Изобретение касается нового пептида, пригодного для получения вакцины, эффективной против гормона, секретирующего лютенизирующий гормон, называемого также как "гормон, секретирующий гонадотропин".
Изобретение далее касается иммуногенных композиций на основе такого пептида.
Гормон, секретирующий лютенизирующий гормон, является небольшим пептидом, содержащим 10 аминокислот (т.е. декапептид) и последовательность аминокислот согласно формуле (как обычно с аминоконцевой аминокислотой слева и карбоксиконцевой аминокислотой справа):
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, в которой аминокислоты обозначены в соответствии с трехбуквенным кодом, или согласно формуле:
EHWSYGLRPGL, в которой аминокислоты обозначены в соответствии с однобуквенным кодом E, не является пироглутаминовой кислотой и Gl является амидом глицина.
Известно, что гормон, секретирующий лютенизирующий гормон, будучи соединен с белком-носителем, может быть использован для вакцинации млекопитающих. Такая вакцинация может быть осуществлена по различным причинам, которые все связаны с естественной функцией гормона, секретирующего лютенизирующий гормон (ЛГ). Гормон, секретирующий ЛГ, образованный в гипоталамусе, регулирует в гипофизе образование половых гормонов ЛГ (то есть лютенизирующего гормона) и ФСГ (т.е. фолликулостимулирующего гормона). Как известно, резкое снижение количеств ЛГ и ФСГ в крови приводит к тому, что у самцов животных ингибируется продуцирование андрогенов и спермы в яичниках, а у самок животных ингибированы образование прогестагенов и эстроегнов и развитие фолликул в яичниках. Такое снижение количеств андрогенов, прогестагенов и эстрогенов в крови до уровня, сравнимого с получаемым при кастрации или овариэктомии, может быть получено эффективной иммунизацией животных против гормона, выделяющего ЛГ. В ветеринарии 100 эффективная иммунизация может быть использована для стерилизации, например, мелких домашних животных, таких как самцы и самки кошек, или для лечения агрессивности у самцов собак вместо радикальной хирургии, такой как кастрация или овариэктомия. Другими возможными целями иммунизации против гормона, продуцирующего ЛГ, являются предупреждения повышения температуры тела у собак и накопления жира у кастрированных животных. В медицине иммунизация против гормона, секретирующего ЛГ, может быть использована при лечении рака простаты и рака молочной железы и, если требуется, при лечении некоторых форм рака гипофиза.
Кроме этого композиция по изобретению против гормона, секретирующего ЛГ, может использоваться в накоплении жира свиньями перед убоем. Мясо самца половозрелых свиней ("хряка") имеет типичный запах, так называемый "запах хряка". У достигшей половой зрелости свиньи в яичниках образуется много стероидов, которые накапливаются в жировой ткани. Эти стероиды (стероиды C19 16) ответственны за неприятный мочеподобный "запах хряка", образующийся при нагревании мяса [см. Broks et al. J. Anim, Sci, 62, 1279 (1986)] Поэтому мясо самца достигшего половой зрелости едва ли годится в пищу. По причине того, что около 10 процентов самцов забитых свиней уже достигают полового созревания до времени убоя, то этот потенциал означает большие потери для свиноводства. Для предотвращения этих потерь всех самцов свиней кастрируют в молодом возрасте без исключения. Кроме неприятного аспекта такой кастрации для животного, она приводит также к замедлению роста и ухудшению качества конечного мяса по сравнению с интактным животным (по меньшей мере, до тех пор, пока у этого интактного животного не развился "запах хряка").
Альтернативой для животного, которая в дополнение к безболезненной процедуре, улучшает качество мяса, является иммунизация молодых животных против гормона, секретирующего ЛГ, которая снижает концентрацию гормона, секретирующего ЛГ, в гипофизе молодых животных. Это снижает концентрации гормона, секретирующего ЛГ в гипофизе, приводит к снижению концентраций биологически активных ЛГ и ФСГ в крови, которое в свою очередь выражается в прекращении развития яичек у растущего животного или в замедлении их развития, так что образуется меньше стероидов. Поэтому эффективной вакцинацией против гормона, секретирующего ЛГ, можно избежать развития нежелательного "запаха хряка" у свиней ко времени из убоя.
В действительности на практике оказывается, что у самцов животных развитие яичек может быть задержано или прекращено вакцинацией гормоном, секретирующим ЛГ, связанным с белком-носителем. Результаты, однако, зачастую различны, если используют известные препараты вакцин, такие как препараты на основе самого гормона, секретирующего ЛГ, или на его аналоге, таком как (Д-трп6) гормон, секретирующий ЛГ (см. Chaffaux et al. Recuil de Medecine Veterinanre, 161, 133 145, 1985). Например, могут быть вакцинированы животные, которые с трудом, если вообще не реагируют на вакцинацию. В случае вакцинации самцов свиней в молодом возрасте для предотвращения развития "запаха хряка" от хорошей вакцины требуется, чтобы развитие яичек у всех животных было задержано до такой степени, чтобы ни в коем случае (до 35 недельного возраста) не развивался "запах хряка", ни даже в очень большой популяции свиней. Известные препараты вакцины не удовлетворяют этим требованиям.
Это также относится к иммуногенным вакцинам гормона, секретирующего ЛГ, описанным в патенте США N 4608251. Предложенные в нем вакцины созданы на основе нона- или декапептида, имеющем формулу: (C)KWSYGLRPGl, или на димере декапептида, который может быть образован связыванием через аминоконцевые цистерны, и отвечает формуле:
.
Этот димер, по-видимому, не более эффективен, чем мономерные пептиды.
Заявка на международный патент N WO 88/05308 представляет вакцины гормона, секретирующего ЛГ, на основе частичных пептидов гормона, секретирующего гормон ЛГ, имеющих длину 5, 6 или 7 аминокислот, особенно тех пептидов, которые включают либо амино-концевую пироглутаминовую кислоту, или карбоксиконцевую группу амида глицина. Примерами таких частичных пептидов являются (даны в однобвуквенном коде): EHWSY,EHWSYG,EHWSYGL, HWSYGLR, WSYGLR, SYGLRPGG и YGLRPGG.
Однако вакцины на основе этих частичных пептидов обнаруживают упомянутые выше недостатки.
Неожиданно установлено, что лучшую и особенно более надежную вакцину получают на основе пептида, имеющего тандемную структуру гормона, секретирующего ЛГ, то есть пептида, содержащего по меньшей мере две последовательности гормона, секретирующего ЛГ, расположенные одна за другой.
Задачей изобретения является создание нового пептида, содержащего по меньшей мере две последовательности аминокислот гормона, секретирующего ЛГ, расположенные одна за другой и создание, на его основе новой композиции, вызывающий иммунный ответ на LHRH.
Таким образом изобретение относится к новому пептиду, общей формулы I:
pGlu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro- (Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Agr-Pro)n-Gly-Cys-NH2,
где
Trp1 триптофан
Tpr2 триптофан и N формилтриптофан,
n 1 5.
Изобретение касается также композиции, которая характеризуется тем, что содержит пептид согласно изобретению, приведенный в иммуногенную форму. Известны различные методы приведения вещества, которое само по себе не иммуногенное, в иммуногенную форму. Для химического связывания используют C или N-терминалы (патент США А-4608251 и заявку на международный патент WO 88/05308).
Другой возможностью является преобразование пептида сшивкой в более крупный комплекс или экспрессировать пептид посредством манипуляцией рекомбинатной ДНК как части (более крупного) белка. Поэтому изобретение предусматривает также композицию, содержащую иммуногенный комплекс или иммуногенный рекомбинантный белок, к которому принадлежит пептид согласно изобретению в сочетании по меньшей мере с одним иммуноадьювантом, например, полный адьютант (стимулятор) Фрейнда и неполный стимулятор Фрейнда.
Таким образом композиция по изобретению включает в себя активный ингредиент и носитель, причем в качестве активного ингредиента используют производные пептида общей формулы I, а в качестве носителя иммуногенный конъюгат белка и дополнительно иммуноадьювант в массовом соотношении 1:1:1.
Изобретение поясняется более детально примерами.
Пример 1. Синтез пептида.
Используют растворители и реагенты про-аналитического качества, фирмы Merck, ФРГ. Их используют без дополнительной очистки: дихлорметан (ДХМ) очищают через колонку с активированным основным оксидом алюминия. Используют Boc-аминокислоты, 4-метилбензгидриламиновую (МБГА) смолу и бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфоний-гексафторфосфат (БОФ, реагент Кастро) фирмы Novabiochem, Laufelfingep, Швейцария.
Синтез проводят в стеклянном сосуде на 250 мл со стеклянным фильтром на дне. Промывка, снятие защиты Boc и стадии сочетания проводят вручную. Сочетание проводят с использованием БОФ реагента и с нейтрализацией "in situ" (1) диизопропилэтиламином (ДИЭА).
Более подробно: через 24 ч набухания в смеси 50% ДМФА/ДХМ, МБГА смолу (1% дивинилбензола, 0,75 мэкв. /мг, 5,1 г) промывают ДХМ. Boc-Cys(Mob), Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Tyr(2-BrZ), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp(For), Boc-His(Tos), Boc-Gln, Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Bos-Leu, Boc-Gly, Bou-Tyr(2-Brz), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp(For), Boc-His(Tos) и Boc-pGlu и последовательно сочетают, следуя приведенным ниже циклам сочетания:
1. Промывка ДХМ (два раза, 2 мин).
2. Промывка 50% (об./об.) TFA/ДХМ (один раз, 2 мин).
3. Смещение в азоте с 50% (об./об.) TFA/ДХМ (один раз, 20 мин).
4. Промывка ДХМ (два раза, 2 мин).
5. Промывка изопропанолом (два раза, 2 мин).
6. Промывка диметилформамидом (ДМФА) (два раза, 2 мин).
7. Стадия сочетания при смешении в атмосфере азота (90 мин).
8. Промывка ДМФА (2 раза, 2 мин).
Стадия сочетания: к МБГА смоле (3,8 ммоля), суспендированной в минимальном количестве ДМФА, добавляют в атмосфере азота 11,3 ммоля Boc-аминокислоты в 12 мл ДМФА. Добавляют БОФ) 11,3 ммоля) в 12 мл ДМФА с последующим непосредственным добавлением ДИЭА (26,4 ммоля). Окончание сочетания проверяют с помощью нингидридного теста Кайзера (3). Выход 16,9 г.
Снятие защиты: часть пептидной смолы (5,9 г) обрабатывают безводной HF, содержащей 10% анизола, в течение 1 ч. при 0oC. После удаления в вакууме HF, сырой реакционный продукт растворяют в 10% уксусной кислоты и фторид-ион заменяют на ацетат-ион с использованием ионообменной смолы (BioRad RG 2-ХЗ: ацетатная форма). Раствор пептида лиофизируют. Выход 9,1%
Очистка пептида.
До очистки формильные боковые защитные цепочки триптофана удаляют путем обработки основанием. Более подробно: 200 мг сырого продукта растворяют в 600 мкл ДМФА, 900 мкм воды и добавляют 150 мкл 4 н. раствора NaOH. Смесь перемешивают 10 мин. и добавляют последовательно 200 мкл 2-меркаптоэтанола и 20 мкл уксусной кислоты.
Очистку проводят с помощью жидкостного хроматографа Хьюлетт Паккард 1082В, оборудованном колонкой Bishoff Prep 2025 (20 mm x 250 mm), наполненной Polygosil C18 (10 мкл). Пептид детектируют при 230 нм с использованием спектрофотометра Spectroflow 757. Приблизительно 375 мкл образца (содержащего около 40 мг сырого пептида) с 600 мл воды и несколькими каплями трифторуксусной кислоты вводят в прибор и элюируют с линейным градиентом от 30% B до 42,5% B в течение 50 мин при скорости потока 10 мл/мин (элюент A - 20% метанола в воде с 0,1% трифторуксусной кислоты; элюент B 80% метанола в воде с 0,1% трифторуксусной кислоты). Основные фракции собирают около пика, соответствующего 33 мин, метанол упаривают на роторном пленочном испарителе, и полученный раствор лиофилизуют. Выход 18 мг.
Пример 2.
Три группы поросят (по пять животных в каждой) вакцинировали после рождения (день 0) вакциной гормона, освобождающего лютенизирующий гормон. Вакцина состояла из пептида, связанного с белком-носителем KLH (дисковидный с отверстием гемоцианин) через C-концевой цистени. Эту связь осуществляли посредством соединения сложного эфира m-малеимидобензоил-N-оксисукцинимида, см. Geysen et al. PNAS, 81, 3998 4002, (1984).
Использовали следующие пептиды:
группа 1: гормон, высвобождающий лютенизирующий гормон, формулыEHWSYGLRPGCl;
Группа 11: (Д-трп6 гомон, высвобождающий лютенизирующий гормон, формулы: EHWSY (Д-трп6) LRPGCl;
группа 111: тандемный гормон, высвобождающий лютенизирующий гормон, формулы: EHWSYGLRPGQHWSGLRPGCl.
Пептиды эмульгировали после связывания с гемоцианином KLH (1мг пептида на 1 мг гемоцианина KLH) в одном мл полного стимулятора Фрейнда (1 мл раствора пептид-гемоцианин в 1 мл полного стимулятора Фрейнда). Эмульсию инъецировали внутримышечно в день 0 и также спустя 8 недель. Во время второй вакцинации использовали неполный стимулятор Фрейндна.
Животные в контрольной группа IV) были вакцинированы только белком-носителем (KLH) и стимулятором.
На день 0, через 4, 8 и 12 недель измеряли размеры яичек. На 17-18 неделе животных забивали. На 12 неделе после вакцинации измеряли содержание тестерона в сыворотке поросят. На 131 день после первой вакцинации определяли вес яичек и эпидидимиса и вес семенных пузырьков и луковицы мочеиспускательного канала свиней.
Результаты в 4 группах следующие. После вакцинации гормоном, высвобождающим лютенизирующий гормон (группа 1), внешнее измерение показало, что у трех из пяти животных яички были меньше, чем у животных контрольной группы.
Из трех животных, имевших более мелкие яички, у двух яички уменьшились в размере до такой степени, что не поддавались больше внешнему измерению.
У животных, вакцинированных (Д-трп6)-гормоном, высвобождающим гормон ЛГ, два из пяти животных имели отчетливо меньшие яички, чем у контрольных животных, и у одного животного яички не поддавались больше измерению. (группа II)
Из пяти животных, вакцинированных тандемным гормоном, высвобождающим лютенизирующий гормон (группа 111), у всех яички были мельче, чем у контрольных животных, и у четырех животных яички не поддавались измерению.
Средние уровни тестостерона в сыворотке были соответственно:
2,47 (1,21) пикомоля/мл (контрольная группа, 5 свиней)
1,89 (2,24) пикомоля/мл (группа 1, 5 животных)
2,27 (2,23) пикомоля/мл (группа 11, 5 животных)
0,51 (0,08) пикомоля/мл (группа 111, 5 животных)
Средний вес яичек и эпидидимиса был соответственно:
285 (50) г/ 55 (11) г (контрольная группа, 5 животных)
110 (123) г/21 (17) г (группа 1, 5 животных)
221 (88) г/42 (12) г (группа 11, 5 животных)
25 (11) г/11 (2) г (группа 111, 4 животных).
Средний вес семенных пузырьков и луковицы мочеиспускательного канала был соответственно:
125(44) г/119 (24) г (контрольная группа, 5 животных)
40(80) г/37 (48)г (группа 1, 5 животных)
137 (71) г/135 (52) г (группа 11, 4 животного)
5 (3) г/15 (5)г (группа 111, 4 животного)
В скобках даны значения стандартных отклонений.
Поскольку замедленное развитие или даже регрессия яичек может быть непосредственно соотнесена к снижению способности свиньи продуцировать андрогены и, следовательно, с появлением нежелательного "запаха хряка", то ожидаемая полная защита реализована в группе 111, вакцинированной тандемной вакциной гормона, высвобождающего лютенизирующий гормон согласно изобретению, тогда как только частичная защита наблюдалась в группах 1 и 11, взятых для целей сравнения.
Пример 3.
При исключении обработки пептида основанием для удаления защиты боковой формильной цепи триптофана, 8 поросят-самцов в возврате 10 и 18 недель были вакцинированы (буквенный код) LEHFSYGLRP-GQHWSYCLRPGC, связанным с KLH в присутствии CFA/JFA в качестве ад'юванта, 8 из 8 обработанных животных имели уменьшение тестикулы.
Пример 4.
При замене носителя-белка получены следующие результаты:
Используя пептид pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg- Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys, связанный с БСА в CFA/JFA, 9 из 10 обработанных поросят показали значительное уменьшение тестикулярного роста.
Используя такой же пептид, но связанный с носителем-белком овальбумином и с синтетическим маслом Спекол (SpeCol) в качестве ад'юванта, 8 из 9 обработанных поросят показали значительное уменьшение тестикулярного роста.
Пример 5.
При замене ад'юванта получены следующие результаты:
Используя: уже упомянутый пептид pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro - Gly-Cln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys, связанный с протеиновым носителем овальбумином и с синтетическим маслом Спекол в качестве адъюванта, 8 из 9 обработанных поросят показали значительное уменьшение в тестикулярном росте.
Используя тот же самый пептид, связанный с KLH, но с синтетическим маслом Синтекс (Syntex) в качестве адъюванта, 6 из 7 обработанных поросят показали значительно уменьшенный тестикулярный рост.
Используя такой же пептид, связанный с KLH, но в присутствии синтетического масла CDJ-масла в качестве аюъюванта, 6 из 8 обработанных свиней имели значительно уменьшенный тестикулярный рост.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
УЛУЧШЕННЫЙ ПЕПТИД, ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ВАКЦИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ ГОРМОНА ЛГВГ | 1996 |
|
RU2147307C1 |
ПЕПТИДЫ GnRH-I И ПЕПТИДЫ GnRH-II | 2001 |
|
RU2348648C2 |
АНАЛОГИ ПЕПТИДА ЛГ-РФ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ | 1998 |
|
RU2212247C2 |
СПОСОБ СИНТЕЗА ПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ОСТАТОК ТРИПТОФАНА | 2001 |
|
RU2276156C2 |
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ ОТ FMDV И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2745373C2 |
СРЕДСТВО ДЛЯ ПРЕРЫВАНИЯ ПОЛОВОЙ ОХОТЫ У САМОК КОШЕК "АНТИМЯУ" | 1992 |
|
RU2015698C1 |
ДЕКАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 1993 |
|
RU2084458C1 |
ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ LHRH И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ У СВИНЕЙ | 2014 |
|
RU2745720C2 |
НОВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ HAEMOPHILUS PARASUIS | 2020 |
|
RU2822516C1 |
СЛИТЫЕ БЕЛКИ FMDV-E2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2714428C2 |
Использование: в ветеринарии для улучшения качества свиного мяса. Сущность изобретения: пептиды 1 P-Glu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly - Leu-Ary-Pro-[-Glu-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro - In-Gly-Cys-NH2 Trp1 = триптофин, Trp2 = триптофан или N-формилтриптофан, n = 1 - 5. Композиция, вызывающая иммунный отклик на LHRH у животных, включающая активный ингредиент и носитель, причем в качестве активного ингредиента используют пептид 1, а в качестве носителя - иммунногенный конъюгат белка и дополнительно иммуноадъювант в мас. соотношении 1 : 1 : 1. 3 с.п. ф-лы.
p-Glu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-[Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-CysNH2,
где Trp1 триптофан;
Trp2 триптофан или N-формилтриптофан;
n 1 5.
pGlu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-[Gly-Gln-His-Trp2- Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Cys-NH2,
где Trp1 триптофан,
Trp2 триптофан или N-формилтриптофан,
n 1 5,
а в качестве носителя иммунногенный конъюгат белка и дополнительно иммуноадъювант в массовом соотношении 1:1:1.
Brooks et | |||
al | |||
J | |||
Anim | |||
Sci., 1986, 62, 1279 | |||
Chaffaux et | |||
al | |||
Recuil de Medicine Veterinare, 1985, 161, 133 - 145 | |||
Патент США N 4608251, кл | |||
Устройство для сортировки каменного угля | 1921 |
|
SU61A1 |
Авторы
Даты
1997-05-10—Публикация
1990-03-22—Подача