ШТАММ "КПР-96" ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И/ИЛИ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики и/или специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).

РРСС-контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросности, рождением мертвого и слабого приплода, погибающего в первые 2-3 дня жизни, и поражением органов дыхания у поросят. Гибель поросят может достигать 80-90%.

Впервые болезнь была зарегистрирована и описана в 1987 году в США и Канаде. Первая вспышка заболевания со сходными признаками была отмечена в Германии в 1990 году, затем эту инфекцию регистрировали на территории большинства стран Европы.

В России заболевание впервые отмечено в 1991 году в хозяйствах Курской области. Болезнь быстро распространялась и на сегодняшний день РРСС диагностирован во многих областях и краях России.

В настоящее время РРСС широко распространен во многих странах мира с развитым свиноводством и чаще протекает в энзоотической (хронической) форме (1-8).

Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus, семейства Arteriviridae порядка Nidovirales.

Впервые вирус РРСС изолировали голландские ученые Центрального ветеринарного института в 1991 году в культуре клеток альвеолярных макрофагов поросят (9).

Выделенные в различных странах Европы, Северной Америки и Азии штаммы вируса РРСС отличаются вирулентностью, антигенной активностью и последовательностью нуклеотидов в геномной РНК.

Известны, по крайней мере, два генотипа вируса РРСС - европейский и американский. Гомология между ними на нуклеотидном уровне составляет только 55-70%, а внутри генотипов 97-99%.

Различия касаются не только вариаций в нуклеотидной и аминокислотной структуре, но и размеров вирусных белков. Так размер нуклеокапсидного белка американских штаммов вируса РРСС составляет 123 аминокислоты, а размер нуклеокапсидного белка европейских штаммов составляет 128 аминокислот (10-12).

При проведении молекулярной характеризации отечественных изолятов вируса РРСС установлено, что они принадлежат к европейской группе, однако на уровне аминокислотной последовательности обнаруживают отличия, достигающие 16%, а размер нуклеокапсидного белка отличается от аналогичного показателя как американских (123 аминокислоты), так и европейских штаммов (128 аминокислот) и составляет 125 аминокислот (13).

Данные структурные особенности отечественных изолятов вируса РРСС, касающиеся нуклеокапсида как одного из наиболее консервативных вирусных белков, свидетельствуют об их антигенных отличиях по сравнению с соответствующими характеристиками западно-европейских и американских изолятов вируса.

При сравнении выделенных на территории России изолятов вируса РРСС обнаруживается чрезвычайно высокая их генетическая и антигенная вариабельность.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса РРСС, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Специфическая профилактика РРСС проводится с помощью живых и инактивированных вакцин. Известен ряд зарубежных штаммов вируса РРСС, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм CNCM №1 - 1102 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Известен штамм CNCM №1 - 1140 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (15).

Известен штамм CNCM №1 - 1153 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (16).

Известен штамм Р120-117В вируса РРСС, полученный в гомо- или гетерологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (17).

Известны штаммы CNCM №1 - 1387 или CNCM №1 - 1388 вируса РРСС, выращенные на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (18).

Известен штамм CNCM №1 - 1642 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (19).

Известен штамм ATCC №VR - 2332 вируса РРСС, выращенный в культуре клеток почки зеленой мартышки и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (20).

Известен штамм ATCC №VR - 2402 вируса РРСС, выращенный в культуре клеток почки зеленой мартышки и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (21).

Известен штамм АТСС №VR - 2509 вируса РРСС, выращенный и культуре клеток CRL-12219 и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (22).

Известен штамм ATCC №VR - 2525 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (23).

Известны штаммы NADC-8, NADC-9 и NVSL-14 вируса РРСС, выращенные в чувствительной биологической системе и используемые для изготовления вакцинных препаратов (24).

Известен штамм JK-100 (CCTCC V20005) вируса РРСС, выращенный в перевиваемой культуре клеток Marc-145 и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (25).

Известен штамм ЕСАСС №V-93070108 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (26).

Недостатки известных штаммов состоят в том, что по своим антигенным и иммунобиологическим свойствам они отличаются от выделенных на территории России изолятов эпизоотического вируса РРСС.

Из выделенных в России изолятов эпизоотического вируса РРСС известен штамм «БД» гомологичного вируса для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (27).

Недостатки данного штамма состоят в его антигенных и иммунобиологических отличиях.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм CNCM №1-1102 вируса РРСС, выращенный на чувствительных гетеро- или гомологичных культурах клеток и используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (14).

Недостатки штамма-прототипа состоят в его антигенных и иммунобиологических отличиях от выделенных на территории России изолятов эпизоотического вируса РРСС.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм вируса РРСС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса РРСС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Указанный технический результат достигнут получением штамма «КПР-96» (авторское наименование) вируса РРСС для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Штамм «КПР-96» является новым, ранее неизвестным, в нативном виде слабовирулентным для свиней.

Исходный вирус для получения штамма «КПР-96» выделен в 1996 году из сыворотки крови абортировавших свиноматок с клиническими признаками РРСС из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области, адаптирован серийными пассажами к перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки Marc-145 и предложен в качестве производственного для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Штамм «КПР-96» депонирован 28 октября 2004 года во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Штамм «КПР-96» является слабовирулентным для свиней и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлены результаты сравнения последовательностей аминокислот белка GP5 штамма «КПР-96» и штамма Leiystad вируса РРСС, а также в перечне последовательностей, в котором: SEQ ID N0:1 представляет последовательность нуклеотидов гена ОРС5 штамма «КПР-96» вируса РРСС;

SEQ ID N0:2 - последовательность аминокислот белка GP5 штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Штамм «КПР-96» вируса РРСС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм «КПР-96» вируса РРСС относится к семейству Arteriviridue, роду Arterivirus, RNA-геномный, обладает морфологическими признаками, характерными для вируса РРСС; форма вариона шарообразная. Размер вириона 45-75 нм с ядром, занимающим 3/4 вариона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой.

Антигенные свойства

Вирус РРСС штамма «КПР-96» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации антиген in штамма «КПР-96» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА).

Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-9А» вируса РРСС проводили путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

До иммунизации в сыворотках крови животных антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех пробах выявляли в ИФА специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05.

Биотехнологические характеристики

Штамм «КПР-96» проявляет высокую биологическую активность. Биологическую активность штамма определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145.

Вирус 6 и 17 пассажей, полученный в культуре клеток Marc-145, использовали для титрования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита. Результаты титрования на культуре клеток Marc-145, показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа в среднем составила 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл.

Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Хемо- и генотаксопомическая характеристика

Геном вируса РРСС штамма «КПР-96» состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочеченой РНК размером около 15 тысяч нуклеотидов. 5'-конец РНК кэпирован, а 3'-конец полиаденилирован. Ген капсидного белка расположен на 3'-концевой части генома. Геном штамма «КПР-96», как и все другие штаммы и изоляты вируса РРСС, содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены ренликаз (ОРС 1а и 1b), оболочечные белки (ОРС 2-6) и нуклеокапсидный белок (ОРС 7). Были определены шесть структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов: негликозилированный нуклеокапсидный белок N (мол. масса 15 kDa), кодируемый ОРС 7, негликолизированный трансмембранный белок М (мол.масса 18 kDa), кодируемый ОРС6, и четыре N-гликозилированных белка с мол.массой 25; 31-35; 45-50 и 29-30 kDa, кодируемые ОРС 5, ОРС 4, ОРС 3 и ОРС 2 соответственно. Сферические вирионы имеют диаметр 45-75 нм, включают ядро диаметром 25-35 нм. В состав оболочки вириона входят липиды и углеводы как часть гликопротеинов.

Идентификацию и специфичность вируса РРСС определяли методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования.

В результате проведенных исследований обнаружен только геном вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование гена ОРС 5 подтвердило, что штамм «КПР-96» относится к европейскому генотипу вируса РРСС. Сравнение выведенных из нуклеотидных последовательностей ОРС 5 аминокислотных последовательностей белка GP5 оказало, что штамм «КПР-96» отличается от штамма Lelystad по двум аминокислотным остаткам (а.о.). Двадцатый а.о. у «КПР-96» представлен фенилаланином, а у штамма Lelystad - лейцином, в 37 позиции белка GP5 у «КПР-96» и Lelystad находятся аспарагин и аспарагиновая кислота соответственно.

Физические свойства

Масса вириона от 49×10³ Да до 55×10³ Да. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «КПР-96» неустойчив к эфиру, хлороформу и детергентам, чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - через 14 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.

Реактогенность отсутствует.

Является слабовирулентным для свиней.

Онкогенность отсутствует.

Является контагиозным при контакте (совместном содержании инфицированных и здоровых свиней).

Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм «КПР-96» вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным и в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают его объем.

Пример 1

В 1996 году при вирусологическом исследовании сывороток крови свиней с клиническими признаками РРСС, полученных из СХП «Победа» Ленинск-Кузнецкого района Кемеровской области, на перевиваемой культуре клеток Marc-145 был выделен первым изолят вируса РРСС. Для выделения вируса РРСС из полевого материала были использованы пластиковые культуральные матрасы с монослоем перевиваемой культуры клеток Marc-145. Небольшим объемом (1 см³) полевой сыворотки крови от свиней с клиническими признаками РРСС заразили культуру клеток Marc-145 и ее поместили в СО₂- инкубатор на один час при 37°С. После этого к инфицированным клеткам добавили среду Игла с 10% содержанием фетальной сыворотки КРС и антибиотиками. Полное цитопатическое действие (ЦПД) проявилось через 6 пассажей на культуре клеток Marc-145. Идентификацию и специфичность вируса определяли в ПЦР с контролем специфичности. Вирус может быть выделен также из легких, лимфоузлов, селезенки и других внутренних органов инфицированных поросят.

Выделенный вирус использовали для массового заражения 3-суточной культуры клеток Marc-145. Перед внесением вируса клеточный монослой однократно промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР). Культуру заражали вирусом в дозе 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Адсорбцию вируса проводили при 37°С в течение 1 часа. Через каждые 10 минут клетки с вирусом встряхивали. После этого в материал вносили среду Игла в объеме 150-200 см³ с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС, 50 мкл/мл гентамицина и 0,3 мг/мл глютамина.

Культивирование проводили при 36-37°С в течение 96-144 часов. В качестве контроля оставляли незараженными 3 матраса, в которых меняли среду.

Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяли по характерному ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдали ЦПД с поражением 60% клеточного монослоя (обычно через 48 часои), отбирали и замораживали при -20°С. Вирус получали двукратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим удалением клеточных остатков путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 20 мин. В течение 120 часов инкубирования вирус 6 пассажа накапливался до титра 5,17 lg ТЦД₅₀/мл. Полученный штамм вируса РРСС (авторское наименование «КПР-96») депонирован во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) 28 октября 2004 года под регистрационным номером (ссылкой) «КПР-96»-ДЕП.

Пример 2

Проведена проверка биологических свойств вакцинного штамма «КПР-96» (6 пассаж) по следующим показателям:

- отсутствие бактериальной и грибковой контаминации;

- специфичность и отсутствие вирусной контаминации (метод ПЦР);

- антигенная активность и специфичность (метод ИФА);

- биологическая активность (титрование на культуре клеток Marc-145);

- вирулентность для свиней.

1. Определение отсутствия бактериальной и грибковой контаминации штамма «КПР-96».

Для этого использовали среды Сабуро, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и среду Китта-Тароцци. Все используемые бактериальные среды были проверены на ростовые свойства согласно ГОСТу 28085-89. Для испытания из 3 флаконов (отдельно из каждого) с культуральным вирусом вносили по 1 см³ вируссодержащего материала в 4 пробирки с тиогликолевой средой. Пробирки инкубировали при разных температурных режимах.

По две пробирки с содержимым из каждого флакона выдерживали в термостате при температуре 37±0,5°С, одну - при 30±0,5°С, одну - при 22±0,5°С. Через 7 суток из 3 пробирок, инкубируемых при 37±0,5°С, делали пересев на следующие баксреды: агар и жидкую среду Сабуро, МПБ и МПА, сахарный бульон и среду Китта-Тароцци. В среду Китта-Тароцци вносили по 1 см³, а в остальные среды - по 0,5 см³ исследуемого материала и выдерживали в течение 7 суток при температуре 37±0,5°С, со средой Сабуро - при температуре 22±0,5°C.

Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю в течение 14 суток.

Результаты проверки представлены в таблице 1. Испытания показали, что штамм «КПР-96» вируса РРСС (6 пассаж) не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой.

На всех средах с высевами и пересевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не наблюдалось.

2. Проверка штамма «КПР-96» вируса РРСС на специфичность и отсутствие вирусной контаминации методом ПЦР.

Определение специфичности и отсутствие вирусной контаминации проводили путем исследования пробы культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» методом ПЦР на наличие геномов вирусов РРСС, КЧС, болезни Ауески, ПВИС, корона-вирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (M.hyopneumoniae, M.hyorhinis, M.hyosynoviae).

Вес исследования методом ПЦР проводили согласно «Методическим указаниям по индикации генома вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.1997 г.

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном вируса РРСС. Геномы вирусов КЧС, болезни Ауески, ПВИС, корона-вирусов, цирковирусов и возбудителей микоплазмозов свиней (M.hyopneumonuie, M.hyorhinis. M.hyosynoviae) не обнаружены.

Сравнение полных нуклеотидных последовательностей гена нуклеокансидного белка (ОРС 7) штамма «КПР-96» и других известных штаммов вируса РРСС показало высокую степень его гомологии со штаммом Lelystad вируса РРСС.

Уровень нуклеотидной гомологии по ОРС 7 между штаммами «КПР-96» и «БД» составляет только 60%.

Существенные отличия между штаммами «КПР-96» и «БД» были подтверждены также в ИФА (набор Ingenasa, Испания) перекрестными исследованиями против американского и европейского типов вируса РРСС. Результаты исследований представлены в таблице 2. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что штамм «КПР-96» принадлежит к европейской геногруппе вируса РРСС.

3. Определение специфичности и отсутствия контаминации штамма «КПР-96» вируса РРСС на подсвинках.

Для проведения испытания использовали 3 подсвинков массой 25-30 кг. Вес животные были серонегативными по отношению к вирусам РРСС, ПВИС, болезни Ауески, КЧС, трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), гриппа и М.hyopneumoniae.

Всем животным вводили внутримышечно по 5 мл культуральной суспензии вируса РРСС штамма «КПР-96» с титром 10⁵'⁰ ТЦД₅₀/мл. До и через 28 суток после заражения от животных отбирали пробы крови и сыворотки исследовали на наличие антител прогни следующих возбудителей:

- вируса РРСС в ИФА с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- вируса ПВИС в РТГА с использованием «Набора препаратов для серодиагностики ПВИС в РТГА» производства ФГУ ВНИИЗЖ, значение ≥1:256 - наличие специфических антител;

- вируса Ауески с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<50 - специфические антитела отсутствуют, s/p>100 - наличие специфических антител;

- вируса КЧС с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p-40 - специфические антитела отсутствуют, s/p>50 - наличие специфических антител;

- вируса ТГЭС в реакции микронейтрализации, значение ≥3,0 log₂ - наличие специфических антител;

- M.hyopneumoniae с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<20 - специфические антитела отсутствуют; s/p>30 - наличие специфических антител;

- вируса гриппа свиней с использованием набора фирмы IDEXX (США), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, s/p≥0,4 - наличие специфических антител.

Результаты исследований сывороток крови на наличие антител к вышеуказанным возбудителям инфекций представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что в испытанных образцах антитела к вирусам ПВИС, болезни Ауески, КЧС, ТГЭС, гриппа и M.hyopneumoniae не выявлены. Это свидетельствует об отсутствии контаминации штамма «КПР-96» вышеуказанными возбудителями.

4. Определение антигенной активности и специфичности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА.

Указанные исследования проведены методом ИФА путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 28 суток после их иммунизации эмульсионной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Для этого использовали 4 серонегативных подсвинков массой 25-30 кг. Вирус с титром инфекционности 5,0 lg ТЦД₅₀/мл инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и эмульгировали с масляным адъювантом Montanide ISA-70 в соотношении 1:3. После проверки на стерильность препарат вводили животным внутримышечно в дозе 2 мл на голову.

От всех животных отбирали пробы крови до и через 28 суток после вакцинации. Сыворотки крови исследовали в коммерческом наборе ИФА фирмы IDEXX (США). Результаты изучения антигенной активности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом ИФА представлены в таблице 4.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков антител к вирусу РРСС не выявляли, а через 28 суток после вакцинации во всех 4 пробах выявляли специфические антитела в пределах от 1,79 до 2,05 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведены также исследования по изучению антигенной активности штаммов «БД», Lelystad и «КПР-96» вируса РРСС на свиньях. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 наглядно видно, что штамм «КПР-96» обладает выраженной антигенной активностью.

После его введения в сыворотках крови 2-3-месячных поросят выявляют неспецифические антитела к вирусу РРСС на достаточно высоком уровне как при интраназальном, так и внутримышечном методах введения вируссодержащего материала. Кроме того, уровень антител к вирусу РРСС через 21 сутки после иммунизации штаммом «КПР-96» был выше, чем у поросят, иммунизированных штаммом «БД».

5. Определение биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС. Биологическую активность штамма «КПР-96» определяли путем титрования на культуре клеток Marc-145 по общепринятой методике. Вирус 6 и 17 пассажей, выращенный в культуре клеток Marc-145, использовали для титрования после двукратного замораживания-оттаивания и низкоскоростного центрифугирования для осаждения клеточного детрита.

Для титрования вируса РРСС использовали 2-3-суточный монослой культуры клеток Marc -145, выращенный в пробирках. Вначале готовили 10-кратные разведения (от 10^-1 до 10^-9) вируссодержащего материала на среде Игла без сыворотки (рН 7,0-7,4). Каждое разведение вируса вносили в 4 пробирки с культурой клеток. Предварительно из пробирок сливали ростовую среду, вносили по 0,1 см³ разведенного вируса.

После 1 часа контакта добавляли 0,9 см³ питательной среды. На пробирках указывали номер исследуемого материала (числитель) и разведения (знаменатель). Пробирки оставляли в штативах в наклонном положении и помещали в термостат для инкубирования при температуре +37°С.

Одновременно ставили контроль с незараженной культурой клеток. Ежедневно в течение 6 суток проводили учет результатов титрования путем просмотра каждой пробирки под малым увеличением микроскопа. После просмотра отмечали ППД вируса (условно в крестах), окончательный учет результатов проводили через 144 часа после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя и контроле.

Расчет титра проводили по методу Кербера. Каждый пассаж испытуемого вируса титровали в 3-х повторностях. Результаты определения биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРСС представлены в таблице 6. Результаты титрования на культуре клеток Marc-145 показали, что биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС 6 пассажа составляет в среднем 5,17 lg ТЦД₅₀/мл, а 17 пассажа - 5,09 lg ТЦД₅₀/мл. Разница в титрах вируса 6 и 17 пассажей несущественна, т.е. в результате 11 пассажей биологическая активность штамма «КПР-96» вируса РРСС оставалась неизменной.

Проведены также исследования культуральных свойств штаммов «БД», Lelystad, NVSL, №2156 и «КПР-96». Результаты этих исследований представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что ЦПД у штамма «КПР-96» в культуре клеток Marc-145 появляется с 3 суток после заражения и достигает максимального проявления на 5 сутки, при этом титр вируса составляет 5,1±0,07 lg ТЦД₅₀/мл.

6. Определение степени вирулентности штамма «КПР-96» вируса РРСС на свиньях.

Степень вирулентности штамма «КПР-96» для свиней изучали на поросятах 2-4-месячного возраста с живой массой 25-30 кг. Результаты этих опытов представлены в таблице 8.

Из таблицы 8 видно, что проверка штамма «КПР-96» на поросятах 2-4-месячного возраста на уровне 17 пассажа показала, что он является слабовирулентным, так как у некоторых зараженных подсвинков наблюдали только незначительное повышение температуры тела (до 40,7°С) в течение 1-4 суток.

Полученный штамм «КПР-96» был испытан также на супоросных свиноматках. Двух серонегативных супоросных свинок интраназально заразили за 4 недели до опороса. Обе свиноматки на 114 день после осеменения опоросились. От них получено 23 поросенка. Характеристика приплода свиноматок представлена в таблице 9.

Согласно приведенным в таблице 9 данным свиноматки принесли 18 живых здоровых поросят (78,3%) и у одной свиноматки родилось 2 нежизнеспособных поросенка (8,7%) и 3 с патологией глаз (13%). Два нежизнеспособных поросенка погибли в первые сутки после рождения. За время подсосного периода у оставшихся поросят, в том числе и у родившихся с патологией глаз, каких-либо клинических признаков не наблюдали.

В сыворотках крови у поросят до приема молозива антител к вирусу РРСС не было выявлено. Исследование проб плацент свиноматок и внутренних органов двух вынужденно убитых поросят до приема ими молозива на наличие генома вируса РРСС дало отрицательный результат. В то же время в сыворотках крови свиноматок, отобранных в день опороса, выявляли антитела к вирусу РРСС на высоком уровне s/p 1,76 и 2,24 (в ИФА, IDEXX).

Проведено сравнительное изучение вирулентных свойств штаммов Lelystad, «БД» и «КПР-96» вируса РРСС ни свиньях. Результаты исследований представлены в таблице 10.

Из таблицы 10 видно, клиническое проявление РРСС у поросят, зараженных штаммами «КПР-96», «БД» и Lelystad, значительно отличается, что говорит о различной вирулентности этих штаммов. После заражения животных штаммами «КПР-96» и «БД» видно, что клинические признаки болезни отсутствуют, за исключением гипертермии, что характерно для слабовирулентных и авирулентных штаммов вируса РРСС.

Таким образом, результаты испытаний показали, что штамм «КПР-96» вируса РРСС является слабовирулентным.

Пример 3

Вакцину против РРСС инактивированную эмульсионную готовят из матрового вируса штамма «КПР-96», выращенного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 3-суточного возраста с концентрацией более 100 000 кл/мл. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145 не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.

Вирус выращивают в матрасах емкостью 1,5 дм³ с культурой клеток.

После смыва ростовой среды и однократного отмывания ФБР или средой в матрасы вносят по 5 мл вируссодержащего материала матровой серии. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение часа. После того в матрасы вносят среду Игла в объеме 150-200 мл с добавлением 5% фетальной сыворотки с антибиотиком (гентамицин в концентрации 50 мкг/мл или его аналоги). Культивирование ведут при 37°С в течение 72-120 часов.

Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых заменяют среду. Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяют по характерному ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 72-120 часов), отбирают и замораживают при -20°С.

Вирус для изготовления вакцины получают 2-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированием клеток с последующим сливом содержимого матрасов в одну емкость, соблюдая стерильные условия. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Полученный вирус контролируют на инфекционную активность.

Производственная серия вируса РРСС штамма «КПР-96» считается пригодной для изготовления вакцинных препаратов, если она соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145 не меньше 4,5 lg ТЦД₅₀/мл, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию вируса РРСС ведут с помощью 1-2% водного раствора АЭЭИ, который вносят в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,05-0,08 мас.%. Для этого в суспензию, нагретую до (26-28)°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают значение рН 7,2-7,4 добавлением в суспензию 5% раствора янтарной кислоты. Инактивацию вируса ведут в термостате при (374-2)°С в течение 24 час с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до (4-6)°С, устанавливают значение ее рН в пределах 7,2-7,4 и отбирают пробы антигена для проверки на стерильность и авирулентности, используя для этого известные специалисту методы.

Эмульсионную вакцину готовят путем диспергирования смеси антигенного материала и масляного адъюванта, содержащего минеральное масло с эмульгатором. В качестве масляного адъюванта используют препарат фирмы «Seppic» (Франция) под торговой маркой «Montanide ISA-70».

Соотношение антигенного материала из штамма «КПР-96» вируса РРСС и масляного адъюванта Montanide ISA-70 составляет 33% и 67% соответственно. Каждая прививная доза вакцины объемом 2 мл должна содержать 0,7 мл антигена вируса РРСС с титром не меньше 4,5 lg ТЦД₅₀/мл (до инактивации) и 1,3 мл масляного адъюванта Montanide ISA-70.

Полученную вакцину фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями на стерильность, безвредность и антигенную активность.

Вакцину проверяли на стерильность посевом на следующие питательные среды: МПБ, МПА, МППБ, среду Сабуро и тиогликолевую среду. Во всех случаях роста микрофлоры отмечено не было.

Безвредность вакцины проверяли на шести белых мышах и двух подсвинках, которым подкожно и внутримышечно вводили по 0,5 мл и 5,0 мл вакцины соответственно. За животными вели наблюдение в течение 10 и 15 суток соответственно, затем их усыпили и провели патолого-анатомическое вскрытие. За период наблюдения (10 дней у мышей и 15 дней у подсвинков) все животные оставались здоровыми. На месте введения вакцины наблюдали незначительную припухлость и на вскрытии при осмотре места введения отмечали единичные, мелкие инкапсулированные очажки диаметром 1-3 мм у мышей и 5-7 мм у подсвинков, при разрезе которых выделялось вакцинное содержимое.

Определение антигенной активности вакцины проводили на шести серонегативных по отношению к РРСС поросятах 2,5-3-месячного возраста живой массой 25-30 кг. Вакцину вводили в дозе 2 мл внутримышечно в среднюю треть шеи (за ухом) двукратно с интервалом 28 суток. За животными вели клиническое наблюдение в течение 45 суток и периодически отбирали пробы крови. Сыворотки крови исследовали в ИФА с использованием коммерческого набора фирмы IDEXX (США) на наличие специфических антител к вирусу РРСС. Результаты исследования сывороток крови поросят до и в различные сроки после вакцинации представлены в таблице 11.

Согласно данным таблицы 11 специфические антитела к вирусу РРСС на уровне s/p≥0,4 (положительные значения) в сыворотках крови обнаружили к 21 дню после вакцинации у 5 животных из 6 иммунизированных.

Через 28 дней после вакцинации средний уровень антител в группе значительно повысился и составил s/p 0,95±0,24, однако одно животное осталось серогенативным. Через неделю после ревакцинации наблюдали существенный прирост антител к вирусу РРСС, в том числе и у ранее серонегативного подсвинка, а показатель s/p у него вырос с 0,2 до 1,13. Через 14 дней после ревакцинации средний уровень антител в группе составил s/p 2,45+0,49. У одного из поросят после ревакцинации произошло снижение уровня антител с 0,5 до 0,35, что возможно связано с особенностями работы иммунной системы у данного животного.

Результаты клинического наблюдения за привитыми подсвинками показали, что после иммунизации у всех животных повышения температуры тела и в месте введения вакцины не регистрировали. Общее состояние животных оставалось в пределах физиологической нормы.

Таким образом, полученная вакцина инактивированная эмульсионная из штамма «КПР-96» является стерильным, безвредным препаратом и обладает достаточной антигенной активностью. Двукратное введение вакцины обеспечивает высокий уровень антител в сыворотке крови у привитых животных.

Пример 4

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96», изготовленной так, как описано в примере 3, проверена на свинокомплексе №1 на 57000 голов. Здесь наблюдали аборты у свиноматок, сопровождающиеся мертворождением, а также прохолосты и высокий уровень смертности у поросят-сосунов.

Репродуктивное поголовье хозяйства стали прививать ассоциированной эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС и ПВИС производства ФГУ ВНИИЗЖ, причем поросят группы доращивания не прививали. Вакцинации репродуктивного поголовья позволила значительно снизить количество абортов, уровень мертворождения, прохолостов, а также повысить количество и сохранность приплода.

Однако после этого стали отмечать проявление респираторного синдрома у поросят 45-50-дневного возраста.

Многократными исследованиями патматериала от больных животных, проведенными в ФГУ ВНИИЗЖ, с помощью ПЦР выделили геном вируса РРСС, а также микоплазм (М.hyopneumoniae, M.hyorhinis), Haemophilis parasitis, Pasteurella multocida, Aclinobacillus pleuropneumoniae и цирковируса типа 2.

Для проведения испытания инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96» были сформированы опытные и контрольные группы, каждая из которых состояла из 3 секторов по 1000 голов, подобранных по типу аналогов.

Поросят опытной группы прививали в 25-дневном возрасте с ревакцинацией через 3-4 недели в дозе 2 мл на голову, контрольные сектора не прививались. Все поросята были получены от свиноматок, привитых ассоциированной инактивированной эмульсионной вакциной против РРСС и ПВИС.

За животными обеих групп вели наблюдение весь период доращивания. После вакцинации в опытной группе в течение 5 суток проводили термометрию у 20 голов, при этом температура тела животных была в пределах нормы (38,4-40,1)°С. На месте введения вакцины прощупывалась небольшая припухлость 1,0 см в диаметре.

Результаты испытания эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96» на поросятах-отъемышах в свинокомплексе №1 представлены в таблице 12.

Данные таблицы 12 свидетельствуют о том, что в опытной группе (вакцинированных секторах) за период доращивания количество заболевших животных было меньше на 8,1%, вынужденно убитых меньше на 21,8%, сдано на санитарный брак на 9,6% меньше по сравнению с контрольной группой. При этом среднесуточные привесы были выше в среднем на 3,5%.

Гибель в обеих группах была практически одинаковой, однако общая сохранность животных за период доращивания в опытной группе была выше на 3%.

Анализ заболеваемости показал, что в опытной группе большую часть заболевших составляли животные с нарушениями функций желудочно-кишечного тракта и травмами, а в контрольной группе - с респираторными нарушениями.

Результаты исследований сывороток крови поросят в ИФА (ВНИИЗЖ), привитых эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС из штамма «КПР-96» в свинокомплексе №1, представлены в таблице 13.

Согласно данным таблицы 13 следует, что до вакцинации процент серопозитивных в отношении РРСС животных составил 52,5%. Это объясняется тем, что в это время (24-28 дней жизни) в сыворотках крови животных выявляли колостральные антитела на довольно высоком уровне. Это объясняется тем, что поросята получены от переболевших и вакцинированных против РРСС и ПВИС свиноматок. Спустя 26 ней после вакцинации количество серопозитивных животных уменьшилось до 35%, что связано с резким уменьшением уровня колостральных и недостаточным образованием поствакцинальных антител. После ревакцинации процент иммунных животных возрос до 94,7%.

Одновременно повысился средний уровень антител с 66,1±4,8 перед вакцинацией до 82,2±8,1 спустя 50 дней после вакцинации.

Пример 5

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96», изготовленной так, как описано в примере 3, проверена на свинокомплекс №2. В этом хозяйстве заболевание проявлялось в основном в респираторной форме на поросятах группы доращивания в 45-55-дневном возрасте. Общий уровень гибели и вынужденного убоя составлял в среднем 40-50%.

Для проведения исследований были сформированы опытные и контрольная группы (сектора) из поросят 25-28-дневного возраста. Животных прививали в возрасте 25-28 дней жизни, с ревакцинацией спустя 3-4-недели. В 35-дневном возрасте эти поросята были переведены в группу доращивания, слабые и отстающие в росте животные - выбракованы. Результаты испытания вакцины из штамма «КПР-96» на поросятах-отъемышах в свинокомплексе №2 представлены в таблице 14.

Из представленных в таблице 14 данных следует, что в опытной группе заболеваемость и смертность были ниже, чем у непривитых животных. Среднесуточный привес был также выше в группе вакцинированных животных (190 г против 167 г в контрольной).

Сохранность за период доращивания была также выше у привитых животных (68,1% против 54,3% в контрольной).

Результаты исследований сывороток крови поросят в ИФА (ВНИИЗЖ), полученные в ходе испытания вакцины из штамма «КПР-96» в свинокомплексе №2, представлены в таблице 15.

Данные таблицы 15 свидетельствуют о том, что до вакцинации процент серонегативных в отношении РРСС животных составил 52,5%.

Это объясняется тем, что в это время (24-28 дней жизни) в сыворотках крови животных выявляли колостральные антитела довольно высокого уровня в связи с тем, что поросята получены от переболевших и вакцинированных против РРСС и ПВИС свиноматок. Спустя 26 дней после вакцинации количество серопозитивных животных уменьшилось до 35%, что связано с резким уменьшением уровня колостральных и недостаточным образованием поствакцинальных антител. После ревакцинации процент иммунных животных возрос до 94,7%. Одновременно повысился средний уровень антител с 56,7±8,0 перед вакцинацией до 102,6+11,8 спустя 50 дней после вакцинации.

Пример 6

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96», изготовленной так, как описано в примере 3, проверена на свинокомплексе №2 при вакцинации репродуктивного поголовья. Свиноматок и ремонтных свинок разделили на две группы по 60 голов в каждой. Животных опытной группы прививали испытуемой вакциной согласно временному наставлению по ее применению: первый раз двукратно с интервалом 20-30 дней за три недели до случки (осеменения), затем животных иммунизировали повторно на 60-70 день супоросности. В контрольной группе свиноматок против РРСС не прививали.

После иммунизации испытуемой вакциной у привитых животных общая температура тела и температура в месте введения препарата оставались в пределах физиологической нормы, каких-либо клинических признаков заболевания и отклонений не отмечали.

Результаты испытания «КПР-96» на свиноматках в свинокомплексе №2 представлены в таблице 16.

Из представленных в таблице 16 данных следует, что в опытной группе выход поросят на 1 свиноматку выше, чем в контрольной (10,4 поросенка против 8,4). У привитых свиноматок средний вес новорожденного поросенка был также выше по сравнению с контрольной группой (1,24 против 1,21 кг).

При последующем осеменении (в первую охоту после перевода поросят на доращивание) среди ранее привитых эмульсионной инактивированной вакциной из штамма «КПР-96» свиноматок уровень прохолостов был ниже, чем в контрольной группе (6,6% против 12% у контрольных животных).

Пример 7

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96», изготовленной так, как описано в примере 3, проверена на свинокомплексе №3 при вакцинации репродуктивного поголовья. Свиноматок и ремонтных свинок разделили на две группы по 60 голов в каждой. Животных опытной группы прививали испытуемой вакциной согласно временному наставлению по ее применению: первый раз двукратно с интервалом 20-30 дней за три недели до случки (осеменения), затем животных иммунизировали повторно на 60-70 день супоросности. В контрольной группе свиноматок против РРСС не прививали.

После иммунизации испытуемой вакциной у привитых животных общая температура тела и температура в месте введения препарата оставались в пределах физиологической нормы, каких-либо клинических признаков заболевания и отклонений не отмечали.

В результате вакцинации продуктивность свиноматок в опытной группе стала выше, чем в контрольной (11 поросят на 1 свиноматку в опытной группе против 10 поросят в контрольной).

В опытной группе за период подсоса пало 31, а в контрольной 35 поросят, т.е. разница между группами составила 17,8%. Сохранность поросят-сосунов в опытной группе составила 96%, а в контрольной 94,1%.

Пример 8

Для приготовления диагностической сыворотки 6 серонегативным подсвинкам в возрасте 4-6 недель интраназально инокулируют инактивированную эмульсионную вакцину из штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Через 14 дней им вводят внутримышечно эту же вакцину. Спустя 14 дней от животных получают гипериммунную сыворотку и определяют ее активность в ИФА.

Пример 9

Для приготовления антигена для диагностических целей вирус РРСС штамма «КПР-96» инокулируют в клеточную культуру Marc-145.

После появления ЦПД супернатант собирают и концентрируют в 1000 раз ультрацентрифугированием, добавляют тритон-100 до 0,2% концентрации, вновь центрифугируют в течение 10 минут при 15000 g. Супернатант используют как антиген для диагностических целей. С контролем поступают аналогично (культура клеток).

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм «КПР-96» вируса РРСС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм «КПР-96» вируса РРСС, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой специфической, иммуногенной и антигенной активностью, безвредностью и ареактогенностью и расширяет арсенал средств, пригодных для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов против РРСС.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Collins J.E. et al. Isolation of swine in infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J.Vet.Diagn.Invest., 1992, 4, 117-126.

2. Baron T. et al. Report on the first autbreaks of the porcine reproductive syndrome (PRRS) in France. Diagnosis and viral isolation. Ann.Rech.Vet., 1992, 23(3), 335.

3. Botner A. et al. Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a Danish swine herd and experimental infection of pregnant gilts with the virus. Vet.Microbiol. (Netherlands), 1994, 40 (3-4), 351-360.

4. Brouwer J. et al. PRRS: effect on herd performance after initial infection and risk analysis. Vet.O (Netherlands), 1994, 16(2), 95-100.

5. Suarez P. et al. Direct detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reverse polymerase chain reaction (RT-PCR). Arc.Virol. (Austria), 1994, 135 (1-2), 89-99.

6. Done S.H. et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome: clinical disease pathology and immunosuppression. Vet.Rec. (England), 1995, 135 (1-2), 89-99.

7. Семенихин А.А. и др. Новая патология свиней с репродуктивным и респираторным синдромом (эпизоотический поздний аборт свиней). Вопр. вет. вирусол., микробиол. и эпизоотологии. Покров, 1992, ч.2, 243-244.

8. Мищенко В.А. и др. Репродуктивно-респираторный сидром в России //Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных; Тез.докл.конф... - Владимир. 1997. - С. 101-102.

9. Wensvoort G. et al. Mystery Swine Disease in the Netherlands: The isolation of Lelystad virus. Vet. Quarterly, 1991, 13, 3, 121-130.

10. Wensvoort G. et al. Antigenic comparison of Leiystad virus and swine infertility and respiratory syndrome virus. J.Vet.diagn.invest., 1992, V.4, P. 134-138.

11. Nelson E.A. ct al. Differentiation of US and European Isolates of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus by Monoclonal Antibodies J.Clin.Microbiol., 1993, V.31. N12, 1-6.

12. Dea S. et al. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates //Arch.Virol. - 2000. - V. 145. - N4. - P.659-688.

13. Andreev V.G. et al. Genetic variations among PRRSV strains isolated in Italy and in Russia. Vet.Res., 2000, V.31, P.89-90.

14. РСТ №92/21375; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, C 12 N 7/00; 10.12.92 г. (прототип),

15. РСТ №93/07898; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, С 12 N 7/00; 29.04.93 г.

16. Пат. Франции №2682966; С 12 N 7/02, 04; 30.04.93 г.

17. Пат. Франции №2709966, А 61 К 39/12, 24.03.95 г.

18. ЕР №0676467; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12, С 12 Р 21/08, С 07 К 16/10; 11.10.95 г.

19. ЕР №835929; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12, С 12 N 7/06, G 01 N 33/569; 15.04.98 г.

20. Пат. США №5476778, С 12 N 7/00, 19.12.95 г.

21. Пат. США №5587164; А 61 К 39/00, 39/12, 39/38, 39/193; 24.12.96 г.

22. Пат. США №5690940; С 12 N 15/38, 7/01; 25.11.97 г.

23. Пат, США №5866401; С 12 N 7/08, 7/01, 7/00, 7/02; 02.02.99 г.

24. Пат. США №5976537, 424-184. 1.02.11.99 г.

25. Пат. США №6410031, 424-218. 1, 25.06.02 г.

26. Пат. Великобритании №2282811; С 12 N 15/40, А 61 К 39/12, С 07 К 14/18, С 12 N 7/02, 7/04; 19.04.95 г.

27. Пат. РФ №2220202; С12 N 7/00, А 61 К 39/12; 25.04.02 г.

Таблица 1
Результаты проверки вирусного препарата из штамма «КПР-96» на отсутствие посторонней микрофлоры№№ флаконаТиогликолевая средаПересевы на средыМПАМПБСах. б.К.-Тар.Аг. СабуроСр. Сабуро37°С37°С30°с22°С37°С37°С37°С37°С22°С22°С1----------2----------3----------

Примечание: (-) - отсутствие роста бактериальной и грибковой микрофлоры на питательных средах.

Таблица 2
Исследование в ИФА сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу РРССХарактеристика сывороток крови№ жив.Уровень антител к вирусу РРСС в ИФА, s/pНабор IDEXX (ко всем типам вируса)Набор Ingenasaк европейскому типу вируса РРССк американскому типу вируса РРССЧерез 21 сутки после иммунизации шт. «КПР-96»10,8 (+)0,60 (+)0,05 (-)21,9 (+)0,94 (+)0,14 (-)31,13 (+)0,78 (+)0,008 (-)Через 28 суток после иммунизации шт. «КПР-96»11,55 (+)0,96 (+)0,32 (-)21,93 (+)1,07 (+)0,63 (+)31,27 (+)1,03 (+)0,36 (+)Через 28 суток после иммунизации шт. «БД»40.9 (+)0,77 (+)0,73 (1)50,87 (+)0,27 (-)0,51 (+)60,77 (+)0,27 (-)0,54 (+)

Примечание: «+» - положительный результат;

«-» - отрицательный результат.

Таблица 3
Результаты исследований сывороток крови свиней на наличие антител к возбудителям РРСС, ПВИС, болезни Ауески, КЧС, ТГЭС, M.hyopneumoniae и гриппаПодсв.ПробыРезультаты исследования сывороток к возбудителямРРССПВИСАуескиКЧСТГЭСM.hyo.грипп1до имм.01:128100≤2,030 28 сут1,51:128120≤2,0402до имм.01:64140≤2,020 28 сут1,21:64180≤2,0503до имм.01:128210≤2,030 28 сут1,81:128190≤2,060Таблица 4
Результаты определения антигенной активности и специфичности штамма «КПР-96» вируса РРСС методом иммуноферментного анализаПоросенокУровень антител в ИФА, s/pдо иммунизациичерез 28 суток101,88202,05301.79401,98

Примечание: значение ИФА IDEXX s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют;

s/p≥0,4 - наличие специфических антител.

Таблица 5
Антигенная активность штаммов «БД», Lelystad и «КПР-96» вируса РРСС на свиньяхШтамм вирусаМетод и доза заражения№жив.Уровень антител в ИФА (IDEXX), s/pдо иммунизациипосле иммунизации, сут1421БДВнутримышечно, 5 мл с титром 10^4,5 ТЦД₅₀/мл10,010,631,520,020,290,S30,051,111,340,080,481,050,070,471,3260,061,21,19Среднее значение, M±S 0,05±0,020,69±0,371,2±0,25LelystadИнтраназально, 10 мл с титром 104,5 ТЦД₅₀/мл70,030,60,9880,050,40,7890,010,460,46Среднее значение, M±S 0,03±0,020,49±0,100,74±0,21КПР-96Интраназально, 10 мл с титром 10^5,0 ТЦД₅₀/мл100,070,441,5110,080,311,2120,090,61,8Среднее значение, M±S 0,08±0,010,45±0,141,5±0,24Внутримышечно, 5 мл с титром 10^5,0 ТЦД₅₀/мл130,01н.и2,6140,03н.и1,9150,04н.и2,2Среднее значение, M±S 0,03±0,01н.и2,2±0,28

Примечание: н.и - не исследовали;

значение ИФА (набор фирмы IDEXX)>0,4 - положительная сыворотка;

<0,4 - отрицательная сыворотка.

Таблица 6
Результаты определения биологической активности штамма «КПР-96» вируса РРССПассаж№ опытаРазведение вирусаТитр вируса lg ТЦД₅₀/мл10^-210^-310^-410^-510^-610^-7по группесреднее значение61++++++++++++++--------5.05,17±0,032+++++++++++++++-----5,253+++++++++++++++-----5,25171++++++++++++++-----5,05,09±0,072++++++++++++++-----5,03+++++++++++++++-----5,25контроль культуры1        2       3       Таблица 7
Культуральные свойств некоторых штаммов вируса РРССШтамм вирусаСроки проявления ЦПД, суткиМаксимальное проявление ЦПД, суткиТитр вируса, lg ТЦД₅₀/млБД237,0±0,5Lelystad454,5±0,25NVSL466,0±0,25№2156463,25±0,25КПР-96355,1±0,07

Таблица 8
Результаты изучения вирулентности штамма «КПР-96» на свиньяхМетод заражения (иммунизация)№жив.Результат иммунизацииУровень специфических антител в ИФА (IDEXX), s/pклинические признакитемпер. реакциядо иммунизациичерез 21-28 днейВнутримышечно 5 мл, титр 10^5,0 ТЦД₅₀1--02,62-+01,93-+02,2Иитраназально 10 мл, титр 10^5,5 ТЦД₅₀4--01,55--01,26-+01,8

Примечание: значение ИФА (набор фирмы IDEXX) >0,4 - положительная сыворотка;

<0,4 - отрицательная сыворотка.

Таблица 9
Характеристика приплода свиноматок, зараженных штаммом «КПР-96» вируса РРСССвиноматкаРодилось поросятвсегоживых здоровыхнежизнеспособныхс патологией глаз№113823№2101000Всего:23 (100%)18 (78,3%)2 (8,7%)3 (13%)

Таблица 10
Сравнительное изучение вирулентных свойств штаммов Lelystad, «БД» и «КПР-96» вируса РРСС на свиньяхШтамм вирусаМетод и доза заражения№№ п/пПовышение температуры телаКлин. признакисуткиМаксимальное значениеЦК.к.КLeiystadинтраназально, 10 мл с титром 10⁴'⁵ ТЦД₅₀/мл1242,0+++22-341,4+++3141,2++-4241,6+++52-341,8-++6140,5-+-«БД»интраназально, 10 мл с титром 10⁶'⁵ ТЦД₅₀/мл7-----8-----9-----10-----11-----внутримышечно, 5 мл с титром 10⁶'⁵ ТЦД₅₀/МЛ12-----13-----14-----15-----16-----«КПР-96»интраназально, 10 мл с титром 10⁵'⁰ ТЦД₅₀/мл17-----18-----19----внутримышечно, 5 мл с титром 10⁵'⁰ ТЦД₅₀/мл20-----21-----222-440,7---

Примечание: Ц - цианоз кожных покровов;

К.к. - конъюнктивит;

К - кашель;

+ регистрировали признак;

- не наблюдали признак.

Таблица 11
Антигенная активность эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96» на подсвинках№ жив.Уровень антител в ИФА через ... дней после иммунизации, s/pдо иммунизации2128*7(35)14 (42)10,011,10,82,022,8520,040,20.21,13н.и30,070,40,50,260,3540,010,81,552,43.3550,011,91.931,943,360,091,130,752,32,4M+s0,04+0,0040,92+0,50,95+0,61,67+0,72,45+1,1

Примечание: * - повторная иммунизация на 28 сутки;

значение ИФА (IDEXX)<0,4 - отрицательная сыворотка;

≥0,4 - положительная сыворотка;

н.и - не исследовали.

Таблица 12
Результаты испытания эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС из штамма «КПР-96» на поросятах-отъемышах в свинокомплексе №1№№ п/пПоказателиОпытные группы (вакцинированы)Контрольные группы (не вакцинированы)Коэффициент изменения величины показателя, %(в опытных группах)1.Количество животных, гол.1003962 2.Возраст, дней24-2824-28 3.Передано на доращивание, гол.1003962 4.Средний вес 1 головы, кг7,3±0,17,3±0,1 5.Валовый привес группы, кг73267024 6.Среднесуточный привес, г216,6±8,4209,3±10,4+3,5%7.Заболело, гол. %250261 24,927,1-8,1%8.Вынужденно убито, гол. %4353 4,35,5-21,8%9.Санитарный брак, гол. %103110 10,311,4-9,6%10.Пало, гол. %1049810,310,2+1,0%11.Передано на откорм, гол.753701 12.Сохранность за период доращивания. %75,172,9+3,0%

Таблица 13
Результаты исследований сывороток крови поросят, привитых эмульсионной вакциной против РРСС из штамма «КПР-96» в свинокомплексе №1Сроки отбора проб сывороток кровиВсего проб сывороток кровиКоличество серопозитивных животных, %Средний уровень антител положительных проб, % ингибицииисследованоположительныхсомнительныхотрицательныхДо вакцинации (возраст 24-28 дн)20181152,566,1±4,8Перед ревакцинацией через 26 дн. после вакцинации (возраст 50-54 дн)20431335,0%47,2±9,7Через 50 дней после ревакцинации (75-104 дн жизни)19180194,782,2±8,1

Примечание: значение ИФА (ВНИИЗЖ)<20% - отрицательная сыворотка;

20-30% - сомнительная сыворотка;

≥ - 30% - положительная сыворотка

Таблица 14
Результаты испытания эмульсионной инактивированной вакцины из штамма «КПР-96» на поросятах-отъемышах в свинокомплексе №2№№ п/пПоказателиОпытная группа (вакцинированы)Контрольная группа (не привиты)1.Поставлено на доращивание, гол.4486112.Заболело, гол., %155
34.6289
47.33.Вынужденно убито, гол. %106
23.7138
22.64.Пало, гол. %37
8.3141
23.15.Переведено в санитарные станки, гол.%122.710
1.66.Среднесуточный привес, г1901677.Передано на откорм, гол., %293
65.4322
52.78.Сохранность за период доращивания, %68,154,3

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Штамм получен путем серийных пассажей на 3-суточной культуре клеток Marc-145. Депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером «КПР-96»-ДЕП. Штамм «КПР-96» репродуцируется в цитоплазме 3-суточной культуры клеток Marc-145 при температуре 37°С. В течение 96 часов инкубирования вирус 6 пассажа накапливается до титра 5,17 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм является слабовирулентным для свиней, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Изобретение может быть использовано для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов. 16 табл.

Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней семейства Arteriviridae, рода Arterivirus, коллекция ФГУ ВГНКИ «КПР-96» - ДЕП, для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов.