Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней.
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) и парвовирусная инфекция свиней (ПВИС) - это высококонтагиозные заболевания свиней, которые характеризуются нарушением функции воспроизводства у свиноматок, абортами, рождением мертвых или слабых поросят с высокой смертностью.
РРСС зарегистрировали в конце 80-х годов прошлого века сначала в хозяйствах США и Канады, а затем и во многих других странах. К середине 90-х годов им была охвачена почти вся Европа. В России и в некоторых других странах СНГ РРСС регистрируется с 1993 года.
Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus семейства Arteriviridae, впервые выделенный в 1991 году и названный "вирус Лелистад" (1).
Массовые вспышки РРСС наносят большой экономический урон свиноводческим хозяйствам. По данным различных источников годовая продуктивность при острой вспышке РРСС снижается на 5-20%.
Вирус РРСС обладает иммуносупрессивными свойствами и это создает предпосылки для возникновения вторичных вирусных или бактериальных инфекций. Установлено, что в большинстве свиноводческих хозяйств, неблагополучных по РРСС, одновременно циркулируют возбудители ряда заболеваний, в том числе и возбудитель ПВИС, также вызывая нарушения репродукции животных (2).
Возбудителем ПВИС является ДНК-содержащий вирус, относящийся к роду Parvovirus семейства Parvoviridae.
Связь парвовирусов свиней (ПВС) с нарушением воспроизводительной функции свиноматок в естественных условиях впервые была установлена в 1967 году в Великобритании, однако экспериментально болезнь была воспроизведена через 10 лет.
Заболевание у свиноматок протекает, как правило, без видимых симптомов. Наблюдается лишь нарушение репродуктивной функции. Вирус проникает через плаценту, поражает плоды в 1 половине супоросности, вызывая их мумификацию и гибель. Клинически болезнь проявляется прохолостами, ранними, в 1 половине супоросности, абортами и преждевременными родами. При возникновении заболевания в ранее благополучных хозяйствах рождение живых поросят на одну свиноматку в год снижается на 50-60%, в стационарно неблагополучных хозяйствах - на 10-20%.
ПВИС довольно широко распространена в мире и в свиноводческих хозяйствах нашей страны.
В настоящее время основными средствами борьбы с РРСС и ПВИС является специфическая профилактика, для которой применяются живые и инактивированные вакцины как моно-, так и ассоциированные препараты (3).
Преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при применении не вызывает сомнений, однако иммунная реакция у свиней при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации.
В мировом промышленном свиноводстве для специфической профилактики РРСС и ПВИС широко используют эмульсионные инактивированные моновакцины, приготовленные из различных штаммов возбудителей инфекций, репродуцированных в чувствительных биологических системах (4-13).
Основные недостатки указанных вакцин состоят в том, что они обладают низкой антигенной и иммунногенной активностью и/или являются небезопасными, так как при их изготовлении используют вирулентные штаммы, которые всегда создают проблемы при выполнении требований ветеринарно-санитарной безопасности.
Кроме того, указанные вакцины против РРСС и ПВИС являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизируемых животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.
Указанный недостаток частично устранен созданием ассоциированных вакцин, содержащих отдельно или в сочетании антигены вирусов РРСС и ПВИС различных штаммов.
Известна вакцина ассоциированная инактивированная против ПВИС и лептоспироза, содержащая антигены лептоспир серологических групп Pomona и Tarassovi, вируссодержащий материал штамма Parvovirusporaina И-82 с гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью) 1:256-1:1512 ГАЕ/0,025 см3, подобранные в оптимальных соотношениях, в качестве инактиванта формалин или формалин и димер этиленимина, а в качестве адъюванта гидроокись алюминия и белок сыворотки крови (14).
Известна вакцина ассоциированная инактивированная против ПВИС и болезни Ауески, содержащая антигенные материалы гомологичных возбудителей в оптимальных соотношениях (15).
Известна вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против цирковирусной инфекции свиней (ЦВИС) и ПВИС, содержащая антигенные материалы из штаммов гомологичных вирусов, репродуцированных в чувствительных биологических системах, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении (16).
Известна вакцина ассоциированная инактивированная против РРСС, ПВИС, лептоспироза и рожи свиней, содержащая антигенные материалы гомологичных возбудителей указанных инфекций в оптимальных соотношениях (17).
Основные недостатки указанных ассоциированных вакцин состоят в их низкой антигенной и иммуногенной активности.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина эмульсионная инактивированная против ПВИС, содержащая антигенный материал из штамма И-82 гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, и масляный адъювант в эффективном соотношении (18).
Вакцина-прототип имеет существенные недостатки:
- она обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против эпизоотического ПВС, циркулирующего на территории Российской Федерации;
- она не создает защиты против РРСС;
- в качестве инактиванта она содержит формалин, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины.
В связи с этим проблема создания вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС, обладающей высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по их совершенствованию. Необходимость разработки и производства этих вакцин обусловлена тем, что в девяти из десяти свиноводческих хозяйств Российской Федерации, неблагополучных по РРСС, одновременно циркулирует парвовирус. Это подтверждено результатами исследований как отечественных, так и зарубежных ученых.
В задачу создания настоящего изобретения входило разработать высокоиммуногенную и безвредную вакцину ассоциированную эмульсионную инактивированную против РРСС и ПВИС на основе новых производственных штаммов гомологичных вирусов, выделенных на территории Российской Федерации, обладающих высокий биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодных для изготовления ассоциированного эмульсионного инактивированного препарата, создающего напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России возбудителей РРСС и ПВИС.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин ассоциированных эмульсионных инактивированных против РРСС и ПВИС, обладающих высокой иммуногенной активностью и безвредностью и создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России возбудителей РРСС и ПВИС.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1. Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против РРСС и ПВИС.
2. Антигенный материал из возбудителя РРСС, репродуцированного в чувствительной биологической системе, в эффективном количестве.
2.1. В качестве антигенного материала из возбудителя РРСС антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС.
2.2. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145.
2.3. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Магс-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3.
3. Инактивант.
3.1. Из инактивантов аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).
3.2. АЭЭИ в виде 1% водного раствора.
3.3. АЭЭИ в концентрации 0,001-0,05%.
4. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0-32,0 мас.%.
5. Антигенный материал из возбудителя ПВИС, репродуцированного в чувствительной биологической системе, в эффективном количестве.
5.1. В качестве антигенного материала из возбудителя ПВИС антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС.
5.2. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки поросенка ППК.
5.3. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки поросенка ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3.
5.4. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ.
6. Инактивант.
6.1. Из инактивантов АЭЭИ.
6.2. АЭЭИ в виде 1% водного раствора.
6.3. АЭЭИ в концентрации 0,05-0,08%.
7. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, в количестве - 15,0-17,0 мас.%.
8. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС и антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" в соотношении, по меньшей мере, 2:1.
9. Масляный адъювант.
9.1. Из масляных адъювантов масляный адъювант ВНИИЗЖ (19).
9.2. Масляный адъювант ВНИИЗЖ в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
9.3. Из масляных адъювантов масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70".
9.4. Масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70" в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
10. Смесь антигенных материалов из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, и из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, соединяют с масляным адъювантом в соотношении, по меньшей мере, 47:53.
11. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, антигенный материал из штамма "ВЛ-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против РРСС и ПВИС.
2. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.
3. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВИС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.
4. Масляный адъювант.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145.
2. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3.
3. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Магс-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0-32,0 мас.%.
4. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК.
5. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3.
6. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ.
7. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 15,0-17,0 мас.%.
8. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС и антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС в соотношении, по меньшей мере, 2:1.
9. Из масляных адъювантов масляный адъювант ВНИИЗЖ.
10. Масляный адъювант ВНИИЗЖ в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
11. Из масляных адъювантов масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70".
12. Масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70" в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
13. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вакцина эмульсионная инактивированная против ПВИС.
2. Антигенный материал из возбудителя ПВИС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации.
3. Масляный адъювант.
По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины состоят в том, что в качестве антигенного материала из возбудителя ПВИС она содержит антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС и дополнительно антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145.
2. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3.
3. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0-32,0 мас.%.
4. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК.
5. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3.
6. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ.
7. Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 15,0-17,0 мас.%.
8. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС и антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС в соотношении, по меньшей мере, 2:1.
9. Из масляных адъювантов масляный адъювант ВНИИЗЖ.
10. Масляный адъювант ВНИИЗЖ в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
11. Из масляных адъювантов масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70".
12. Масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70" в количестве, по меньшей мере, 53,0 мас.%.
13. Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3 и инактивированного АЭЭИ, антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с биологической активностью, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активностью, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
Предлагаемая вакцина расширяет арсенал средств специфической профилактики РРСС и ПВИС.
Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в состав ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС введены антигенные материалы из новых штаммов возбудителей инфекций: антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" РРСС и антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС, - обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивирования и обеспечивающих получение вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых животных.
Авторами установлено, что между антигенами, которые использованы в составе предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция.
Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вируссодержащего материала используют АЭЭИ, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовления вакцины и повысить качество антигенного материала.
Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта ВНИИЗЖ или "Монтанид ИЗА-70".
Штамм "БД" является новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС, в нативном виде непатогенным.
Исходный вирус для получения штамма "БД" выделен из сыворотки крови свиней с клиническими признаками РРСС, полученной из СХП "Рассвет" Кировского района Ставропольского края в 1996 году. Производственный штамм "БД" получен путем многократных последовательных пассажей на 3-суточной культуре клеток Marc-145.
Штамм "БД" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 25 мая 1998 года под регистрационным шифром "БД-ДЕП".
Штамм "БД-ДЕП" является безвредным и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вакцинных препаратов.
Штамм "БД-ДЕП" вируса РРССС характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм "БД-ДЕП" вируса РРСС относится к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus, RNA-геномный, обладает морфологическим признаками, характерными для вируса РРСС: форма вириона шарообразная, размер вириона 45-75 нм с ядром, заполняющим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой.
Антигенные свойства
Вирус РРСС штамма "БД-ДЕП" стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявлена геномная РНК вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС показало его значительное (около 40%) отличие от штамма CNCM №1-1102 и штамма АТСС VR-2332, признанных эталонными в Европе и Северной Америке соответственно. Идентификацию и специфичность вируса РРСС определяли в ИФА (IDEXX, США) с контролем специфичности. Результат проведенной дифференциальной диагностики был отрицательным на вирус болезни Ауески, парвовирус свиней, вирус диареи КРС и вирус трансмиссивного гастроэнтерита.
Биотехнологические характеристики
Штамм "БД-ДЕП" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность. Штамм "БД-ДЕП" предназначен для приготовления диагностических и вакцинных препаратов. Штамм "БД-ДЕП" вируса РРСС репродуцируется в цитоплазме клеток 3-суточной культуры клеток Marc-145 при температуре 37°С. Исходной суспензией из сыворотки крови, содержащей вирус, заражали культуру клеток Marc-145. После проведения 7-10 пассажей в течение 48-72 часов инкубирования вирус накапливается до титра 4,0-4,5 lg ТЦД50/см3.
Инфекционность вируса повышали путем серийных быстро чередующихся пассажей, которая к 41 пассажу достигла 7,0-7,5 lg ТЦД50/см3. Штамм "БД-ДЕП" является стабильным и безвредным.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "БД-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота содержит одну нить, поверхность вируса покрыта слоем гликопротеинов. Белковая оболочка обнаруживает следующие фрагменты:
М - трансмембранный протеин;
Е - мембранный протеин;
GL - поверхностный гликопротеин;
GS - поверхностный гликопротеин;
N - нуклеокапсидный протеин.
Физические свойства
Масса вириона от 49×103 Да до 55×103 Да. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм "БД-ДЕП" не устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению и высыханию.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - через 14 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.
Реактогенность отсутствует.
Патогенность отсутствует.
Вирулентность отсутствует.
Онкогенность отсутствует.
Контагиозность отсутствует.
Стабильность аттенуации установлена при проведении 5 пассажей на чувствительных подсвинках.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм "БД-ДЕП" вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС.
Штамм "Вл-94" является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма "Вл-94" выделен во ВНИИ защиты животных в 1994 году при вирусологическом исследовании внутренних органов абортированных (до 15 см длиной) плодов свиноматок, привезенных из свинокомплекса "Владимирский" Владимирской области. Производственный штамм "Вл-94" ПВС получен последовательными пассажами на перевиваемой культуре клеток почки поросенка "Казанская" (ППК).
Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 1 июля 1996 года под регистрационным шифром "Вл-94-ДЕП".
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и отличается высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления вакцинных препаратов, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС относится к семейству Parvoviridae, роду Parvovirus. Зрелый вирион имеет кубическую симметрию, включает 32 капсомера, 2 или 3 капсидных белка, диаметр вириона около 20 нм, не содержит оболочки и липиды, мол. масса составляет 5,3×106 Да. Вирусный геном представлен 1-нитевой ДНК с мол. массой 1,4 кДа, т.е. около 26,5% массы полного вириона, доля гуанин + цитозин составляет 41÷53%. Плавучая плотность в CsCl полного инфекционного вируса, неполного ("пустого") вириона и экстрагированной вирионной ДНК составляет 1,38÷1,395; 1,30÷1,315 и 1,724 г/см3 соответственно. Коэффициент седиментации 110÷122 S.
Антигенные свойства
Вирус содержит три полипептида А, В и С с мол. массой 60÷90 кДа. Все сравнивавшиеся изоляты ПВС свиней оказались в антигенном отношении похожими, если не полностью идентичными. Их идентичность установлена в РН и РТГА. Вирус обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует синтез вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и приципитирующих антител, а также антигемагглютинина. Изучение антигенных свойств изолированных индивидуальных вирионных полипептидов возбудителя показало, что антисыворотка к каждому структурному белку нейтрализует инфекционную активность полных вирионов и взаимодействует со всеми тремя структурными белками вируса. Каждый индивидуальный белок взаимодействует с вируснейтрализующими антителами, полученными на введение полного вируса. Вирусспецифические антигенные детерминанты имеются предположительно на всех вирионных белках ПВС. Биологический полураспад антител у поросят зависит от их массы, в среднем он составляет от 18 до 20 дней.
Биотехнологические характеристики
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС хорошо размножается в перевиваемой культуре клеток ППК и накапливается в титре 8,0 lg ТЦД50/см3. Перевиваемая культура клеток СПЭВ нечувствительна к вирусу. Особенностью культивирования и накопления вируса является его зависимость от клеточного деления. Кривая размножения вируса зависит от количества митозов. Он хорошо размножается в делящихся клетках почки плода свиньи при заражении через 48 часов после посадки культуры. Наивысшая концентрация вируса достигается на 2-3 день культивирования. ЦПД характеризуется вакуолизацией и округлением клеток, диффузной грануляцией. При изучении цикла размножения методом иммунофлюоресценции было установлено, что антиген обнаруживается в ядре клеток через 6 часов после заражения и накапливается в максимальных количествах к 18-24 часам. Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС предназначен для изготовления инактивированных вакцинных препаратов против ПВИС. Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС является генетически стабильным и сохраняет иммунобиологические свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Геном ПВС штамма "Вл-94-ДЕП" представлен 1-спиральной линейной молекулой ДНК с мол.м. 1,4 кДа. 1-спиральная ДНК состоит примерно из 5 тысяч нуклеотидов и кодирует 4 белка - 3 структурных и 1 неструктурный. На обоих концах ДНК имеются неидентичные, самокомплементарные последовательности нуклеотидов (палиндромы), образующие 2-спиральные шпильки, резистентные к нуклеазе S1; 3'-концевая шпилька состоит из 115÷116 нуклеотидов, 5'-концевая - из 200÷242 нуклеотидов. Шпилечные структуры играют важную роль в репликации ДНК. Гены, кодирующие структурные белки, расположены в 5'-концевой половине, а ген, кодирующий неструктурный белок, - в 3'-концевой половине ДНК. В вирионах штамма "Вл-94-ДЕП" содержится минус-ДНК. Вирус штамма "Вл-94-ДЕП" является автономным (недефектным).
Патогенные свойства
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС патогенен для этого вида животных и апатогенен для хомяков и мышей. У всех зараженных поросят симптомы болезни и патоморфологические изменения обычно отсутствуют, однако обнаруживаются специфические антитела. Вирус выделяют из семенных пузырьков на 7-9 день после заражения. С 12 дня в сыворотке крови животных выявляют антигемагглютинин. У поросят, находившихся в контакте с зараженными животными, также обнаруживаются специфические антитела, что свидетельствует о контагиозности инфекции. После внутримозгового, орального и интраназального заражения у поросят каких-либо определенных воспроизводимых клинических симптомов не наблюдалось. Однако у таких животных удавалось выделить вирус из испражнений, крови и большинства тканей. К 7 дню выделяли специфические антитела. При заражении свиней вирусом из штамма "Вл-94-ДЕП" на разных стадиях беременности наблюдали трансплацентарное инфицирование плодов.
Гемагглютинирующие свойства
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС агглютинирует эритроциты морской свинки, цыпленка, кошки, крысы, мыши, обезьяны, человека и не агглютинирует эритроциты барана, лошади, свиньи, КРС, собаки, кролика, хомячка и утки. Для определения его ГА-активности используют эритроциты морской свинки, реакцию проводят при 4°С, а в качестве разбавителя применяют физиологический раствор, рН 7,2. ГА-активность в РГА составляла 1:2048 ГАЕ. Вирус не освобождается от эритроцитов при 37-40°С в течение одного часа, однако в щелочном буфере (рН 9,0) он полностью элюирует с них за 30 мин при комнатной температуре.
Физические свойства
Молекулярная масса вирионов составляет 5,5-6,2 МДа, плавучая плотность в градиенте CsCl 1,39÷1,42 г/см3, коэффициент седиментации 110÷122 S.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм "Вл-94-ДЕП" ПВС устойчив к действию различных физико-химических факторов. Сохраняет инфекционность при рН 3÷9 и 37°С в течение 1,5 часов, однако полностью инактивируется при рН 2 в тех же условиях. Вирус стабилен при 56°С в течение 2 суток, при 70°С - 2 часа и при 80°С инактивируется за 5 мин. Не теряет инфекционность в культуральной жидкости с 20% фетальной сыворотки КРС при 35÷37°С в течение 15 недель. Устойчив при обработке хлороформом, эфиром и фреоном в 10-50% концентрации в течение 10÷30 мин при комнатной температуре. Вирус резистентен к действию РНК- и ДНК-азы и протеаз (папаина, хемотрипсина, трипсина, пепсина), устойчив к действию ультразвука, инактивируется УФ-лучами, формалином, этиленимином и его производными: β-пропиолактоном, глутаральдегидом. В помещениях вирус сохраняет активность более 4 мес., в свинарниках - до 4÷6 мес.
Дополнительные признаки и свойства
Свободен от контаминации бактериями, грибной микрофлорой, микоплазмами и вирусами.
На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "Вл-94-ДЕП" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ПВС.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1.
Антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС для изготовления предлагаемой вакцины готовят из матрового вируса, выращенного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 3-суточного возраста с концентрацией клеток более 100 тыс.кл./см3. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145 6,5 lg ТЦД50/см3, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. Для изготовления 20 литров культурального производственного вируса РРСС берут 110-120 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм3 каждый. После слива ростовой среды и однократного отмывания ФБР или питательной средой в матрасы вносят по 5 см3 вируссодержащего материала матровой серии. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение часа. После этого в матрасы вносят среду Игла в объеме 150-200 см3 с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС с антибиотиками (гентамицин в концентрации 50 мкг/см3 или его аналоги).
Культивирование ведут при 37°С в течение 48-72 часов. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых заменяют среду. Размножение вируса в культуре клеток Marc-145 определяют по характеру ЦПД с образованием скопления шарообразным клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 48-72 часа), отбирают и замораживают при -20°С. Вирус для изготовления вакцины получают 2-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим сливом содержимого матрасов в одну емкость, соблюдая стерильные условия. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 минут. Очищенная от клеточного детрита вирусная суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторно-производственного контроля на инфекционную активность и стерильность.
Производственная серия вируса РРСС считается пригодной, если она соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Marc-145, по меньшей мере, 6,0 lg ТЦД50/см3, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.
Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию наработанного вирусного сырья ведут с помощью 1% водного раствора АЭЭИ, вносимого до конечной концентрации 0,001-0,05%. Для этого в суспензию, нагретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают значение рН 7,6-7,8 добавлением в нее 5% раствора янтарной кислоты. Инактивацию ведут в термостате при температуре (37±2)°C в течение 20-22 часов с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации суспензию охлаждают до 4-6°С, устанавливают значение ее рН в пределах 7,6-7,8 и отбирают пробы антигена для проверки на стерильность, авирулентность и иммуногенную активность, используя для этого известные специалисту методы.
Пример 2.
Антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС для изготовления предлагаемой вакцины готовят из матрового вируса, адаптированного к перевиваемой культуре клеток почек поросенка ППК, выращенной на питательной среде пристеночной (ПСП), и проявляющего инфекционную активность в культуре клеток ППК, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активность, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ. Для получения антигенного материала используют выращенную в матрасах культуру клеток ППК с хорошим монослоем 2-суточного возраста. Для получения 20 литров суспензии ПВС берут 110-120 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм3 каждый. После слива ростовой среды в матрасы вносят по 5-7 см3 ПВС матровой расплодки. После 40-60 минут инкубирования при температуре (37±2)°C в матрасы вносят по 150-200 см3 поддерживающей среды (без сыворотки КРС). Зараженные матрасы помещают в термостат для культивирования при температуре (37±2)°C. Срок культивирования от 48 до 72 часов. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых ростовую среду меняют на 200 см3 поддерживающей среды без сыворотки. После 24 часов инкубирования инфицированные и контрольные матрасы ежесуточно микроскопируют. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 48-72 часа), отбирают, трехкратно замораживают при температуре не выше -20°С и оттаивают. Затем вируссодержащий материал очищают от клеточного детрита. Для этого содержимое матрасов сливают в одну емкость и охлажденную вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Очищенная от клеточного детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. В очищенную суспензию вносят гентамицин (100 ЕД) и перемешивают 20 мин. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторно-производственного контроля на стерильность, инфекционную и ГА-активность вируса. Производственная серия ПВС должна иметь инфекционную активность, по меньшей мере, 7,5 lg ТЦД50/см3 и ГА-активность, по меньшей мере, 1:2048 ГАЕ. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию наработанного вирусного сырья ведут с помощью 1% водного раствора АЭЭИ. Для этого в суспензию, нагретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,05-0,08% и устанавливают значение рН 7,6-7,8 добавлением в суспензию 5% раствора янтарной кислоты. Инактивацию ведут в термостате при температуре (37±2)°C в течение 20-22 час с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации суспензию охлаждают до 4-6°С, устанавливают значение рН 7,6-7,8 и отбирают пробы антигенного материала для проверки на стерильность, авирулентность и ГА-активность, используя для этого известные специалисту методы.
Пример 3.
Вакцину ассоциированную эмульсионную инактивированную против РРСС и ПВИС готовят путем диспергирования смеси антигенных материалов из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС и штамма "Вл-94-ДЕП" ПВС с масляным адъювантом.
Для этого антигенные материалы, полученные так, как описано в примерах 1 и 2, смешивают при интенсивном перемешивании в соотношении 2:1, т.е. 2 части антигенного материала вируса РРСС и 1 часть ПВС, что соответствует их содержанию в предлагаемой вакцине, мас.%:
Затем полученную смесь эмульгируют с масляным адъювантом в соотношении 47:53. В качестве масляного адъюванта используют масляный адъювант ВНИИЗЖ или масляный адъювант "Монтанид ИЗА-70" (фирмы Seppic, Франция), так как по иммуностимулирующей активности они идентичны.
Готовую вакцину собирают в стерильную емкость, фасуют в стерильные стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.
Вакцина представляет собой эмульсию белого или белого с розовым оттенком цвета, слегка вязкой консистенции. При длительном хранении (свыше 12 месяцев) возможно незначительное отслоение минерального масла над нерасслаивающейся однородной эмульсией. При встряхивании вакцина приобретает однородную гомогенную структуру.
Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
Содержание антигенных материалов в вакцине в указанных выше пределах является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.
Предлагаемую вакцину применяют с профилактической целью в неблагополучных и угрожаемых по РРСС и ПВИС хозяйствах. Свиноматок, свинок и хряков-производителей прививают двукратно с интервалом 20-30 дней за три недели до случки (осеменения). В последующем ранее иммунизированных свиноматок прививают однократно за три недели до случки (осеменения), а хряков-производителей ревакцинируют через каждые 6 месяцев.
Поросят, родившихся от вакцинированных против РРСС и ПВИС свиноматок, иммунизируют в 1,5-2-месячном возрасте двукратно с интервалом 20-30 дней. Вакцину вводят внутримышечно за ухом в дозе 2 см3 независимо от возраста животных.
Иммунитет у привитых животных наступает на 21-30 сутки после вакцинации и сохраняется не менее 6 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против РРСС и ПВИС, обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 20-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевых вирулентных возбудителей РРСС и ПВИС в ранний период жизни.
Пример 4.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС на основе штаммов "БД-ДЕП" и "Вл-94-ДЕП" соответственно, изготовленной так, как описано в примерах 1, 2 и 3, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцины определяли на подсвинках живой массой 30-40 кг 4-6-недельного возраста, свободных от антител к вирусу РРСС и ПВИС. Вакцину вводили по 2,0 см3 внутримышечно в области шеи. У животных до вакцинации и через 34 дня после вакцинации были отобраны пробы крови и исследованы в ИФА (наборы фирмы IDEXX, США) на наличие специфических антител. Их оценка проводилась по значению величины S/P против вируса РРСС и титра ГА-активности против ПВС.
Результаты исследований приведены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что в сыворотках крови вакцинированных животных появились специфические антитела в высоких титрах. Вакцинированные животные не заболели после контрольного заражения их вирулентным эталонным вирусом РРСС, штамм "Лелистад".
Пример 5.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС на основе штаммов "БД-ДЕП" и "Вл-94-ДЕП" соответственно, изготовленной так, как описано в примерах 1, 2 и 3, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцины определяли на подсвинках живой массой 30-40 кг 4-6-недельного возраста, свободных от антител к вирусу РРСС и ПВИС. Вакцину вводили по 2,0 см3 внутримышечно в области шеи. У животных до вакцинации и через 34 дня после вакцинации были отобраны пробы крови и исследованы в ИФА (наборы IDEXX, США) на наличие специфических антител. Их оценка проводилась по значению величины S/P против вируса РРСС и титра ГА-активности против ПВС.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что в сыворотках крови животных, вакцинированных вакциной против РРСС и ПВИС, выявлен высокий уровень поствакцинальных антител.
Пример 6.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС на основе штаммов "БД-ДЕП" и "Вл-94-ДЕП" соответственно, изготовленной так, как описано в примерах 1, 2 и 3, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцины определяли на подсвинках живой массой 30-40 кг 4-6-недельного возраста, свободных от антител к вирусу РРСС и ПВИС. Вакцину вводили по 2,0 см3 внутримышечно в области шеи. У животных до вакцинации и через 34 дня после вакцинации были отобраны пробы крови и исследованы в ИФА (наборы фирмы IDEXX, США) на наличие специфических антител. Их оценка проводилась по значению величины S/P против вируса РРСС и титра ГА-активности против ПВС.
Результаты исследований представлены в таблице 3.
Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС.
Пример 7.
Для проведения испытания иммуногенной активности предлагаемой вакцины изготовлено три опытных образца препарата с различной концентрацией антигенов и масляным адъювантом ВНИИЗЖ.
После проверки на стерильность и безвредность на мышах каждый образец вводили внутримышечно в область бедра 5 кроликам по 1 см3 и трем подсвинкам в область шеи по 2 см3. За животными вели постоянное наблюдение. Кровь у животных отбирали до и через 30 суток после вакцинации. Наблюдение за привитыми животными показало, что вакцина безвредна, так как каких-либо отклонений в их состоянии не отмечали. Сыворотку крови на наличие антител против вируса РРСС исследовали в РНГА, а против ПВС - в РТГА. Результаты исследований сывороток крови вакцинированных свиней приведены в таблице 4.
Согласно данным таблицы 4 все животные, использованные в опыте, были серонегативными, за исключением отдельных кроликов, у которых в сыворотке крови были выявлены антитела против ПВС в низких титрах (≤1:128). Через 30 суток в сыворотках крови у всех вакцинированных животных выявлены специфические антитела против вирусов РРСС и ПВИС. Так, у подсвинков антитела против вируса РРСС в среднем по группам колебались от 1:426±107 до 1:853±213, а у кроликов - от 1:448±78 до 1:512±78. Титры антител против ПВС были высокие и в среднем по группе составили 1:1024±0-1:1365±341 у подсвинков и 1:512±0-1:1024±0 у кроликов. Содержание антигена от 43% до 47% существенно не влияло на иммуногенность вакцины.
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что изготовленные образцы эмульсионной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС безвредны и обусловливают в сыворотках крови привитых животных достаточно высокий уровень специфических антител. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования кроликов для оценки иммуногенности вакцины.
Пример 8.
Предлагаемая вакцина была проверена на иммуногенную активность путем контрольного заражения иммунизированных животных вирулентным вирусом РРСС, штамм Лелистад. Кроме этого, отобранные парные сыворотки крови до вакцинации и перед контрольным заражением были исследованы с помощью коммерческого набора ИФА (IDEXX). Обобщенные результаты этих опытов представлены в таблице 5.
Согласно данным таблицы 5 шесть из девяти вакцинированных подсвинков имели через 35 суток высокий уровень антител в крови против вируса РРСС. Так, в ИФА отношение S/P у них составляло от 0,51 до 0,9, и лишь у трех подсвинков результат был сомнительный. Следует отметить, что коммерческий набор ИФА (IDEXX) рассчитан для оценки уровня антител у переболевших животных и поэтому значение S/P от 0,3 до 0,4 является сомнительным. Титры антител против ПВС были высокими и колебались в пределах от 1:512 до 1:2048. Невакцинированные животные остались серонегативными.
Результаты контрольного заражения показали, что все вакцинированные подсвинки, в том числе и с показателями S/P 0,28; 0,34; 0,35, не заболели. В процессе наблюдения за ними никаких клинических проявлений заболевания не отмечали. Температура тела у вакцинированных животных оставалась в норме.
Три контрольных (невакцинированных) подсвинка заболели с типичной клинической картиной РРСС (угнетение, отсутствие аппетита, конъюнктивит, кашель, цианоз кожных покровов) и с повышением температуры тела.
Пример 9.
Для изучения иммуногенности предлагаемой вакцины, а также определения ее безвредности были проведены опыты на двух серонегативных супоросных свиноматках (47-50 дней супоросности). Вакцину вводили однократно в объеме 2 см3 внутримышечно (за ухом). Через 42 дня после введения вакцины (на 90-93 день супоросности) свиноматки были интраназально заражены вирулентным европейским вирусом РРСС, штамм Лелистад, в объеме 10 см3 вируссодержащей жидкости с титром 4,0 lg ТЦЦ50/см3. За животными вели клиническое наблюдение в течение 4-х месяцев. Через 37 дней после вакцинации были отобраны пробы крови и сыворотки были исследованы в ИФА (ВНИИЗЖ) на наличие антител против вируса РРСС. После вакцинации и контрольного заражения у супоросных свиноматок не отмечали каких-либо отклонений от физиологической нормы. Температура тела животных оставалась в пределах нормативных показателей, аппетит сохранялся, животные активно реагировали на окружающую обстановку. Местная реакция на введение вакцины отсутствовала.
На 37 сутки после вакцинации в сыворотках крови животных выявляли специфические антитела к вирусу РРСС в титрах 1:400 и 1:200. Эти свиноматки принесли 16 поросят, из них 14 живых здоровых и 2 мертворожденных. Сохранность среди живых здоровых поросят за время подсосного периода составила 100%.
У подсосных поросят были отобраны пробы крови и сыворотки исследованы на наличие антител к вирусу РРСС. До приема молозива поросята оставались серонегативными, а на 4-7 день после приема молозива в сыворотках крови новорожденных поросят выявляли высокие титры антител (1:400) против вируса РРСС.
Таким образом, предлагаемая вакцина против РРСС и ПВИС является иммуногенным и безвредным препаратом даже для супоросных свиноматок, защищая их от контрольного заражения вирулентным вирусом РРСС, штамм Лелистад.
Пример 10.
Изучение эффективности предлагаемой вакцины проводили в ряде благополучных и неблагополучных по РРСС и ПВИС свиноводческих хозяйствах.
С целью изучения напряженности поствакцинального иммунитета у свиноматок, привитых ассоциированной вакциной против РРСС и ПВИС, было исследовано 5 свиноводческих хозяйств. Вакцину применяли согласно наставлению по применению ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС, т.е. свиноматок, свинок и хряков-производителей первый раз вакцинировали двукратно с интервалом 21-25 дней за 2-3 недели до осеменения. Поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, прививали в 1,5-2-месячном возрасте двукратно с интервалом 20-30 дней. От вакцинированных животных отбирали пробы крови через 2-8 недель после иммунизации, т.е. перед осеменением и в первой половине супоросности, во второй половине супоросности и сразу после опороса. Кроме того, кровь отбирали от поросят, полученных от этих свиноматок до приема ими молозива и в различные сроки после вакцинации. Сыворотки крови от животных исследовали в реакциях РНГА, ИФА (ВНИИЗЖ) и РТГА. Результаты исследований сывороток крови от вакцинированных свиней в благополучных хозяйствах представлены в таблице 6.
Из таблицы 6 видно, что у свиней разных половозрастных групп через 55-70 дней после вакцинации в сыворотках крови выявлен высокий уровень поствакцинальных антител. Особенных отличий в напряженности иммунитета у этих групп животных не отмечали.
Результаты исследований сывороток крови из неблагополучных хозяйств от свиноматок в различные сроки супоросности и от поросят, не принимавших молозиво, представлены в таблице 7.
Как видно из таблицы 7, у свиноматок, привитых ассоциированной вакциной против РРСС и ПВИС, в сыворотках крови выявлен высокий титр антител против возбудителей этих инфекций. После опороса уровень антител несколько снижается, но остается довольно высоким. Таким образом, предложенная схема иммунизации обеспечивает иммунитет против РРСС и ПВИС на высоком уровне за весь период супоросности свиноматок. Отсутствие антител в сыворотках крови у "домолозивных" поросят является прямым показателем эффективности применяемой вакцинации.
Пример 11.
Эффективность ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС изучали в ряде свиноводческих хозяйств, неблагополучных по РРСС и ПВИС, в которых проводили эпизоотологический анализ до и после вакцинации, учитывая снижение процента мертворождаемости и смертности поросят. Результаты анализа эпизоотической ситуации в этих хозяйствах представлены в таблице 8.
Как видно из таблицы 8, регулярная профилактическая вакцинация животных значительно снижает в хозяйствах количество свиноматок с репродуктивной патологией (мертворождаемость и рождение нежизнеспособных поросят).
Таким образом, ассоциированная эмульсионная инактивированная вакцина против РРСС и ПВИС является эффективным препаратом для специфической профилактики этих заболеваний, она безвредна и обладает достаточной иммуногенностью. Несмотря на то, что вакцина применялась в неблагополучных по РРСС и ПВИС хозяйствах, где имелось большое количество больных животных, она позволила улучшить ситуацию и в течение 5-24 месяцев количество свиноматок, приносящих мертвых поросят, снизилось в среднем до 2,7%.
Приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против РРСС и ПВИС, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемой вакцины против РРСС и ПВИС достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".
Источники информации
1. Wensvoort G. et. al. Mystery Swine Disease in the Netherlands: The isolation of Lelystad virus. - Vet.Quarterly, 1991, 13, 3, 121-130.
2. Мищенко В.А., Авилов В.М. и др. Репродуктивно-респираторный синдром свиней ("синее ухо"). - Ветеринария, 1994, №9, 22-24.
3. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, 552-558, 573-584.
4. РСТ №92/21375; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, C 12 N 7/00; 10.12.92.
5. РСТ №93/07898; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, C 12 N 7/00; 29.04.93.
6. Пат. Франции №2682966, C 12 N 7/02, 30.04.93.
7. ЕР 0676467; C 12 N 7/00, А 61 К 39/12, С 12 Р 21/08, С 07 К 16/10; 11.10.95.
8. Пат. США №5587164, 424-218.1, 24.12.96.
9. Пат. США №5690940, 424-229.1, 25.11.97.
10. Пат. США №5866401, 435-237, 02.02.99.
11. Пат. Великобритании №2282811; C 12 N 15/40, А 61 К 39/12, С 07 К 14/18, C 12 N 7/02, 7/04; 19.04.95.
12. Орлянкин Б.Г., Сергеев В.А. и др. Вакцина против ПВИС. - Ветеринария, 1989, №8, 28-30.
13. Драбек И., Ержабек И. и др. Оценка антигенной активности вакцин против парвовирусной болезни свиней на лабораторных животных. - Ветеринария, 1988, №11, 32-34.
14. Пат. РФ №1538305, А 61 К 39/295, 15.12.94.
15. Plana J., Vayreda М., Реу Т. et.al. Results of challende in gilts vaccinated with a porcine vaccine against porcine parvovirus and Aujeszky's disease. - Proc.8th. Inc. Pig.Vet.Soc.Congr. - Ghent, Belgium, 1984, 11.
16. Заявка Франции №2781159, А 61 К 39/23, 21.03.2000.
17. Орлянкин Б.Г., Непоклонов Е.А. и др. Диагностика и специфическая профилактика РРСС. - Ветеринария, 2000, №10, 16-19.
18. Орлянкин Б.Г., Политов О.Ю. и др. Антигенная активность вакцины против парвовирусной болезни свиней с масляным адъювантом. - Труды ВИЭВ, Т.69 "Новые методы и средства диагностики, профилактики и терапии болезней животных". - М., ВИЭВ, 1991, 85-87 (прототип).
19. Пат. РФ №2108111, А 61 К 39/39, А 61 К 39/00, 39/102, 39/12, 39/135, 10.04.98.
Иммуногенная активность эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС
"-" - отсутствие клинических признаков болезни;
S/P меньше 0,3 - отрицательный результат;
S/P равно 0,3-0,4 - сомнительный результат;
S/P больше 0,4 - положительный результат.
Иммуногенная активность эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС
"-" - отсутствие клинических признаков болезни;
S/P меньше 0,3 - отрицательный результат;
S/P равно 0,3-0,4 - сомнительный результат;
S/P больше 0,4 - положительный результат.
Иммуногенная активность эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС
"-" - отсутствие клинических признаков болезни.
Показатели иммуногенной активности ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС в опытах на подсвинках и кроликах
3
<1:32
1024±0
3
<1:32
1126±198
3
<1:32
1365±341
Показатели иммуногенной активности эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС на подсвинках
"+" - наличие температурной реакции и типичных клинических проявлений;
"-" - отсутствие температурной реакции и клинических проявлений.
Показатели напряженности поствакцинального иммунитета у свиней разных половозрастных групп, привитых эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС и ПВИС
>1:100 - положительный результат.
Значение в РТГА <1:64 - отрицательный результат;
>1:128 - положительный результат.
Титры антител у свиноматок, иммунизированных против РРСС и ПВИС
Эффективность применения эмульсионной инактивированный вакцины против РРСС и ПВИС в неблагополучных по этим заболеваниям хозяйствах
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ | 2002 |
|
RU2214276C1 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ | 2002 |
|
RU2214275C1 |
| ШТАММ "ВЛ-94" ПАРВОВИРУСА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2002 |
|
RU2212898C1 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ЭМУЛЬСИОННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ | 2002 |
|
RU2236254C2 |
| ВАКЦИНА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ | 2002 |
|
RU2236253C2 |
| ШТАММ "КПР-96" ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И/ИЛИ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2005 |
|
RU2295567C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ | 2006 |
|
RU2316346C2 |
| Штамм "Борз" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1 рода Arterivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней | 2023 |
|
RU2806601C1 |
| Вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней живая культуральная сухая и способ изготовления вакцины | 2024 |
|
RU2825899C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ | 2004 |
|
RU2271220C1 |
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал из штамма "БД-ДЕП" вируса РРСС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Marc-145 и инактивированного аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" возбудителя ПВИС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в эффективном соотношении. Штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под вышеуказанными регистрационными шифрами. Вакцина представляет собой эмульсию белого или белого с розовым оттенком цвета. Вакцину вводят животным внутримышечно за ухом в дозе 2 см3 независимо от их возраста. Иммунитет у привитых животных наступает на 21-30 сутки после вакцинации и сохраняется не менее 6 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против РРСС и ПВИС, обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 20-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевых вирулентных возбудителей РРСС и ПВИС в ранний период жизни, безвредна. 13 з.п. ф-лы, 8 табл.
| ОРЛЯНКИН Б.Г | |||
| и др | |||
| Антигенная активность вакцины против парвовирусной болезни свиней с масляным адъювантом | |||
| Новые методы и средства диагностики, профилактики и терапии болезней животных | |||
| Труды ВИЭВ | |||
| М., 1991, т.69, с.85-87 | |||
| Временное наставление по применению вакцины эмульсионной инактивированной против РРСС, утверждено Департаментом ветеринарии 04.02.1997; №13-4-21848. |
