Штамм "Борз" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1 рода Arterivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней Российский патент 2023 года по МПК A61K39/12 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся поздними абортами, рождением нежизнеспособных, мумифицированных и уродливых поросят, гибелью поросят в течение первых дней жизни, прохолостами свиноматок и поражением органов дыхания.

Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus, семейства Arteriviridae порядка Nidovirales.

Первые случаи регистрации РРСС были в США и Канаде в 80 годах прошлого века, ее назвали «таинственной болезнью свиней», позднее «синее ухо». В последствии эта болезнь была зафиксирована во многих странах мира. В России впервые клиническое проявление РРСС установлено в 1990 году, а официально заболевание регистрируется с 1993 года [1].

Впервые вирус РРСС изолировали голландские ученые Центрального ветеринарного института в культуре клеток альвеолярных макрофагов поросят в 1991 году [2].

Репродуктивно-респираторный синдром считается одним из самых вариабельных по клиническим проявлениям заболеванием свиней. Респираторная форма инфекции поражает животных всех возрастных групп, клинические проявления варьируют от средней до острой интерстициальной пневмонии. Заболевание может иметь как субклиническую форму, так и приводить к гибели зрелых животных. Высокая изменчивость генома, характерная для вируса РРСС, играет важную роль с точки зрения его патогенных свойств, изменяя их и приводя к появлению большого количества штаммов с различной вирулентностью.

У свиноматок заболевание протекает с патологией репродуктивной функции, у поросят с респираторным синдромом. Классически описываемое течение заболевания у свиноматок характеризуется: поздними абортами (90-109 дней супоросности), преждевременными родами (110-112 дней), прохолостами, мумификацией плодов, мертворождениями. Новорожденные поросята быстро теряют способность сосать и большинство их погибает в первую неделю жизни.

Уровень мертворождаемости и инфицирования поросят в помете зависит, прежде всего, от вирулентности изолята вируса и срока супоросности, на котором свиноматка подверглась заражению. По сообщениям различных авторов, мертворождаемость может составлять от 15 до 100%, процент инфицирования приплода также варьирует в пределах от 4 до 75% и составляет в среднем 45% [3].

У поросят после отъема, заболевание протекает с поражением органов дыхания, показатели заболеваемости и смертности в большой степени зависят от наслоения секундарных инфекций, условий содержания и кормления животных. Ухудшение ситуации на фермах, как правило, наблюдают в холодный период года (ноябрь- апрель). Различают острое и хроническое течение болезни. Острый период болезни длится 3-4 месяца и зависит от размеров стада, условий и технологии содержания свиней. В больших комплексах заболевание обычно становится энзоотичным. На небольших фермах, в период до 200 дней ситуация может постепенно нормализоваться [4].

Выделенные в различных странах Европы, Северной Америки и Азии штаммы вируса РРСС отличаются вирулентностью, антигенной структурой и последовательностью нуклеотидов в геномной РНК. Известны, по крайней мере, два генотипа вируса РРСС - европейский и американский. Гомология между ними на нуклеотидном уровне составляет 55-70%, а внутри генотипов 97-99%. Вирус РРСС в настоящее время является эндемичным почти во всех странах, производящих свинину, и считается одним из наиболее экономически важных заболеваний, поражающих мировую свиноводческую промышленность. Кроме того, в Китае и соседних странах были выделены высоковирулентные генотипы, и такие генотипы обычно связаны с генотипами Северной Америки.

Различия касаются не только вариаций в нуклеотидной и аминокислотной структуре, но и размеров вирусных белков. Так размер нуклеокапсидного белка американских штаммов вируса РРСС составляет 123 аминокислоты, а размер нуклеокапсидного белка европейских штаммов составляет 128 аминокислот. При проведении молекулярной характеризации отечественных изолятов вируса РРСС установлено, что они принадлежат к европейской группе, однако на уровне аминокислотной последовательности обнаруживают отличия, достигающие 16%, а размер нуклеокапсидного белка отличается от аналогичного показателя как американских (123 аминокислоты), так и европейских штаммов (128 аминокислот) и составляет 125 аминокислот. Данные структурные особенности отечественных изолятов вируса РРСС, касающиеся нуклеокапсида как одного из наиболее консервативных вирусных белков, свидетельствуют об их антигенных отличиях по сравнению с соответствующими характеристиками западноевропейских и американских изолятов вируса [5, 6].

При сравнении выделенных на территории России изолятов вируса РРСС обнаруживается достаточная генетическая и антигенная вариабельность. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса РРСС, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. В России в комплексе ветеринарно-санитарных мероприятий в борьбе против РРСС применяют, как инактивированные так и живые вакцины.

В зарубежной практике известен ряд штаммов вируса РРСС, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов:

- европейский генотип штамма Lelystad вируса РРСС [7];

- северо-американский генотип штамма АТСС VR 2332 вируса РРСС [7, 9, 25];

- JK-100 (ССТСС V200005) вируса РРСС [8, 10];

- ЕСАСС 11012501 и ЕСАСС 11012502 вируса РРСС [11,13, 24];

- ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, CNCM 1-1140, CNCM 1-1387, CNCM 1-1388, АТСС VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474, VR 2402; CNCM 1-1102, ЕСАСС V93070108, рТ7Р129А; АТСС VR-2368; АТСС VR-2495 вируса РРСС [10, 12, 13, 24, 26];

- PRRSAZSLER/2014, под учетным номером CNCM 1-4859 [7];

- вирулентный штамм JA-142 и авирулентный штамм Jngelvac®ATP вируса РРСС [14, 15];

Недостатки известных зарубежных штаммов состоят в том, что по своим антигенным и иммунологическим свойствам они отличаются от выделенных на территории России изолятов эпизоотического вируса РРСС.

Известны аттенуированные штаммы NADC-8 (АТСС-2355), NADC-9 (АТСС-2536) и NVSL-14 (АТСС-2537) [16, 17]. Штамм NADC-8 был выделен из единственного поросенка, оставшегося в живых из всего помета, где остальные поросята погибли в результате природной инфекции вирусом РРСС. Штамм NADC-9 был выделен из легких свиньи с очагами уплотнений в легких, возникших, предположительно, в результате природной инфекции РРСС. Штамм NVSL-14 был отобран из группы 20 полевых штаммов вируса РРСС, поскольку этот штамм реплицировался до образования высокого титра инфекционности в чувствительной клеточной линии (MARC-145). Каждый штамм очищали посредством 3 конечных разведений, а затем аттенуировали посредством уникального процесса быстрой серии пересевов (с суточным интервалом) в клетках MARC-145 при разведении инокулята (≤1:50000) при каждом посеве, а затем тестировали на предмет аттенуации после 84-го и после 250-го пересева в клеточной культуре, вводя вирус чувствительным молодым свиньям на поздней стадии беременности.

Международная заявка на патент WO2013017568 относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей геном инфекционного клона вируса РРСС с генотипом I (EU), применимого для исследования РРСС и для разработки вакцин, терапевтических агентов и для проведения диагностики с целью профилактики, лечения и диагностики РРСС. Заявка на патент раскрывает тот факт, что получение инфекционного клона было начато с вирусного штамма (EUX), выделенного из легких поросенка [18].

Известны штаммы американской генетической линии: «БД» [19] и «NVSL» (США) [20, 21], «Р-129» [22, 23] вируса РРСС.

Известны штаммы европейской генетической линии: штамм-прототип «КПР-96» [19], №2156 (Италия) [20], BIS-046 (Испания) [20], PRRSV96V198 [25] вируса РРСС [21].

В материалах зарубежных и отечественных источниках представлено очень много клонов штаммов вируса РРСС. Некоторые штаммы были выделены ранее 90-х годов, находятся в международных коллекциях микроорганизмов. И не доступны для отечественных производителей вакцин.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового аттенуированного производственного штамма вируса РРСС, обладающего широким антигенным спектром действия, высокой биологической и антигенной активностью и обеспечивающего изготовление эффективной вирусвакцины.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса РРСС, который способствует расширению арсенала производственных штаммов вируса РРСС, обладающего высокой инфекционной и антигенной активностью и пригодного для изготовления живой сухой культуральной вакцины, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории РФ эпизоотического вируса РРСС.

Указанный технический результат достигнут получением штамма «Борз» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1 рода Arterivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Штамм получен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» путем пассирования предельных разведений на протяжении 175 пассажей на перевиваемой культуре клеток почки макаки-резус (КК MARC-145) штамма «КПР-96» вируса РРСС.

Полученный штамм «Борз» вируса РРСС депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №460 - деп /23-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена его безопасность для свиней разных половозрастных групп и возможность использования штамма «Борз» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Представлена дендрограмма, отображающая положение штамма «Борз» на филогенетическом древе вируса РРСС европейского генотипа. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей ORF5.

Фиг. 2 - Представлена дендрограмма, отображающая положение штамма «Борз» на филогенетическом древе вируса РРСС европейского генотипа. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей ORF7.

Штамм «Борз» вируса РРСС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Данный штамм относится к семейству Arteriviridae, подсемейству Variarterivirinae, роду Betaarterivirus, подроду Eurpobartevirus, виду Betaarterivirus suid 1, тип 1, подтип 1. RNA-геномный вирус, обладает морфологическими признаками, характерными для вируса РРСС.

Вирионы вируса РРСС представляют сферические или аморфные частицы диаметром от 45 до 100 нм с ядром, заполняющим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм. Длина генома РРСС составляет приблизительно 15000 нуклеотидов, которые кодируют как структурные, так и неструктурные белки. Неструктурные белки кодируются двумя открытыми рамками считывания (ORF) - ORF1a и ORF1b, которые расположены на конце 5'генома. Неструктурные белки были идентифицированы как основные белки, ответственные за ингибирование иммунного ответа, в частности за ингибирование выработки интерферона I типа. Структурные белки кодируются открытыми рамками считывания 2-7 на конце 3' вируса. На данный момент известно восемь структурных белков, пять из которых являются гликопротеинами: GP2, Е, GP3, GP4, GP5 белок ORF5a, белки М и N. Вирусный нуклеокапсид образует N-белок. Структурные белки GP2, GP3, GP4, GP5 и М вызывают выработку нейтрализующих антител.

Антигенные свойства

Вирус РРСС штамма «Борз» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА) или реакции нейтрализации (РН).

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах на перевиваемых культурах в течение 15 пассажей - срок наблюдения.

Штамм «Борз» обладает следующими биологическими свойствами: размножается с цитопатическим эффектом; безопасен для свиней; не риверсибелен (6 последовательных пассажей вакцинного вируса на безмолозивных поросятах); не вызывает персистенции у привитых свиней и не определяется в крови (через 7-10 дней); создает продолжительный напряженный иммунитет, через 21 сутки после введения вакцины, который сохраняется не менее 6 месяцев после двукратного применения, свободен от контаминации вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами; длительно хранится в сухом и жидком виде при температуре минус (50,0±1,0)°С.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Борз» вируса РРСС репродуцируется в перевиваемой культуре клеток: MARC-145 - культура клеток почки макаки-резус.

Хемо и генотаксономическая характеристика

Оригинальность штамма подтверждена нуклеотидным секвенированием генов N (ОРС7) и GP5 (ОРС5) (фиг. 1 и фиг. 2). Установлено, что штамм «Борз» отличается от «родительского» штамма «КПР-96» по двум аминокислотным остаткам (а.о.) в гликопротеине GP5 (Asp в позиции 173 заменен на Gly, a Asn в позиции 175 на Lys) и одному а.о. в нуклеокапсидном белке N (Ala в позиции 32 заменен на Ser).

Идентификацию и специфичность штамма определяют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования.

В результате проведенных исследований выявлен геном вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование гена ОРС5 подтвердило, что штамм «Борз» относится к европейскому генотипу вируса РРСС. Сравнение выведенных из нуклеотидных последовательностей ОРС5 аминокислотных последовательностей белка G5 показало, что штамм «Борз» отличается от штамма Lelystad по двум аминокислотным остаткам (а.о.). Двадцатый а.о. у штамма «КПР-96» представлен фенилаланином, а у штамма Lelystad - лейцином, в 37 позиции белка G5 у штаммов «КПР-96» и Lelystad находятся аспаргин и аспаргиновая кислота, соответственно.

Физические свойства

Масса вириона от 49×10³ Da до 55×10³ Da. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм вируса РРСС «Борз» чувствителен к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, формальдегид, а также к ультрафиолетовому облучению и гамма-облучению. Наиболее стабилен при рН 6,6-7,6. При 60°С инактивируется через 10 минут. Низкие температуры его консервируют, в замороженном виде вирус сохраняется несколько лет.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - апатогенен для свиней.

Вирулентность - авирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Таким образом, можно утверждать, что штамм «Борз» вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным и в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным аттенуированным штаммом вируса РРСС.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма «Борз» вируса РРСС в монослойной перевиваемой клеточной культуре.

Репродукцию вируса проводили на культуре монослойной перевиваемой линии клеток MARC-145. Культуру клеток выращивали на соответствующих питательных средах с добавлением сыворотки КРС до 10%. Перед внесением вируса клеточный монослой однократно промывали раствором Хенкса. Культуру заражали вирусом в дозе 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Адсорбцию вируса проводили при (37,0±0,5)°С в течение часа. После этого в сосуды с инфицированным монослоем вносили среду Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС. Культивирование проводили при (37,0±0,5)°С в течение 120-144 часов. Размножение вируса в культуре клеток определяли по характерному ЦПД. Флаконы, в которых наблюдали ЦПД с поражением 80% клеточного монослоя замораживали при минус (20,0±1,0)°С. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих исследований.

Для лиофилизации культуральную вирусную суспензию стабилизировали, используя защитную среду в соотношении 70% вируссодержащего материала и 30% стабилизатора, расфасовали по 4,0 см³ во флаконы соответствующей вместимости, замораживали при динамике минимум 24 ч при температуре минус 60°С и сублимационно высушивали 48 ч при режимах глубокого вакуума: сушка без подогрева первые 3 ч, режим с нагревом 29 ч и досушивание с подогревом 12-16 ч при температуре 24-27°С.

Для определения инфекционной активности полученного лиофилизата два флакона восстановили до первоначального объема питательной средой Игла. Для этого во флакон с лиофильным образцом внесли по 4,0 см³ питательной среды. После полного растворения лиофилизата, полученный концентрированный раствор из 2 флаконов объединили для постановки реакции титрования для определения инфекционного титра вируса. Титр вируса вычисляли по методу Спирмена-Кербера. Инфекционная активность вируса составила 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³. Лиофильно высушенный штамм «Борз» вируса РРСС хранили при температуре минус (2-8)°С и использовали при дальнейшей работе.

Пример 2. Изготовление экспериментальной вакцины на основе штамма «Борз» вируса РРСС

Образец вакцины для иммунизации свиней и подсвинков приготовили следующим образом. Лиофилизированную вирусную суспензию штамма «Борз» вируса РРСС восстановили до первоначального объема стерильным физиологическим раствором. Для этого во флакон с лиофильным образцом при помощи шприца внесли 4,0 см³ растворителя. После полного растворения лиофилизата, полученный концентрированный раствор из 2 флаконов перенесли в стерильный флакон большего объема, куда соблюдая правила асептики, добавили физиологический раствор - 192,0 см³ на объединенный объем экспериментальной вакцины.

Пример 3. Биологические свойства штамма «Борз» полученного на перевиваемой линии клеток MARC-145 определяли по следующим показателям:

- отсутствие бактериальной и грибковой контаминации (ГОСТ 28085);

- специфичность и отсутствие вирусной контаминации (ГФ XIV, том II, с. 2007-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15);

- инфекционная активность;

- антигенная активность и специфичность (метод ИФА);

- доказательство аттенуированности;

- отсутствие риверсибельности.

Для определения отсутствия бактериальной и грибковой контаминации штамма «Борз» использовали питательные среды Сабуро, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и среду Китта-Тароцци. Все используемые бактериальные среды были проверены на ростовые свойства согласно ГОСТ 28085. Для испытания из трех флаконов (отдельно из каждого) с культуральным вирусом отбирали по 1 см³ вируссодержащего материала в 4 пробирки с тиогликолевой средой.

Пробирки инкубировали при разных температурных режимах. По две пробирки с содержимым из каждого флакона выдерживали в термостате при температуре (37,0±0,5)°С, одну - при (30,0±0,5)°С, одну - при (22,0±0,5)°С. Через 7 суток из 3 пробирок, инкубируемых при (37,0±0,5)°С, делали пересев на следующие бактериальные среды: агар и жидкую среду Сабуро, МПБ и МПА, среду Китта-Тароцци и сахарный бульон. В среду Китта-Тароцци вносили по 1 см³, а в остальные - по 0,5 см³ исследуемого материала и выдерживали в течение 7 суток при температуре (37,0±0,5)°С, со средой Сабуро - при температуре (22,0±0,5)°С.

Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю в течение 14 суток. Результаты проверки представлены в таблице 1. На всех средах с высевами и пересевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не наблюдалось.

Штамм «Борз» вируса РРСС не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой.

Контроль контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2007-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15)

Вирусную культуральную суспензию замораживали при температуре минус 20°С и после размораживания центрифугировали 10 мин при 200 g (500 об/мин). Надосадочную жидкость в объеме по 1,0 см³ вносили в 2 пробирки с полужидкой средой Кагана (объем полужидкой среды Кагана в пробирке 10,0 см³) и инкубировали в течение 7 сут при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании срока инкубации проводили второй пассаж на таком же количестве пробирок с полужидкой средой и в двух чашках Петри с твердой средой Кагана (толщина твердой среды 0,5-0,7 см). Количество пассажей должно быть не менее двух. Рост микоплазм на жидких и твердых средах отсутствовал.

Определение специфичности и отсутствие вирусной контаминации проводили путем исследования пробы культуральной суспензии штамма «Борз» вируса РРСС методом ПЦР на наличие генома вируса РРСС, и отсутствие посторонних геномов вирусов:

- болезни Ауески (БА);

- парвовирусной инфекции свиней (ПВИС);

- классической чумы свиней (КЧС);

- гриппа свиней (ВГС);

- М. hyopneumoniae.

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном вируса РРСС соответствующий штамму «Борз». Геномы вирусов БА, ПВИС, КЧС, ГС а также возбудителя М. hyopneumoniae не обнаружены.

Определение специфичности и отсутствия контаминации штамма «Борз» вируса РРСС на подсвинках проводили с использованием 3 подсвинков массой 10-12 кг. Все животные были серонегативными по отношению к вирусам РРСС, КЧС, ПВИС, болезни Ауески, ВГС и М. hyopneumoniae.

Лиофилизированную вирусную суспензию (пример 2) восстановили до первоначального объема стерильным физиологическим раствором. Для этого во флакон с лиофилизатом при помощи шприца вносили по 4,0 см³ растворителя. После полного растворения лиофилизата, полученную суспензию объединенную из 4 флаконов перенесли в стерильный флакон большего объема для объединения с 384 мл физиологического раствора.

Всем животным вводили внутримышечно по 5 мл/гол объединенной пробы штамма «Борз» вируса РРСС с инфекционным титром 5,75 lg ТЦД₅₀/см³. До и через 28 суток после заражения от животных отбирали пробы крови. Полученные сыворотки крови исследовали методом ИФА и РТГА на наличие специфических антител против возбудителей:

- вируса КЧС с использованием коммерческого набора «Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<40 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>50 - наличие специфических антител;

- вируса РРСС с использованием коммерческого набора «Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- вируса ПВИС с использованием коммерческого «Набора для серодиагностики ПВИС в РТГА» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», значение ≥1:256 - наличие специфических антител;

- вируса болезни Ауески с использованием коммерческого набора «HerdChek PPV gB Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<50 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>100 - наличие специфических антител;

- ВГС с использованием коммерческих наборов ИФА HerdChek Swine Influenza H1N1 Antibody Test Kits (IDEXX Laboratories, USA) на наличие антител к вирусу гриппа свиней подтипов H1N1), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>0,4 - наличие специфических антител;

- М. hyopneumoniae с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<20 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>30 - наличие специфических антител.

Результаты исследований сывороток крови подсвинков на наличие антител к вышеуказанным возбудителям инфекций представлены в таблице 2.

Приведенные в таблице 2 данные показывают, что в испытанных образцах антитела к вирусам КЧС, ПВИС, болезни Ауески, ВГС и возбудителю М. hyopneumoniae не выявлены, что свидетельствует об отсутствии контаминации штамма «Борз» вируса РРСС вышеуказанными возбудителями. В то же время, специфические антитела к вирусу РРСС имели значения s/p 0,94-1,29.

Определение инфекционной активности проводили как на экспериментальных образцах вакцины, полученных в примере 2, так и на нативном вирусе РРСС штаммов «Борз» и «КПР-96», методом титрования, в культуре клеток Marc-145, в трех повторностях. Для этого содержимое 3 флаконов растворяли внесением в каждый флакон поддерживающей среды до исходного объема (по 4,0 см³) и объединяли в общую пробу. Из объединенной пробы (для лиофилизированного вируса) готовили десятикратное разведение вируса с 10^-1 по 10^-7. Каждое из разведений вируса вносили по 1 см³ в 4 пенициллиновых флакона с монослоем клеток (предварительно отмытых средой Хенкса), начиная с наибольшего. Инфицированные и контрольные культуры клеток инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С. Цитопатическое действие вируса учитывали ежедневно, окончательный учет результатов проводили через 144 ч. Титр вируса рассчитывали по методу Спирмена-Кербера. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле.

Результаты определения инфекционной активности экспериментального образца вакцины, нативного вируса РРСС штамма «Борз» и нативного вируса штамма «КПР-96» представлены в таблице 3, из которой видно, что инфекционная активность нативного штамма «Борз» выше на 0,5 lg TЦД₅₀/см³, чем штамма «КПР-96» и составила в среднем по группе 6,1±0,03 lg ТЦД₅₀/см³, в отличие от нативного штамма «КПР-96» 5,58±0,04 lg ТЦД₅₀/см³. Инфекционная активность лиофилизированного штамма «Борз» составила 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведены сравнительные исследования биологических свойств штаммов «Борз» (предлагаемое изобретение), «КПР-96», «БД» и Lelystad (CNCM №1-102) вируса РРСС. Результаты этих исследований представлены в таблице 4.

Данные таблицы показывают, что ЦПД у штамма «Борз» и штамма «БД» проявляется на 2 сутки после инфицирования монослоя культуры клеток Магс-145, и достигает максимального проявления на 4 сутки, с титром инфекционной активности 6,14±0,09 lg ТЦД₅₀/см³ и 6,85±0,1 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. ЦПД у штамма «КПР-96» как прототипа, появляется на 3 сутки после инфицирования монослоя, и достигает максимального проявления на 5 сутки, с титром инфекционной активности 5,55±0,04 lg ТЦД₅₀/см³.

Для определения аттенуированности штамма «Борз» вируса РРСС на свиньях использовали поросят 1,0-1,5 месячного возраста живой массой 10-12 кг серонегативных к вирусу РРСС. Вводили объединенную пробу вирусной суспензии штамма «Борз» вируса РРСС с инфекционным титром 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³. внутримышечно в объеме 4 см³/гол (группа №1-4 головы) и интраназально по 8 см³/гол. (группа №2-4 головы) (табл. 5).

Результаты представленные в таблице показывают отсутствие у поросят клинических признаков заболевания, а также отсутствие генома вируса РРСС в пробах крови отобранных на 7, 14 и 28 день после инъекции и исследованных методом ПЦР, в то время как специфические антитела к вирусу РРСС выявляли методом ИФА в значения s/p 0,79-1,76.

Таким образом можно утверждать, что представленный штамм «Борз» вируса РРСС является аттенуированным.

Штамм «Борз» вируса РРСС (предлагаемое изобретение) был также испытан на супоросных свиноматках. Использовали лиофилизированный вирус полученный в примере 1, с титром инфекционной активности вируса 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³. Лиофилизированный вирус восстановили до первоначального объема стерильным физиологическим раствором. Для этого в 5 флаконов с лиофильным образцом при помощи шприца внесли 4,0 см³ растворителя. После полного растворения лиофилизата, полученный концентрированный раствор объединили в общую пробу. Двум серонегативным свиноматкам ввели интраназально в дозе 8 см³/гол за 4 недели до опороса объединенную пробу вирусной суспензии штамма «Борз». Обе свиноматки опоросились на 114 день после осеменения. Характеристика приплода из 21 поросенка представлена в таблице 6.

Так, свиноматки принесли здоровых, живых, без патологий 21 поросенка, но 1 поросенок был задавлен свиноматкой при рождении. Этот поросенок погиб в первые сутки после опороса, что составляет 4,8% от общего количества приплода. У оставшихся поросят каких-либо клинических проявлений болезни в течение подсосного периода не наблюдали. Специфические антитела к вирусу РРСС в сыворотках крови поросят до приема молозива не обнаружены.

У двух вынужденно убитых поросят до приема ими молозива провели исследование внутренних органов на наличие генома вируса РРСС. Геном вируса РРСС не выявлен - получен отрицательный результат. Однако, выявили антитела к вирусу РРСС в сыворотках крови свиноматок, отобранных в день опороса на высоком уровне, значения s/p 1,9-2,3 (табл. 6).

Изучение риверсибельности штамма «Борз» вируса РРСС проводили методом последовательных пассажей на группе безмолозивных поросят. Образец вакцины, приготовленный из штамма «Борз» вируса РРСС (пример 2), вводили безмолозивному поросенку в объеме 4 см³/гол внутримышечно в область верхней трети шеи и интраназально в объеме 4 см³/гол. Через 3-5 дней у животного проводили отбор крови. Кровь дефибринировали и вводили в объеме 5 см³/гол внутримышечно в область верхней трети шеи следующему безмолозивному поросенку. Таким образом выполнили 6 последовательных пассажей. После каждого пассажа проводили клиническое наблюдение за животными в течение 21 дня после манипуляций.

Результаты исследований показали, что штамм «Борз» вируса РРСС не обладает риверсибельностью при прямых пассажах на чувствительных животных, так как отсутствуют клинические признаки заболевания характерные для репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Штамм «Борз» вируса РРСС является авирулентным.

Определение антигенной активности штамма «Борз» вируса РРСС проводили методом ИФА путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 14, 28 и 35 дней после их иммунизации образцом вакцины по примеру описанному выше, изготовленного из штамма «Борз» вируса РРСС (предлагаемое изобретение).

После проверки на стерильность и инфекционную активность препарат ввели 5 серонегативным к вирусу РРСС подсвинкам массой 10-12 кг внутримышечно в область верхней трети шеи в объеме 2 см³/гол.

Инфекционная активность штамма «Борз» вируса РРСС составляла 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³. Сыворотки крови животных, отобранные на 14, 28 и 35 день после однократной иммунизации исследовали методом ИФА используя коммерческого набора «Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit» (IDEXX).

Результаты изучения антигенной активности штамма «Борз» вируса РРСС представлены в таблице 7.

Данные таблицы 7 показывают, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков специфические антитела к вирусу РРСС не выявлялись, а через 14 дней после вакцинации у четырех животных были обнаружены вирусоспецифические антитела, s/p находилось в пределах 0,46-0,58. Через 28 и 35 дней у всех подсвинков также выявлялись антитела на достаточном уровне, среднее значение по группе составляло 0,72±0,02 и 0,8±0,03, соответственно.

Данный уровень специфических антител, является достаточным для защиты свиней против штамма «Борз» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

В результате эксперимента подтвердили эффективность изготовленного вакцинного препарата из штамма «Борз» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (предлагаемое изобретение) и возможность применения данного штамма для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики свиней данного заболевания.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «Борз» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1 рода Arterivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней»:

1. Collin J.E. et al. / Isolation of swine in infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the desease in gnotobiotic pig / J.Vet.Diagn.Invest., 1992, 4, 117-126.

2. Bell A. "Hot PRRS" is still hot // Pork. - 1998. - February. - P. 32-33. PPCC

3. Christianson W.T., Joo H.S. Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review // Swine Health and Production. - 1994. - V2, №2. - P. 10-28.

4. Meng X.J. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development // Vet. Microbiol. - 2000. - V.74, №4. - P. 309-329.

5. Stadejek Т., Oleksiewicz M.B., Potapchuk D., Podgorska K. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains of exceptional diversity in eastern Europe support the definition of new genetic subtypes // J. Gen. Virol. 2006. - V.87 (Pt 7). - P. 1835-1841.

6. Andreev V.G. et al. Genetic variations among PRRSV strains isolated in Italy and in Russia. Vet.Res., 2000, V31, P. 89-90

7. RU 2723040 C2, 20.07.2015 г.

8. RU 2295567 C1, 20.06.2005 г.

9. US8110390B2, 23.06.2006 г.

10. US 6410031 В1, 25.06.2002 г.

11. AU2012217170B2, 17.02.2011 г.

12. CN 103370078 В, 14.02.2012 г.

13. AU 2016204983 В2, 15.07.2016 г.

14. US20100129398 A1, 27.05.2010 г.

15. US7632636B2, 15.12.2009 г.

16. WO 199800163 А1, 28.06.1997 г.

17. US 5976537 А, 02.07.1996 г.

18. WO2013/017568 А1, 30.07.2012 г.

19. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств штаммов вируса РРСС / Гаврилова В.Л., Тетерин И.А., Кукушкин С.А. // Ветеринарная патология, №4. - 2006. - С. 94-100.

20. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней / Каньшина А.В. / Дисс. - Владимир, 2004 г.

21. Разработка средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней. / Кукушкин С.А. / Дисс. - М., 2009.

22. US 11351244 В2, 18.03.2020 г.

23. RU 2592667 С2, 09.11.2011 г.

24. ЕА 031432 В1, 14.02.2012 г.

25. RU 2755345 С2, 14.12.2017 г.

26. RU 2562595 С2, 24.08.2009 г.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №460 - деп / 23-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в перевиваемой культуре клеток Marc-145 - клон культуры клеток, изолированный из почки макаки-резус, в течение 96-120 ч инкубирования и накапливается в титре 5,8±0,02 lg ТЦД₅₀/см³, сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения). Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней. 2 ил., 7 табл.

Штамм «Борз» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №460 - деп / 23-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.