бронхита, изучали с использованием специфических иммуноглобулиновых конъюгатов пероксидазы хрена обыкновенного в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа на свиных легочных макрофагах, инфектированных и неинфектированных фактором Лелистада, что делали так, как это описано выше.
Проведением иммунопероксидазномонослойного анализа подвергали тестированию также антисыворотки различных видов, направленные против вируса эпидимического паротита, вируса Сендаи (Sendai), вируса собачьей чумы, вируса чумы рогатого скота, вируса кори, вируса пневмонии мышей, бычьего респираторно-синцитиального вируса, вируса бешенства (rabies virus), вируса бешенства (foamy virus), вируса заболевания маеди-висна (maedi-visna virus), вируса бычьего и муринового (mrine) лейкоза, вируса иммунодефицита человека, кошек и обезьян, вируса лимфоцитарного хориоменингита, вируса кошачьего инфекционного перитонита, вируса мышиного гепатита, вируса Бреда (Breda), вируса Гантаана (Hantaan), вируса найробийской болезни овец, вируса восточного, западного и венесуэльского энцефалопиелита у лошадей, вируса коревой краснухи, вируса артериита у лошадей, молочного дегидрогеназного вируса, вируса желтой лихорадки, вируса клещевого энцефалита и вируса гепатита С.
Фактор Лелистада вслепую подвергали пассажу в клетках PK2, РК-15 и SК-6 и в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. После двух пассажей материал снова инокулировали в свиных легочных макрофаговых культурах для повторного выделения фактора Лелистада.
Фактор Лелистада титровали в свиных легочных макрофагах до и после пропускания через фильтр с размером отверстий 0,2 мкм (Schleicher and Schuell). Фактор Лелистада обнаруживали проведением иммунопероксидазномонослойного анализа и по его цитопатическому эффекту. Титры рассчитывали согласно Риду и Мюнху (Reed and Muench, 1938).
Затем готовили свиную антисыворотку, направленную против фактора Лелистада. Две свиньи (21 и 23), свободные от этого специфического патогенного микроорганизма, инфектировали интраназально с дозой 105 TCID50 материалом, взятым от пятого пассажа клеточной культуры фактора Лелистада. Две другие свиньи, свободные от этого специфического патогенного микроорганизма, инфектировали интраназально свежей суспензией с дозой по фактору Лелистада в 105 TCID50, которая была приготовлена из легочной ткани поросят, свободных от этого специфического патогенного микроорганизма, но инфектированных им. Образцы крови брали на 0, 14, 28 и 42 постинфекционные дни.
Проводили далее выращивание фактора Лелистада в свиных альвеолярных макрофагах, что делали с целью установления их временной характеристики роста. Свиные альвеолярные макрофаги засевали в склянках Г25 на 25 мл (Грейнера), инфектировали фактором Лелистада с множественностью заражения величиной 0,01 TCID50 на клетку. Через 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 и 64 ч после заражения исследовали одну склянку и определяли процентную величину у цитопатического эффекта в сравнении с неинфектированной контрольной культурой. Производили сбор клеток из среды с культурой, и изъятое количество заменяли равным объемом фосфатно-солевого буферного раствора. Среду и склянку хранили при -70oC. После сбора всех культур определяли титры у фактора Лелистада и выражали их в виде Iog TCID50 мл-1.
Морфологию фактора Лелистада изучали проведением электронной микроскопии. Фактор Лелистада культивировали так, как это было описано выше. Через 48 ч культуры подвергали замораживанию-оттаиванию и центрифугировали в течение 10 мин при 6000 G. Примерно 30 мл надосадочной жидкости смешивали затем с 0,3 мл специфической в отношении фактора Лелистада свиной сыворотки и инкубировали в течение 1,5 ч при 37oC. После центрифугирования в течение 30 мин при 125 000 G результирующий твердый остаток суспендировали в 1%-ной агарозной среде Сикема (Seakem), находящейся в фосфатно-солевом буферном растворе при 40oC. После коагуляции агарозный блок погружали в 0,8%-ный глутаровый альдегид и 0,8%-ный тетраоксид осмия (Hersch et al., 1968), находящиеся в веронально-ацетатном буферном растворе с величиной pH 7,4 (230 мМ осмия на 1 кг воды), и фиксировали микроволновым облучением. Эту методику повторяли единожды с использованием свежего фиксатора. Образец промывали водой, погружали в 1%-ный раствор уранилацетата и окрашивали микроволновым облучением. На протяжении всех этапов образец держали при 0oC, и микроволновое излучение (фирма "Самсунг", тип прибора RE211D) подавали при оттаивании на 5 мин. Тонкие срезы готовили по стандартным методикам, окрашивали цитратом свинца (Venable et al. , 1965) и обследовали на электронном микроскопе типа СМ 10 производства фирмы "Филипс".
Продолжали далее выделение фактора Лелистада из сывороток свиней, которые были получены в случаях заболевания таинственной болезнью свиней. Образцы сыворотки происходили из Нидерландов (случай заболевания Нидерланды 2), из Германии (случаи заболевания Германия 1 и Германия 2; благодаря любезности д-ров Бернера (Berner) Мюнхен, и Ниенхоффа (Nienhoff), Мюнстер) и из Соединенных Штатов [экcпepимeнталъный случай Соединенные Штаты 1 (эксперимент осуществлен с использованием образца VR-2332. взятого из Американской коллекции типовых культур микроорганизмов; благодаря любезности д-ров Коллинза (Collins), Сент-Пол, и Хладека (Chladek) Сент-Джозеф) и случаи заболевания Соединенные Штаты 2 и Соединенные Штаты 3; благодаря любезности д-ров ван-Алстина (van Alstine), Вест-Лафейетт, и Слайфа (Slife), Гейлсберг] . Все образцы направляли в институт "Сентраал диергенеескундиг институт, Лелистад" для диагноза в отношении фактора Лелистада. Все образцы использовали для выделения вируса, проводимого на свиных альвеолярных макрофагах, как это было описано выше. Цитопатические изоляты трижды подвергали пассажу и идентифицировали как содержащие фактор Лелистада проведением специфического иммуноокрашивания с использованием постинфекционных сывороток с номерами b 822 и с 829, направленных против фактора Лелистада.
Изучали также антигенние взаимосвязи у изолятов NL1 (первый изолят фактора Лелистада; код CD1-NL -2.91), NL2, GE1, GE2, US1, US2 и US3. Изоляты выращивали в макрофагах, делая это так, как говорили выше, и подвергали тестированию проведением иммунопероксидазномонослойного анализа с использованием совокупности из сывороток, выделенных при реальном заболевании, и двух наборов экспериментальных сывороток. Сыворотки также тестировали проведением иммунопероксидазномонослойного анализа с использованием неинфектированных макрофагов.
Сыворотки от действительных заболеваний были следующими. Две сыворотки, положительные в отношении вируса Лелистада (TH-187 и TO-36), были выбраны из совокупности сывороток от действительных заболеваний в Дании, положительных в отношении фактора Лелистада. Двадцать две сыворотки были выбраны из сывороток от действительных заболеваний, присланных из-за границы в Лелистад для установления серологического диагноза. Сыворотки были получены из Германии (ВЕ-352, ВЕ-392 и NI- 2; благодаря любезности д-ра Бернера (Berner), Мюнхен, и д-ра Ниенхоффа (Nienhoff), Мюнстер), из Великобритании (РА-141615, РА-141617 и РА-142440; благодаря любезности д-ра Пейтона (Paton), Уэйбридж), из Бельгии (РЕ-1960; благодаря любезности проф. Пенсаэрта (Pensaert), Гент), из Франции (EA-2975 и ЕА-2985; благодаря любезности д-ра Альбина (Albina), Плуфраган), из Соединенных Штатов (SL-441, SL- 451, AL-PP9577, AL-P10814/33, AL-4994A, AL-7252, JC-M 41, JC-M 44 и JC-M 45; благодаря любезности д-ра Слайфа (Slife), Гейлсберг, д-ра ван Алстина (van Alstine) Вест-Лафейетт, и д-ра Коллинза (Collins), Сент-Пол) и из Канады (RB-16, RB-19 RB-22 и RB-23; благодаря любезности д-ра Робинсона (Robinson), Квебек).
Экспериментальными сыворотками были следующие сыворотки: описанный выше набор сывороток от свиней 21, 23, 25 и 29, взятых на 0, 14, 28 и 42 постинфекционные дни; набор экспериментальных сывороток (полученных благодаря любезности д-ров Хладека (Chladek), Сент-Джозеф, и Коллинза (Collins), Сент-Пол), которые происходили от четырех шестимесячных поросят, зараженных интраназально с дозой величиной 105,1 TCID50 от изолята VR-2332 из Американской коллекции типовых культур микроорганизмов. Образцы крови брали у молодой свиньи 2B на 0, 20, 36 и 63 постинфекционные дни; у молодой свиньи 9G на 0, 30, 44 и 68 постинфекционные дни; у молодой свиньи 16W на 0, 25, 40 и 64 постинфекционные дни и у молодой свиньи 16Y на 0, 36 и 64 постинфекционные дни.
Для изучения радиоиммуноосадительным анализом (de Mazan court et al., 1986) белков фактора Лелистада, находящихся в свиных альвеолярных макрофагах, выращивали инфектированные фактором Лелистада и неинфектированные макрофаги, делая это в течение 16 ч в присутствии меченой среды, содержащей 35S -цистеин. Клетки с меткой осаждали, следуя стандартным методикам, с использованием постинфекционных сывороток 42-го постинфекционного дня от свиней b 822 и 23 и с использованием сыворотки MN8, которая была получена через 26 дней после инфектирования свиноматки изолятом VP-2332, взятым из Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (благодаря любезности д-ра Коллинза (Collins), Сент-Пол). Осажденные белки анализировали проведение электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и визуализировали проведением флюорографии.
Для определения характеристик у генома фактора Лелистада экстрагировали ядерную ДНК и цитоплазматическую РНК из макрофаговых культур, которые были инфектированы фактором Лелистада и выращивались в течение 24 ч или находились в неинфектированном состоянии. Среду, в которой находилась культура клеток, отделяли, и клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором. ДНК экстрагировали, как это описано в литературе (Strauss, 1987). Цитоплазматическую РНК экстрагировали так, как это описано в литературе (Favarolo et al., 1980), очищали центрифугированием через хлорид цезия с концентрацией 5,7 М (Setzer et al., 1980), обрабатывали свободной от рибонуклеазы дезоксирибонуклеазой (фирма "Фармация") и анализировали в 0,8%-ном нейтральном агарозном геле (Moormann and Hulst, 1988).
Клонирование и секвенирование
С целью клонирования РНК вируса Лелистада внутриклеточную РНК инфектированных вирусом Лелистада свиных легочных альвеолярных макрофагов (10 мг) инкубировали вместе с 10 мМ гидроксида метилртути в течение 10 мин при комнатной температуре. Денатурированную РНК инкубировали при 42oC совместно с 50 мМ Fris-HCI при pH 7,8, 10 мМ хлорида магния, 70 мМ хлорида калия, 0,5 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, 0,6 мкг олигонуклеотидных праймеров из тимуса теленка pd (N) 6 (фирма "Фармация") и 300 ед. обратной транскриптазы вируса муринового лейкоза Молони (Moloney muriue leukaemia virus), находящимися в общем объеме в 100 мкл. По прошествии часа добавляли 20 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты; реакционную смесь экстрагировали затем смесью фенола с хлороформом, пропускали через колонку с сефадексом G50 и осаждали этанолом.
Для синтеза второй кДНК-спирали использовали ДНК-полимеразу 1 (фирма "Боерингер") и рибонуклеазу Н (фирма "Фармация") (Gubler and Hoffman, 1983). Для образования тупых концов на окончаниях двухспиральную кДНК инкубировали совместно с ДНК-полимеразой Т4 (фирма "Фармация"), делая это в реакционной смеси, которая содержала 0,05 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов. Затем кДНК фракционировали в 0,8%-ном нейтральном агарозном геле (Moormann and Hulst, 1988). Фрагменты размером от 1000 до 4000 оснований электроэлюировали, вставляли в сайт Smal плазмиды рGEM-4Z (фирма "Промега") и использовали для трансформации штамма DH5 α культуры Escherichia coli (Hanahan, 1985). Фильтры с колониями подвергали гибридизации с использованием односпиральной кДНК-пробы с меткой в виде фосфора-32. Пробу подвергали обратному транскрибированию из РНК вируса Лелистада, которая была подвергнута фракционированию в нейтральном агарозном геле (Moormann and Hulst, 1988). Перед использованием односпиральную ДНК-пробу инкубировали совместно с цитоплазматической РНК, выделенной из ложно инфектированных легочных альвеолярных макрофагов.
Взаимосвязь между кДНК-клонами у вируса Лелистада определяли проведением анализа с использованием ограничительных ферментов и проведением гибридации с образованием пятен по Садерну (Southern) на расщепленной ДНК при использовании транслированных в определенном месте кДНК-проб (Sambrook et al., 1989).
Для получения 3'-конца у вирусного генома конструировали вторую кДНК-библиотеку, для чего использовали олигообразование (dT)12-18 и олигонуклеотид, специфический в отношении 3'- конца вируса Лелистада, который был комплементарным к вирусному геному со спиралью отрицательного направления; его использовали в качестве праймера в реакции с первой спиралью. Реакционные условия, имевшие место при проведении синтеза первой и второй спиралей, были идентичными описанным выше. Эту библиотеку сортировали, используя олигонуклеотидные пробы, специфические в отношении вирусного 3'-конца.
Большую часть (более 95%) кДНК-последовательности определяли, используя автоматический лазерный флюоресцентный (A.L.F.ТМ - торговая марка) ДНК-секвенсер, полученный от фирмы Pharmacia-LkB. Определение последовательного порядка расположения аминокислотных остатков, направляемое флюоресцентным олигонуклеотидным праймером, проводили на двухспиральной ДНК при использовании набора АвторидТМ -секвенсинг-кит (торговая марка; фирма "Фармация"), что в существенной мере соответствовало методикам С и D , описанным в инструкции к набору АвторидТМ-секвенсинг-кит. Флюоресцентные праймеры готовили с использованием материала ФлюореПримТМ (торговая марка; фирма "Фармация"). Оставшуюся часть последовательности определяли посредством секвенсирования двухспиральной ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров в сочетании с Т7-полимеразой, основываясь на наборе, предназначенном для последовательного расположения аминокислотных остатков (Секвенсинг-кит; фирма "Фармация"), и на веществе α-32S-дАТФ (фирма "Амершам").
Данные для последовательности анализировали с использованием предназначенных для этой цели программ PCGENE (фирма "Интеллигенетикс, инк.", Маунтин-Вью, США) и FASTA (Pearson and Lipman, 1988).
Экспериментальная репродукция таинственной болезни свиней
Обычным образом разведенных беременных свиноматок в количестве 14 особей, беременность которых продолжалась уже в течение 10 - 11 недель, тестировали на наличие антитела, направленного против фактора Лелистада, для чего проводили иммунопероксидазномонослойный анализ. Все они дали отрицательный результат. Затем были образованы две группы по четыре свиноматки и доставлены в Центральный ветеринарный институт. На 12-ю неделю беременности эти свиноматки были инокулированы интраназально 2 мл фактора Лелистада (число пассажей равнялось трем, титр составляет 104,8 TCID50 на 1 мл). Сыворотку и этилендиаминтетрауксуснокислотные образцы крови брали на 10-й день после инокуляции. Ежедневно регистрировали потребление пищи, ректальную температуру и другие клинические симптомы. При опоросе регистрировали дату рождения и число мертвых и живых поросят, приходящихся на одну свиноматку; и брали образцы, необходимые для выделения вирусов и проведения серологии.
Результаты
Иммунофлюоресценция
Тканевые срезы, взятые у свиней, зараженных таинственной болезнью свиней, окрашивали проведением иммунофлюоресцентного тестирования с использованием FITC-конъюгатов, направленных против вируса африканской лихорадки свиней, вируса свиной холеры, вируса псевдобешенства, свиного парвовируса, вируса свиного гриппа, вируса энцефаломиокардита и культуры Chlamydia psittaci. Срезы подвергали окрашиванию, их обследовали методом флюоресцентной микроскопии; и было установлено, что все они дают отрицательный результат.
Выделение вируса из поросят, взятых на фермах, зараженных таинственной болезнью свиней
Цитопатические изоляты обнаруживали в макрофаговых культурах, инокулированных тканевыми образцами, взятыми у поросят в возрасте от двух до десяти дней, которые были инфектированы таинственной болезнью свиней. Положительными оказались 16 из 19 поросят, взятых на пяти различных фермах (табл. 1A). Все эти изоляты взаимодействовали при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа с постинфекционной сывороткой свиньи с 829, тогда как неинокулированные контрольные культуры не взаимодействовали. Эти изоляты, следовательно, оказались представительными для фактора Лелистада. Один раз цитопатический изолят был обнаружен в культуре клеток SК-6, инокулированной суспензией мазка со слизистой оболочки рта поросенка шестой фермы (ферма VЕ) (табл. 1A). Этот изолят обнаруживал характеристики пикорнавирусов, и его нейтрализовали сывороткой, специфической в отношении свиного энтеровируса 2; по этой причине изолят был идентифицирован как свиной энтеровирус РЕV 2 (табл. 3). Клетки PK2, PK-15 и куриные яйца, инокулированные образцами этой группы, оставались всегда отрицательными.
Выделение вирусов в случае свиноматок, взятых на фермах, зараженных таинственной болезнью свиней
Цитопатические изоляты обнаруживали в макрофаговых культурах, инокулированных образцами, взятыми у свиноматок, инфектированных таинственной болезнью свиней. У 41-й свиноматки из 63, взятых на 11 фермах, результат оказался положительным (табл. 1B). Все эти изоляты при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа взаимодействовали с постинфекционной сывороткой свиньи b 822, и они, следовательно, были представительными для фактора Лелистада. В одном случае цитопатический изолят был обнаружен в культуре клеток PK2, инокулированной суспензией лейкоцитовой фракции, взятой у свиноматки с фермы HU (табл. 1B). Этот изолят обнаруживал характеристики пикорнавирусов, и его нейтрализовали сывороткой, специфической в отношении вируса энцефаломиокардита; по этой причине изолят был идентифицирован как вирус энцефаломиокардита (табл. 3). Клетки SK-6, РК-15 и куриные яйца, инокулированные образцами этой группы, давали отрицательный результат.
Выделение вирусов из свиней, свободных от этого специфического патогенного микроорганизма, которые находились в контакте со свиноматками, зараженными таинственной болезнью свиней
Цитопатические изоляты обнаруживали в макрофаговых культурах, инокулированных образцами, взятыми у свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней, находившихся в контакте со свиноматками, зараженными таинственной болезнью свиней. Четыре из 12 свиней дали положительный результат (табл. 2) Все эти изоляты при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа взаимодействовали с постинфекционной сывороткой свиньи с 829 и свиньи b 822, и они, следовательно, были представительными для фактора Лелистада. Цитопатические изоляты обнаруживали также в клеточных культурах PK2, РК-15 и SК-6, инокулированных образцами этих свободных от специфического патогенного микроорганизма свиней. Семь из 12 свиней дали положительный результат (табл. 2); все эти изоляты были нейтрализованы сывороткой, направленной против свиного энтеровируса 7 (РЕV7). Один из этих семи изолятов был подвергнут дополнительному исследованию; и другие характеристики также идентифицировали изолят как РЕV7 (табл. 3).
Выделение вирусов из свиней, свободных от этого специфического патогенного микроорганизма, которые были инокулированы кровью свиноматок, зараженных таинственной болезнью свиней
Цитопатические изоляты обнаруживали в макрофаговых культурах, инокулированных образцами, взятыми у свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней, инокулированных кровью свиноматок, зараженных таинственной болезнью свиней. У двух из восьми свиней результат оказался положительным (табл. 2). Все эти изоляты при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа взаимодействовали с постинфекционной сывороткой свиньи с 829 и свиньи b 822; и они, следовательно, были представительными для фактора Лелистада. Клетки РК2, SК-6 и РК-15, инокулированные образцами этой группы, давали отрицательный результат.
Суммируя сказанное выше, следует сказать, что четыре группы свиней были подвергнуты тестированию на наличие факторов, которые могут быть связаны с таинственной болезнью свиней.
В одной группе - у поросят, инфектированных таинственной болезнью свиней, - фактор Лелистада был выделен у 16 поросят из 20; один раз был выделен свиной энтеровирус 2 (РЕV2).
Во второй группе - у инфектированных таинственной болезнью свиней свиноматок - фактор Лелистада был выделен у 41 из 63 свиноматок; один раз был выделен вирус энцефаломиокардита. Кроме того, у 123 из 165 свиноматок, инфектированных таинственной болезнью свиней, имела место сероконверсия в фактор Лелистада, как это было установлено тестированием с проведением иммунопероксидазномонослойного анализа. Такая массовая сероконверсия не проявлялась против каких-либо других вирусных патогенных микроорганизмов, подвергнутых тестированию.
В третьей группе - у свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней, находившихся в контакте со свиноматками, зараженными таинственной болезнью свиней, - фактор Лелистада был выделен у четырех из 12 поросят; у семи поросят был выделен свиной энтеровирус 7 (PEV7). У всех 12 свиней имела место сероконверсия в фактор Лелистада и в свиной энтеровирус 7 (PEV7).
В четвертой группе - у свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней, инокулированных кровью свиноматок, зараженных таинственной болезнью свиней, - фактор Лелистада был выделен у двух свиней. Все восемь свиней обнаружили сероконверсию в фактор Лелистада.
Серология свиноматок, взятых на фермах, зараженных таинственной болезнью свиней
Парные сыворотки, взятые у свиноматок, зараженных таинственной болезнью свиней, тестировали в отношении разнообразных вирусных патогенных микроорганизмов и в отношении изолятов, полученных при проведении этого исследования (табл. 4). Поразительно сильная антительная реакция, направленная против фактора Лелистада, была измерена в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа (75% свиноматок оказались сероконвертированными; сероконверсию обнаружили на 23 фермах из 26), тогда как ни один из других вирусных патогенных микроорганизмов не давал четкой картины сероконверсии. Нейтрализующие антитела, направленные против фактора Лелистада, обнаружены не были.
Серология свободных от этого специфического патогенного микрообразования свиней, находившихся в контакте со свиноматками, зараженными таинственной болезнью свиней
Все восемь свободных от этого специфического патогенного микрообразования свиней обнаруживали антитело, направленное в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа против фактора Лелистада (табл. 5). Ни одна из этих сывороток не давала положительного результата при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа, выполненного на неинфектированных макрофагах. Ни одна из этих сывороток не давала положительного результата в сывороточном нейтрализационном тесте в отношении фактора Лелистада. Все сыворотки, взятые через две недели после возникновения контакта, обладали высокими нейтрализующими антительными титрами (более 1280) против свиного энтеровируса 7 (PEV7), тогда как прединфекционные сыворотки давали отрицательный результат (менее 10), указывая на то, что все свиньи были также инфектированы свиным энтеровирусом 7 (PEV 7).
Серология свободных от этого специфического патогенного микрообразования свиней, инокулированных кровью свиноматок, зараженных таинственной болезнью свиней
Все восемь свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней обнаруживали антительную реакцию в иммунопероксидазномонослойном анализе, направленную против фактора Лелистада (табл. 5). Ни одна из этих сывороток не давала положительного результата в иммунопероксидазномонослойном анализе, выполненном на неинфектированных макрофагах. Ни одна из этих сывороток не давала положительного результата в сывороточном нейтрализационном тесте в отношении фактора Лелистада. Предынфекционная и двухнедельная постинфекционная сыворотки давали отрицательный результат (менее 10) против свиного энтеровируса 7 (РЕV7).
Дальнейшая идентификация фактора Лелистада
Фактор Лелистада не гемагглютинирует с О-красными кровяными тельцами цыпленка, морской свинки, свиньи, овцы или человека.
Фактор Лелистада не взаимодействует в иммунопероксидазномонослойном анализе с сыворотками, направленными против вируса псевдобешенства, вируса передаваемого гастроэнтерита, вируса свиной эпидемической диареи, вируса африканской лихорадки свиней и т.д.
После двух неконтролируемых пассажей фактор Лелистада не растет в клетках PK2, РК-15 или SK-6 или в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом, инокулированным аллантоическим путем.
Фактор Лелистада по-прежнему сохраняет инфекционную способность после пропускания через фильтр с размером отверстий 0,2 мкм; как обнаружено проведением иммунопероксидазномонослойного анализа титры до и после фильтрования составляли 105,05 и 105,3 TCID50.
Получена кривая роста фактора Лелистада (см. фиг. 3). Максимальные титры у свободного от клетки вируса примерно составляют 105,5 TCID50 мл-1, что имеет место по прошествии 32 - 48 ч после инокуляции. По прошествии указанного времени макрофаги становятся убитыми под воздействием цитопатического эффекта фактора Лелистада.
Была проведена электронная микроскопия. Были обнаружена кластеры из сферических частиц фактора Лелистада. Частицы характеризовались диаметром 45 - 55 нм и содержали нуклеокапсид размером 30 - 35 нм, который был окружен липидной двухслойной мембраной. Частицы фактора Лелистада не обнаруживали в инфектированных культурах, подвергнутых обработке отрицательной сывороткой, или в отрицательных контрольных препаратах.
Определяли закономерности поведения изолятов из Нидерландов, Германии и Соединенных Штатов. Все семь изолятов были выделены в свиных альвеолярных макрофагах и подвергнуты пассажу три-пять раз. Все изоляты обуславливали появление цитопатического эффекта в макрофагах и могли быть подвергнуты специфическому иммуноокрашиванию направленными против фактора Лелистада сыворотками от свиньи b 822 и сывороткой 23 42 - постинфекционного дня. Эти изоляты были названы как NL2, GEI, GE2, US1, US2 и US3.
Устанавливали антигенные взаимосвязи у изолятов NL1, NL2, GE1, GE2, US1 , US2 и US3. Ни одна из полученных сывороток не взаимодействовала в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа с неинфектированными макрофагами; однако все сыворотки содержали антитела, направленные против одного или нескольких из семи изолятов (табл. 7). Ни одна из экспериментальных сывороток не взаимодействовала в условиях проведения иммунопероксидазномонослойного анализа с неинфектированными макрофагами; и ни одна из экспериментальных сывороток, отвечающих нулевому постинфекционному дню, не взаимодействовала с каким-либо из семи изолятов при проведении иммунопероксидазномонослойного анализа (табл. 8). Все семь изолятов фактора Лелистада взаимодействовали со всеми или большинством сывороток, взятых из совокупности экспериментальных сывороток от свиней 21, 23, 25 и 29, которые были взяты после нулевого постинфекционного дня. Только изоляты US1, US2 и US3 взаимодействовали со всеми или большинством сывороток из совокупности экспериментальных сывороток от поросят 2B, 9G, 16W и 16Y, взятых после нулевого постинфекционного дня.
Проводили исследования по радиоммуноосаждению. Семь специфических в отношении фактора Лелистада белков были обнаружены в макрофагах, инфектированных фактором Лелистада, но при этом они не были обнаружены в неинфектированных макрофагах, осажденных сыворотками 42-го постинфекционного дня от свиней b 822 и 23. По оценкам белки обладали следующими молекулярными весами; 65, 39, 35, 26, 19, 16 и 15 кДа. Только два из этих специфических в отношении фактора Лелистада белка, а именно белки с молекулярным весом 16 и 15 кДа, осаждались также сывороткой MN8 26-го поcтинфекционного дня.
Последовательность у генома фактора Лелистада и его организация
Природа генома фактора Лелистада была установлена анализом ДНК и РНК, взятых из инфектированных свиных легочных альвеолярных макрофагов. Не обнаружена никакая специфическая для вируса Лелистада кислота ДНК. Однако же, в самом деле, была обнаружена специфическая для вируса Лелистада кислота РНК. В 0,8%-ном нейтральном агарозном геле РНК вируса Лелистада мигрирует несколько медленнее, чем препарат РНК вируса свиной холеры с размером 12300 оснований (Moormann et al., 1990), Хотя в нейтральных агарозных гелях и не может быть осуществлено определение точного размера, из сделанных оценок следует, что длина у РНК, специфической для вируса Лелистада, составляет примерно от 14500 до 15500 оснований.
Для установления сложного строения специфических для вируса Лелистада кислот РНК, находящихся в инфектированных клетках, и выявления нуклеотидной последовательности у генома вируса Лелистада готовили кДНК из РНК, взятой из свиных легочных альвеолярных макрофагов, инфектированных вирусом Лелистада, и выбирали и картировали специфические для вируса Лелистада кДНК-клоны, делая это так, как было описано в разделе Материалы и методы. Специфичность кДНК-клонов переподтверждали проведением гибридизации специфических клонов, локализованных по перекрывающейся кДНК-последовательности, для чего получали пятна по Нордерну (Northern), несущие РНК инфектированных вирусом Лелистада и неинфектированных макрофагов. Поразительным было то, что некоторые из кДНК-клонов гибридизировались с РНК размером от 14500 до 15500 оснований, обнаруженных лишь в инфектированных макрофагах, тогда как другие гибридизировались с РНК с размером от 14500 до 15500 оснований, а также с группой из четырех или пяти кислот РНК с меньшим молекулярным весом (согласно сделанным оценкам их размер составлял от 1 до 4 тысяч оснований). Все последние клоны являлись кластерными на одной конце кДНК-карты и охватывали примерно 4000 оснований у ДНК. Из этих данных следует, что геномная организация вируса Лелистада может оказаться схожей с таковой у коронавирусов (Spaan et al., 1988), вируса Берне (Berne virus (BEV); Snijder et al., 1990b), торовируса и вируса лошадиного артериита (de Vries et al., 1990), т.е. помимо геномной РНК там имеются субгеномные кислоты мРНК, образующие сгруппированную совокупность, которая локализуется на 3'- конце. Это предположение было подтверждено, когда стали доступными последовательности, отвечающие кДНК-клонам, и могли быть выбраны специфические праймеры в качестве пробы, необходимой для получения пятен. Совокупность собранных гибридизационных данных, полученных с использованием кДНК-клонов и специфических праймеров, которые были подвергнуты гибридизации с образованием пятен по Нордерну (Northern), несущих РНК инфектированных вирусом Лелистада и неинфектированных макрофагов, показана на фиг. 2. Клоны 12 и 20, которые расположены в 5'-части и в центре последовательности, соответственно гибридизируются с геномной РНК с размером от 14500 до 15500 оснований, обнаруженной только в клетках, инфектированных вирусом Лелистаада. Клоны 41 и 39 распознают, однако, геномную РНК с размером от 14500 до 15500 оснований и совокупность из четырех и пяти кислот РНК с более низким молекулярным весом соответственно. Наиболее поучительная и убедительная гибридизационная схема была получена, однако, при использовании праймера 25, который располагается на самом конце 5'-последовательности, отвечающей вирусу Лелистада (сравните с фиг. 1). Праймер 25 гибридизируется с группой из сети кислот РНК с оцененным молекулярным весом, меняющимся по размеру в пределах от 700 до 3300 оснований (субгеномные кислоты мРНК), а также с геномной РНК. Наиболее вероятным объяснением гибридизационной схемы, отвечающей праймеру 25, является то, что 5'-концевые геномные последовательности, длина которых пока еще остается неизвестной, сливаются с основанием кислот мРНК, которые транскрибируются от 3'-конца генома. В самом деле, из гибридизационной схемы, полученной с использованием праймера 25, следует, что 5'- концевые геномные последовательности функционируют как так называемая "лидерная последовательность" в субгеномных кислотах мРНК. Такая транскрипционная схема является отличительным признаком коронавирусов (Spaan et al., 1988) и вируса лошадиного артериита (de Vries et al., 1990).
Единственное заметное расхождение между вирусом Лелистада и вирусом лошадиного артериита, которое может быть установлено по приведенным выше данным, состоит в том, что геномный размер у вируса Лелистада примерно на 2500 оснований больше, чем у вируса лошадиного артериита.
Согласованная нуклеотидная последовательность из перекрывающихся кДНК-клонов показана на фиг. 1. Длина последовательности составляет 15088 пар оснований, что находится в хорошем согласии с оцененным размером геномной РНК вируса Лелистада.
Поскольку кДНК-библиотека для вируса Лелистада была образована в условиях случайного воздействия праймера при обратном транскриптазном взаимодействии с праймерами pd (N ) 6 из тимуса теленка, не были получены какие-либо кДНК-клоны, которые начинаются с полиадениловокислотного участка их 3'-конца. С целью клонирования 3'-конца вирусного генома была сконструирована вторая кДНК-библиотека, для чего были использованы олигообразование (dT) и праймер 39 U183R в обратной транскриптазной реакции. Праймер 39 U183R является комплементарным к спиральной РНК минусового направления вируса Лелистада, которая, по-видимому, присутствует в препарате РНК, выделенном из клеток, инфектированных вирусом Лелистада. Эту библиотеку сортировали с использованием специфических в отношении вируса проб (транслированный в необходимой области кДНК-клон 119 и олигонуклеотид 119R64R), результатом чего явилось выделение пяти дополнительных кДНК- клонов (например, кДНК-клон 151 фиг. 2). При выявлении порядка расположения аминокислотных остатков в этих кДНК-клонах было установлено, что вирус Лелистада содержит 3'-полиадениловокислотный хвост. Длина этого полиадениловокислотного хвоста является различной у разных кДНК-клонов; однако максимальная длина составляет двадцать нуклеотидов. Помимо клонов 25 и 155 (фиг. 2) на 5'-конце генома были выделены четыре дополнительных кДНК-клона, которые оказались всего лишь на 2 - 3 нуклеотида короче, чем предельный 5'-нуклеотид, показанный на фиг. 1. С учетом этого факта и способа синтеза кДНК было высказано предположение, что получена картина, которая является очень близкой к имеющей место в случав 5'-конца последовательности геномной РНК вируса Лелистада.
Почти 75% геномной последовательности вируса Лелистада кодирует кадры открытого считывания ORF IA и ORF IB. Кадр открытого считывания ORFIA инициируется, по-видимому, в первом триплете АУГ (AUG, нуклеотидное положение 212, фиг. 1), встречающемся в последовательности вируса Лелистада. У кадра открытого считывания ORF IA C-конец перекрывает предполагаемый N-конец кадра открытого считывания ORF IB, что происходит на небольшом участке в 16 нуклеотидов. Представляется тем самым, что трансляция кадра открытого считывания ORF IB осуществляется через рибосомальное смещение кадра, что является характерным признаком способа трансляции полимеразного или репликазного гена у коронавирусов (Boursnell et al., 1987; Bredenbeek et al., 1990) и торовирусов вируса Берне (BEV, Berne virus) (Snijder et al., 1990a). Характерная РНК-псевдоузельная структура, которая, как считают, должна образовываться в месте рибосомального сдвига кадра, также обнаруживается в этом местоположении у последовательности вируса Лелистада (результаты не показаны).
Кадр открытого считывания ORF IB кодирует аминокислотную последовательность, состоящую почти из 1400 остатков, которая много меньше, чем у кадров открытого считывания ORF IB коронавирусов, таких как вирус инфекционного гепатита (MHV) и вирус инфекционного бронхита (IBV)(примерно 3700 аминокислотных остатков; Bredenbeek et al., 1990; Boursnell et al., 1987) и вирус Берне (Berne) (примерно 2300 аминокислотных остатков; Snijder et al., 1990a). Характерные особенности проявления кадра открытого считывания ORF IB у членов суперсемейства коронавирусов, такие как репликазный лейтмотив A и наличие цинкфингерной области, могут быть также найдены у кадра открытого считывания ORF IB вируса Лелистада (результаты не показаны).
Тогда как кадры открытого считывания ORF IA и ORF IB кодируют вирусную полимеразу и, следовательно, как это считают, кодируют неструктурированный вирусный белок, кадры открытого считывания от ORF 2 до ORF 7 кодируют, как это полагают, структурированные вирусные белки.
Продукты от наличия кадров открытого считывания от ORF 2 до ORF 6 обнаруживают специфические особенности, напоминающие связанные с мембраной (оболочкой) белки. Кадр открытого считывания ORF 2 кодирует белок из 249 аминокислот, содержащий два предсказанных N-связанных сайта гликозилирования (табл. 9). На N-конце идентифицируется гидрофобная последовательность, которая может функционировать как так называемая сигнальная последовательность. Конец C также завершается гидрофобной последовательностью, которая в этом случае может функционировать как трансмембранная область, которая захватывает результат проявления кадра открытого считывания ORF 2 со встраиванием в вирусную оболочечную мембрану.
Кадр открытого считывания ORF 3 может инициироваться на стартовом триплете АУГ (AUG) в нуклеотидном положении 12394 или на стартовом триплете АУГ (AUG) в нуклеотидном положении 12556 и затем кодировать белки, соответственно содержащие 265 и 211 аминокислот. Белок из 265 остатков содержит семь предполагаемых N-связанных сайтов гликозилирования, тогда как белок из 211 остатков содержит четыре сайта (табл. 9). На N-конце белка, состоящего из 265 остатков, идентифицируется гидрофобная последовательность.
Судя по результатам проведения анализа на гидрофобность, топология белка, закодированного кадром открытого считывания ORF 4, является аналогичной таковой у белка, закодированного кадром открытого считывания ORF 2, если считать, что проявление кадра открытого считывания ORF 4 инициируется на стартовом триплете АУГ (AUG) в нуклеотидном положении 12936. Однако кадр открытого считывания ORF 4 может также инициироваться в двух иных АУГ-кодонах (сравните фиг. 1 и 2) со стартовыми положениями в последовательности, приходящимися соответственно на нуклеотиды 12981 и 13068. Пока еще остается неясным, какой используется стартовый кодон. В зависимости от используемого стартового кодона кадр открытого считывания ORF 4 может кодировать белки из 183 аминокислот, содержащих четыре предполагаемых N-связанных сайта гликозилирования, из 168 аминокислот, содержащих четыре предполагаемых N-связанных сайта гликозилирования, или из 139 аминокислот, содержащих три предполагаемых N-связанных сайта гликозилирования (табл. 9).
Считают, что кадр открытого считывания ORF 5 кодирует белок из 201 аминокислоты, содержащей два предполагаемых N-связанных сайта гликозилирования (табл. 9). Характерной особенностью проявления кадра открытого считывания ORF 5 является наличие внутренней гидрофобной последовательности, расположенной в области от аминокислоты 108 до аминокислоты 132. Из анализа мембранных соединительных сегментов и гидрофильности продукта проявления кадра открытого считывания ORF 6 следует, что он содержит три трансмембранных соединительных сегмента на N-концевом участке своей последовательности, состоящей из 90 аминокислот. Эта отличительная особенность является также характеристикой небольшого оболочечного гликопротеида М или EI у нескольких коронавирусов, например у вируса инфекционного бронхита (IBV; Boursnell et al. , 1984) и у вируса мышиного гепатита (MHV; Rottier et al., 1986). Можно, следовательно, считать, что белок, закодированный кадром открытого считывания ORF 6, обладает мембранной топологией, аналогичной такой у белка М или EI коронавирусов (Rottier et al., 1986). Второй характерной особенностью белка М или EI является наличие так называемой поверхностной спирали, которая располагается в непосредственной близости от предполагаемой третьей трансмембранной области. Эта последовательность, состоящая примерно из 25 аминокислот, которая является вполне консервативной у коронавирусов, также распознается, хотя и в значительно более вырожденном состоянии, у вируса Лелистада. Все же предполагается, что проект проявления кадра открытого считывания ORF 6 у вируса Лелистада обладает аналогичной связанной с мембраной функцией, как это наблюдается в случае белка М или EI коронавирусов. Кроме того, белок, закодированный кадром открытого считывания ORF 6, обнаруживает сильную схожесть (53% идентичных аминокислот) с образованием VpX (Godeny et al., 1990) вируса элевации лактатдегидрогеназы.
Белок, закодированный кадром открытого считывания ORF 7, обладает длиной в 128 аминокислотных остатков (табл. 9), которая на 13 аминокислот превышает длину последовательности VpI у вируса элевации лактатдегидрогеназы (Godeny et al., 1990). Все же наблюдается значительная схожесть (43% идентичных аминокислот) между белком, закодированным кадром открытого считывания ORF 7, и VpI. Еще одна общая характерная особенность продукта проявления кадра открытого считывания ORF 7 и VpI сводится к наличию высокой концентрации основных остатков (аргинин, лизин и гистидин - Arg, Lys, His) на N-концевой половине белка. До аминокислоты 55 последовательность у вируса Лелистада содержит 26% аргинина, лизина и гистидина. Этот результат находится в полном согласии с предполагаемой функцией продукта проявления кадра открытого считывания ORF 7 или VpI (Godeny et al., 1990), а именно c инкапсидацией вирусной геномной РНК. На оснований изложенных выше данных делается предположение, что продукт проявления кадра открытого считывания ORF 7 у вируса Лелистада представляет собой нуклеокапсидный белок N вируса.
Схематическое представление организации генома у вируса Лелистада показано на фиг. 2. Карта из перекрывающихся клонов, использования для определения последовательности у вируса Лелистада, показана в верхней группе. Линейное изображение этой карты с указанием концов 5' и 3' у нуклеотидной последовательности вируса Лелистада показано на фиг. 1; масштаб в тысячах оснований приводится под картой из кДНК-клонов, чем обеспечивается возможность последовательного расположения этих клонов в последовательности. Положение кадров открытого считывания, идентифицированных у генома вируса Лелистада, указывается ниже под линейной картой последовательности вируса Лелистада. Нижняя группа изображает сведенную воедино совокупность субгеномных кислот мРНК и положение этих кислот РНК по отношению к последовательности у вируса Лелистада.
В согласии с представлениями о трансляционной стратегии у субгеномных кислот мРНК коронавирусов, торовирусов и артеривирусов делается предположение, что кадры открытого считывания ORF от 1 до 6 транслируются c единого 5'-конца их геномных кислот или кислот мРНК. Считается, что эта специфическая часть кислот мРНК представляет собой ту часть РНК, которая получается при "вычитании" РНК меньшего молекулярного веса из РНК с большим молекулярным весом, последовательно идущей за ней. Хотя РНК 7 и образует 3'-конец у всех других геномных и субгеномных кислот РНК и тем самым не характеризуется наличием некой уникальной области, полагают, что кадр открытого считывания ORF 7 транслируется лишь с этой самой маленькой по размеру мРНК. "Лидерная последовательность", расположенная на 5'-конце у субгеномных кислот РНК, указывается зачерненным прямоугольником. Длина этой последовательности составляет примерно 200 оснований; однако точное место слияния с основанием геномных кислот РНК предстоит еще определить.
Экспериментальная репродукция таинственной болезни свиней
Восемь беременных свиноматок были инокулированы фактором Лелистада; и у этих свиноматок воспроизводили клинические признаки таинственной болезни свиней, такие как отсутствие аппетита и репродуктивные потери. По прошествии от четырех до 10 - 12 дней после инокуляции все свиноматки стали обнаруживать отвращение к еде. Ни одна из свиноматок не характеризовалась наличием повышенной температуры. У двух свиноматок стали синеватыми уши, что обнаружилось на 9-й и 10-й постинфекционные дни. В табл. 6 приведены данные о дне рождения и числе живых и мертвых поросят приходящихся на свиноматку. Фактор Лелистада выделяли из 13 рожденных поросят.
Примечание к табл 2:
d) Свиней, свободных от этого специфического патогенного микроорганизма, либо держали в контакте (с) со свиноматкой, подозреваемой в заражении таинственной болезнью свиней, либо на нулевой день эксперимента внутримышечно вводили 10 мл этилендиаминтетрауксуснокислотной крови (b) oт такой свиноматки. Группы из одной свиноматки и трех свободных от этого специфического патогенного микроорганизма поросят (с) держали в одном загоне, и все четыре такие группы помещали в одном хлеву. На шестой день одну свинью, свободную от этого специфического патогенного микроорганизма, которую брали из каждой группы, убивали и миндалину и легкие использовали для выделения вируса. Четыре группы свободных от этого специфического патогенного микроорганизма свиней, инокулированных кровью (b), помещали в четыре других загона, находящихся в отдельном хлеву. Назальные мазки у свободных от этого специфического микроорганизма свиней брали на второй, пятый, седьмой и девятый дни, считая от начала эксперимента, и этилендиаминтетрауксуснокислотную кровь, предназначенную для выделения вируса из плазмы и лейкоцитов, брали всегда, когда у свиньи обнаруживалась лихорадка.
*) Результаты приводятся в виде числа изолятов, приходящихся на свинью.
LA - фактор Лелистада.
PEV 7 - свиной энтеровирус типа 7.
#/ В скобках приведены начальные буквы названия фермы, откуда происходила свиноматка
1) Плавучую плотность, которую находили в предварительно образованных линейных градиентах хлорида цезия в фосфатно-солевом буферном растворе, определяли согласно стандартным методикам (Brakke, 1967). Приведенная величина отвечает плотности, при которой степень заражения проходит через максимум.
2) Инфектированные и неинфектированные клеточные культуры, подвергаемые исследованию, претерпевали замораживание-оттаивание. Клеточные лизаты центрифугировали в течение 30 мин при 130000 G, результирующий твердый остаток от центрифугирования отрицательно окрашивали, что делали согласно стандартным методикам (Brenner and Horne, 1959), и подвергали исследованию на электронном микроскопе типа СМ 10 фирмы "Филипс". Приведенная величина отвечает размеру частиц, которые присутствовали в инфектированных и отсутствовали в неинфектированных культурах.
3) Чувствительность к хлороформу определяли согласно стандартным методикам (Grist, Ross and Bell, 1974).
4) Изоляты с дозами от 100 до 300 TCID50 смешивали при меняющихся разбавлениях со специфическими антисыворотками и выращивали в надлежащей клеточной системе до момента появления полного цитопатического эффекта. Сыворотки с титрами выше пяти подвергали повторному тестированию, и сыворотки, которые характеризовались высокими титрами по цитопатическому эффекту, считали специфическими в отношении изолята. Изоляты, не обладавшие чувствительностью к хлороформу, тестировали с использованием сывороток, направленных против свиных энтеровирусов (PEV) от 1 до 11 (благодаря любезности д-ра Ноулза (Knowles), Пирбрайт, Великобритания), против вируса энцефаломиокардита (EMCV; благодаря любезности д-ра Ала (Ahl), Тюбинген, Германия), против свиного парвовируса и против свиной везикулярной болезни. Изолят (код CDI-NL-2.91), чувствительный к хлороформу, тестировали с использованием антисывороток, специфически направленных против вируса псевдобешенства, вируса бычьего герпеса 1, вируса бычьего герпеса 4, злокачественного катарального вируса, вируса бычьей вирусной диареи, вируса свиной холеры, вируса свиного гриппа H1N1 и H3N2, вируса парагриппа 3, бычьего респираторного синцитиального вируса, вируса передаваемого гастроэнтерита, вируса свиной эпидемической диареи, вируса гемагглютинирующего энцефалита, вируса инфекционного бронхита, вируса бычьего лейкоза, вируса птичьего лейкоза, вируса заболевания маедни-висна, и с использованием экспериментальных сывороток, полученных на свободных от этого специфического патогенного микрообразования свиньях (см. табл. 5).
В табл. 4 приведены результаты, полученные при проведении серологии на парных реальных сыворотках, полученных на свиноматках, подозреваемых в заражении таинственной болезнью свиней. Сыворотки брали в острый период заболевания и 3 - 9 недель спустя. Приведенная величина представляет собой число свиноматок, которые обнаруживали четырехкратное или более высокое повышение титра; в знаменателе указано число тестированных свиноматок.
Примечание к табл. 4.
Сыворотки тестировали проведением тестов по гемагглютинирующему ингибированию с целью обнаружения антитела, направленного против вируса гамагглютинирующего энцефалита (HEV) и вирусов свиного гриппа H1N1 и H3N2, проведением иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (ELISA) с целью обнаружения антитела, направленного против гликопротеида gI вируса псевдобешенства (PRV), против парвовируса свиней (PPV), против вируса бычьей вирусной диареи (BVDV) и против вируса свиней холеры (HCV)
Сыворотки тестировали проведением тестов по нейтрализации сыворотки (SNT), проводимых с целью обнаружения антитела, направленного против вируса энцефаломиокардита (EMCV), выделенного (i) вируса энцефаломиокардита (EMCV), свиных энтеровирусов (PEV) 2 и 7 и PEV -изолятов (i), и против фактора Лелистада (LA), и тестировали проведением иммунопероксидазномонослойного анализа (IPMA), проводимого с целью обнаружения антитела, направленного против фактора Лелистада (LA)
f) Откармливаемые свиньи.
i) Время между отбором первой и второй сыворотки.
n) Общее число свиней, у которых первая сыворотка дала отрицательный результат в тесте при проведении исследования и из которых вторая сыворотка также дала отрицательный результат или обнаружила менее чем четырехкратное, повышение титра.
p) Общее число свиней, у которых первая сыворотка дала положительный результат и из которых вторая сыворотка обнаружила менее чем четырехкратное, повышение титра.
s) Общее число свиней, у которых вторая сыворотка дала четырехкратное или более высокое повышение титра, чем первая сыворотка, в тесте при проведении исследования.
ND - не проводили.
Литература
Boer, G. F. de, Back, W., and Osterhaus, A.D.M.E., (1990) An ELISA for detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in human and various animal species. Arch. Virol. 115, 47-61.
Boursnell, M. E. G., Brown, T.D.K., and Binns, M.M., (1984) Sequence of the membrane protein gene from avian coronavirus IBV, Virus Res. 1, 303-314.
Boursnell, M.E.G., Brown, T.D.K., Foulds, I.J., Green, P.F., Tomley F.M. , and Binns, M.M., (1987) Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus, J. Gen. Virol. 68, 57-77.
Brakke, M. K. , (1967) In: Methods in Virology, Volume II, pp. 93-117 (Edited by K. Maramorosch and H. Koprowski) New York, Academic Press.
Bredenbeek, P.J., Pachuk, C.J., Noten, J.F.H., Charite, J., Luytjes, W., Weiss, S.R., and Spaan, W.J.M., (1990) The primary structure and expression of the second open reading frame of the polymerase gene of coronavirus MHV-A59. Nucleic Acids Res. 18, 1825-1832.
Brenner, S., and Horne, R.W., (1959) A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochimica et Biophysica Acta 34, 103-110.
Brinton-Darnell, M. , and Plagemann.P.G., (1975) Structure and chemical-physical characteristics of lactate dehydrogenase-elevating virus and its RNA, J. Viroi. 16, 420-433.
Favaloro, J. , Treisman, R. & Kamen, R., (1980) In: Methods in Enzymology, vol. 65, 718-749 (eds. Grossman, L. & Moldave, K.) Academic Press, New fork.
Godeny, E.K., Speicher, D.W., and Brinton, M.A., (1990) Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV) capsid protein (Vp1) gene, Virology, 177, 768-771.
Grist, N. R., Ross, C.A., and Bell, E.J., (1974) ln: Diagnostic Methods in Clinical Virology, p. 120, Oxford, Blackwell Scientific Publications.
Gubler, U., and Hoffman, B.J., (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25, 263-269.
Hanahan, D., (1985) In: DNA Cloning I; A Practical Approach, Chapter 6, 109-135.
Hill, H. , (1990) Overview and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility Respiratory Syndrome), In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison WI, USA.
Hirsch, J.G. & Fedorko, M.E., (1968) Ultrastructure of human leucocytes after simultanous fixation with glutaraldehyde and osmiumtetroxide and postfixation in uranylacetate, Journal of Cellular Biology 38, 615.
Horzinek, M.C., Maess, J., and Laufs, R., (1971) Studies on the substructure of togaviruses II. Analysis of equine arteritis, rubella, bovine viral diarrhea and hog cholera viruses, Arch. Gesamte Virusforsch. 33, 306-318.
Hyllseth, В. , (1973) Structural proteins of equine arteritis virus. Arch. Gesamte Virusforsch. 40, 177-188.
Kasza, L. , Shadduck, J.A., and Christoffinis, G.J., (1972) Establishment, viral susceptibility and biological characteristics of a swine kidney cell line SK-6, Res. Vet. Sci. 13, 46-51.
Loula, Т. , (1990) Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets. In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison Wl, USA.
Masurel, N., (1976) Swine influenza virus and the recycling of influenza A viruses in man, Lancet ii, 244-247.
Mazancourt, A. de, Waxham, M. N. , Nicholas, J.C., & Wolinsky, J.S., (1986) Antibody response to the rubella virus structural proteins in infants with the congenital rubella syndrome. J. Med. Virol. 19, 111-122.
Mengeling, W. L., and Lager, K.M., (1990) Mystery Pig Disease: Evidence and considerations for its etiology, In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison Wl, USA.
Moormann, R.J.M., and Hulst, M.M., (1988) Hog cholera virus: identification and characterization of the viral RNA and virus-specific RNA synthesized in infected swine kidney cells, Virus Res. 11, 281-291.
Moormann, R.J.M., Warmerdam, P.A.M., van der Meer, B., Schaaper, W.M.M., Wensvoort, G. , and Hulst, M.M., (1990). Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein El, Virology, 177, 184-198.
Olrschot, J. T. van, Houwers, D.J., Rziha, H.J., and Moonen, P.J.L.M., (1988) Development of an ELISA for detection of antibodies to glycoprotein I of Aujeszky's disease virus: a method for the serological differentiation between infected and vaccinated pigs, J. Virol. Meth. 22, 191-206.
Pearson, W. R. , and Lipman, D.J., (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448.
Reed, L. J., and Muench, H., (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497.
Rottier, P. J. M., Welling, G.W., Welling-Wester, S., Niesters, H.G.M., Lenstra, J.M., and van der Zeijst, B.A.M., (1986) Predicted membrane topology of the coronavirus protein El. Biochemistry 25, 1335-1339.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor NY.
Sethna, P.B., Hung, S-L., and Brian, D.A., (1989) Coronavirus subgenomic minus-strand RNAs and the potential for mRNA replicons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5626-5630.
Setzer, D. R., McGrogan, M., Nunberg, J.H. & Schimke, R.T., (1980) Size heterogeneity in the 3'-end of the dehydrofolate reductase messenger RNA's in mouse cells, Cell 22, 361-370.
Snijder, E.J., den Boon, J.A., Bredenbeek, P.J., Horzinek, M.C., Rijnbrand, R. , and Spaan. W.J.M., (1990a) The carboxyi-terminal part of the putative Berne virus polymerase is expressed by ribosomal frameshifting and contains sequence motifs which indicate that toro- and coronaviruses are evolutionary related, Nucleic Acids Res. 18, 4535-4542.
Snijder, S. J. , Horzinek, M.C., and Spaan, W.J.M., (1990b) А 3'-coterminal nested set of independently transcribed messenger RNAs is generated during Berne virus replication. J.Virol. 64, 355-353.
Spaan, W. J.M., Cavanagh, D., and Horzinek, M.C., (1988) Coronaviruses: structure and genome expression. J. Gen. Virol. 69, 2939-2952.
Strauss, W.M., (1987) Preparation of genomic DNA from mammalian tissue, In: Current protocols in molecular biology (eds. Ausubel F.M et ai.) 2.2.1 John Wiley & Sons, New York.
Terpstra, C. , (1978) Detection of Border disease antigen in tissues of affected sheep and in cell cultures by immunofluorescence, Res. Vet. Sci. 25, 350-355.
Venable, J. H. & Coggeshall, R., (1965) A simplified lead citrate stain for use in electronmicroscopy, Journal of Cellular Biology 25, 407.
Vries, A. A.E. de, Chirnside, E.D., Bredenbeek, P.J., Gravestein, L.A., Horzinek, M. C. , and Spaan, W.J.M., (1990) All subgenomic mRNAs of equine arteritis virus contain a common leader sequence, Nucleic Acids Res. 18, 3241-3247.
Wensvoort, G. , and Terpstra, C., (1988) Bovine viral diarrhoea infections in piglets from sows vaccinated against swine fever with contaminated vaccine. Res. Vet. Sci. 45, 143-148.
Wensvoort, G. , Terpstra, C., and Bloemraad, M., (1988) An enzyme immunoassay, employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies against classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 17, 129-140.
Wensvoort, G. , Terpstra, C., Boonsta, J., Bloemraad, M., and Zaane, D. van, (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in aboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12, 101-108.
Wensvoort, G. , Terpstra, C., and Kluyver, E.P. de, (1989) Characterization of porcine and some ruminant pestiviruses by cross-neutralization. Vet. Microbiol. 20, 291-306.
Westenbrink, E., Middel, W.G.J., Straver, P., and Leeuw, P.W. de, (1986) A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for bovine virus diarrhoea virus serology, J. Vet. Med. B 33, 354-361.
Westenbrink, E., Veldhuis, M.A., and Brinkhof, J.M.A., (1989) An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine parvo virus, J. Virol. Meth. 23, 169-178.
Zeijst, B. A. M. van der, Horzinek, M.C., and Moennig, V., (1975) The genome of equine arteritis virus. Virology, 68, 418-425.
Изобретение предназначено для диагностики таинственного заболевания свиней. Выделяют этиологический фактор таинственного заболевания свиней, называемый фактор Лелистада. Выделенный фактор используют для вакцинации и диагностики заболевания. Изобретение позволяет предупреждать, а также диагностировать заболевание на ранней стадии. 13 с. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл.
| Hill, H., (1990) Overview and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility Respiratory Syndrome), In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison WI, USA. |
