СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДНОЙ ФРАКЦИИ СМОЛЫ ТРАГАКАНТ ИЗ РАСТЕНИЯ РОДА ASTRAGALUS, КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИСАХАРИДНОЙ ФРАКЦИИ, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА РАКОВОЙ ОПУХОЛИ, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/78 

Изобретение касается получения и использования очищенных фракций полисахаридного эксудата определенных видов растений Astragalus, которые ингибируют раковые клетки и вирусы Y млекопитающих и могут быть использованы для лечения иммунозависимых болезней. Более конкретно, изобретение касается водных инфузий полисахаридов определенных растений подвида Tragacantha вида Astragalus, которые обладают иммуномодулирующей активностью, т.е. ингибируют образование, рост, размножение и разрастание злокачественных опухолей, ингибируют репликацию патогенных вирусов и лечат другие иммуночувствительные болезни.

Род Astragalus семейства Leguminosae включает в себя 2000 или более видов, широко распространенных в мире, из которых только определенные растения подвида Tragacantha продуцируют эксудат, богатый полисахаридами. Большинство видов, продуцирущих полисахаридную смолу, происходят из стран Среднего Востока: Восточной Турции, Азербайджана, Сирии, Ирака и Ирана вплоть до Западного Китая. Смола из этих видов Astragalus является коммерческим товаром под названием Трагакант. Он используется в продуктах питания как стабилизатор, загуститель и эмульгатор и в фармацевтических продуктах как суспензирующий агент. Он общепризнан как безвредный продукт (с официальной этикеткой GRAS) в соответствии с классификацией Food and Drug Administration для использования в пище США. Другие страны также классифицируют этот продукт как безвредный для использования в качестве пищевой добавки.

Смола откладывается в центральном цилиндре главного корня растения. Ее собирают с живого растения, делая надрез или просверлив отверстие в корневом цилиндре ниже кроны, откуда смолистый эксудат вытекает в виде ленты. Смолу сушат 1-2 ч до полухрупкого состояния, после чего ее можно отрывать руками. Смола содержит как водорастворимые, так и нерастворимые полисахариды и другие побочные компоненты. Химически гетерогенный полностью высушенный эксудат продается под названием трагакант - в виде ленты или порошка. Было подсчитано, что не менее 1 млн. фунтов трагаканта в год собирается с диких растений для пищевых добавок и фармацевтического использования.

Roe ("Growth Inhibition of Mouse Ascites Tumor Cells by Powdered Tragacanth (Tragacantha Pulvis, B. P.), Nature 184:1891 (1959)) ["Ингибирование роста клеток опухоли асцита мышей порошком трагаканта (порошок трагаканта, В.Р.)"] обнаружила, что порошки некоторых трагакантов ингибируют размножение раковых клеток в брюшной полости мыши. Суспензированные раковые клетки асцита Landschutz были имплантированы в брюшную полость мыши, где они размножались и могли были проанализированы с помощью счетной техники. Серозная жидкость брюшной полости была идеальной средой для размножения и роста этих трансплантированных асцитных раковых клеток. Асцитные раковые клетки культивировались в брошкой полости и размножались в нормальных условиях. Когда коммерческий трагакант в воде был введен в брюшную полость, размножение раковых клеток ингибировалось. Roe предположила, что трагакант оказывает непосредственное цитостатическое действие на раковые клетки. Ингибирование объяснялось ассоциацией полисахарида с оболочкой асцитной раковой клетки с результативным ингибированием митоза. Это явление было изучено в серии статей (Roe et al.), последовавших за первым сообщением (Galbraith et al., "Mode of Inhibitory Action of Tragacanth Powder on the Growth of the Landschutz Ascites Tumor", Brit. J. Cancer 16:163 (1962) ["Способ ингибирующего действия порошка трагаканта на рост асцитной опухоли Landschutz"); Galbraith et al. , "Physical changes Measured by Interference Microscopy in Fresh Landschutz Ascites Tumor Cells After Tragacanth and Mannitol Mustard Treatments", Brit. J. Cancer 17:738 (1963) ["Физические изменения, измененные с помощью микроскопной интерференции, в свежих клетках асцитной опухоли Landschutz после обработки трагакантом и Mannitol Mustard"]; Mayhew & Roe "Changes in Mitotic Index of the Landschutz Ascites Tumor Treatment with Tumor-Inhibitory or Non-Inhibitory Samples of Gum Tragacanth or Gum Karaya, Brit. J. Cancer 18:528 (1964) ["Изменения в митозном индексе асцитной опухоли Landschutz после обработки ингибиторами опухоли или неингибиторными образцами смолы трагаканта или смолы карайя"] ; Mayhew & Roe "Changes in Permeability of Landschutz Ascites Tumor Cells to Vital Stains After Treatment with Tumor-Inhibitory or Modified Samples of Gum Tragacanth or with Gum Karaya, Brit. J. Cancer 18:235 (1964) ("Изменения проницаемости асцитных опухолевых клеток Landschutz к жизненным красителям после обработки ингибиторами опухоли или модифицированными образцами смолы трагаканта или смолы карайя" ]; Mayhew & Roe "Microscopical Observations of the Effects of Tumor-Inhibitory or Non- Inhibitory Samples of Gum Tragacanth on Landschutz Ascites Tumor Cells", J. Roy. Microscop. Soc. 84:235 (1965) ("Микроскопические исследования действия образцов ингибитора опухоли и неингибитора смолы трагаканта или смолы карайя на клетки асцитной опухоли Landschutz"]; Carr & Roe "Change in Shape of Peritonial Macrophages after Stimulation as Studied by the Tragacanth-PAS Technique, J. Roy. Microscop. Soc. 88:205 (1967) ["Изменение формы брюшных макрофагов после стимулирования, - изучение с помощью) Tragacanth-PAS методов"]; Roe et al. "Action of Tumorinhibitory Gum Tragacanth on Potassium Permeability of Ascites Tumor Cells and Partial Characterization of the Cytoxic Component", Cancer Res. , 32: 1067 (1972) ("Действие ингибирующей опухоль смолы трагаканта на проницаемость калия в клетки асцитной опухоли и частичная характеристика цитологического компонента"). В дополнение к линии Landschutz Roe работала с асцитными раковыми клетками в брюшной полости Crocker Вр8 и С+ leukemia. Она исследовала трагакантные порошки, которые, как она полагала, были Astragalus gummifer - широкораспространенное, но неточное определение вида Astragalus, продуцирующего смолу, и тип "трагаканта" из индийского Sterculia urens, который на самом деле был смолой карайя. Это были только два вида растений, упомянутых Roe в ее изучении трагаканта.

Roe и др. (1972), см. выше, опубликовали свое заключительное изучение взаимодействия трагаканта с асцитными раковыми клетками как in vivo, так in vitro. В этой работе с коммерческим трагакантом было найдено, что ингибирующий митоз компонент локализуется только в растворимой в воде фракции. Как и в ранних работах этой лаборатории, степень ингибирования водорастворимых фракций была определена путем подсчета асцитных раковых клеток, взятых из брюшной полости ингибированных мышей. Ингибирующая активность водорастворимой фракции исчезает при кипячении в течение 5 мин. Никто из числа Roe и ее сотрудников не опубликовал данных по изучению раковых клеток, находящихся вне брюшной полости. Прямой поверхностный контакт асцитных раковых клеток с внутрибрюшинно введенными препаратами трагаканта всегда предполагался как механизм, управляюший ингибированием митоза. Действие на клеточные мембраны в большей степени, чем иммуномодулирующая активность, как сообщалось, вызывало ингибирование. Эти поверхностные эффекты действия полисахарида на раковую клетку непосредственно в брюшной полости могли быть первичной причиной ингибирования митоза согласно работам группы Roe. В работах Roe не рассматривалась возможная иммуномодулирующая активность, которая приводила к ингибированию раковых клеток плотных опухолей вне брюшной полости.

Nakahara и др. ("Host Medical Antitumor Effects of Some Plant Polysaccharides", Gann 55:283 (1964) ["Вызываемый хозяином противоопухолевый эффект некоторых растительных полисахаридов"]) изучил влияние некоторых растительных полисахаридов на ингибирование раковых клеток, имплантированных в паховую область мыши. В этом исследовании асцитные раковые клетки Ehrlich были извлечены из брюшной полости одной мыши и введены подкожно в паховую область другой мыши, где они выросли в твердую опухоль. После того, как имеющим опухоли мышам были введены внутрибрюшинно полисахариды, рост твердой опухоли паховой области регистрировался путем забивания мышей с осмотром и взвешиванием массы опухоли. Полисахариды Bam-boo оказывали ингибирующее действие на рост опухоли в паховой области, но трагакант не имел такого эффекта. Это исследование показывает, что трагакант, введенный внутрибрюшинно, не действует на твердую опухоль, находящуюся вне брюшной полости.

Osswald ("Der Einfluss verschiedener Polysaccharide auf das Wachstumsverhalten des Ehrlich-Ascites Tumors", Arzneim. -Forsch. 18:1495 (1968)) повторил эксперименты Roe, используя асцитные клетки Ehrlich, выращенные в брюшной полости мыши. Коммерческий трагакант суспензировался в среде водной глюкозы и вводился в брюшную полость мыши за 6 и 24 ч до внутрибрюшинного введения асцитных раковых клеток. Через 17 дней только у 5 из 15 мышей, предварительно обработанных в режиме 6 ч, развивались новые раковые клетки, тогда как у 12 из 15 мышей, предварительно обработанных в режиме 24 ч, развивались новые раковые клетки. Три из тридцати мышей в обработанной трагакантом группе имели твердые опухоли стенок желудка, в дополнение к асцитным раковым клеткам в брюшной полости. Введение полисахаридов в высоких дозах до внутрибрюшинной инъекции асцитных раковых клеток, как в этой работе, не является эффективным путем ингибирования размножения клеток и, оказывается, частично ингибирует иммунную систему, способствуя метастазированию.

Таким образом. Roe (1952-1972), см. выше, и Osswald (1968), см. выше, смогли только ингибировать размножение асцитных раковых клеток, трансплантированных в брюшную область мыши, препаратами трагаканта, введенными в то же самое место. Osswald подтвердил данные Roe относительно ингибирования митоза асцитных раковых клеток, но обнаружил, что трагакант, по-видимому, увеличивает распространение раковых клеток в ткани стенок желудка у некоторых мышей. Nakahara и др. (1964), см. выше, не смог ингибировать рост твердых опухолей в паховой области мышей внутрибрюшинным введением трагаканта. Эти предыдущие исследования не позволяют предсказать или предвидеть представленных здесь антивирусных и антираковых результатов, которые основываются на иммуномодуляторном механизме действия, а не на прямом действии полисахарида на антиген раковой клетки или вируса.

До настоящего изобретения ни одна автохтонная раковая опухоль не была ингибирована препаратами трагаканта. Ингибировался только рост трансплантированных с серозной жидкостью асцитных раковых клеток, выросших в брюшной полости. Следующая противоположность по отношению к предыдущим исследованиям - очищенные полисахариды трагаканта, которые приводятся здесь, хотя и вводятся внутрибрюшинно, действуют на твердую опухоль, находящуюся вне брюшной полости. В свете предыдущих результатов не было реального основания предположить, что любые опухоли, находящиеся вне брюшной полости, ингибируются внутрибрюшинным введением полисахаридных фракций трагаканта, в том числе как химически индуцированные, так и индуцированные вирусом опухоли. В предыдущих сообщениях не было также ни одного примера, который демонстрировал бы иммуномодулирующее и антивирусное действие полисахаридов трагаканта.

Кроме того, химически индуцированные и вирус-индуцированные опухоли молочной железы и селезенки, описанные в этом изобретении, не являются трансплантированными опухолями, которые существовали бы отдельно вне организма животного-хозяина. В этих тест-системах не было раковых клеток, инициирующих опухоль, как в предыдущих сообщениях об асцитных раковых клетках. В этом отношении химически индуцированные и вирус-индуцированные твердые опухоли значительно отличались от трансплантированных с помощью серозной жидкости асцитных опухолей. Химически и вирус-индуцированные твердые опухоли также отличались одна от другой; одна избирательно образовывалась в молочной железе, а другая - в селезенке грызунов. Расширение иммуномодуляторной активности против вирусов в дальнейшем показано в этом изобретении и состоит в том, что полисахариды модулируют иммунную систему и отвечают на различные типы антигенных реакций в неспецифической форме. В этой связи Seljelid и др. ("Glycan Stimulation of Macrophages in Vitro", Exp. Cell Res. 131:121 (1981) - ["Стимулирование макрофагов гликаном in Vitro"] ) сообщали, что смола трагаканта стимулирует макрофаги мышей in Vitro. В последующем отчете утверждалось, что водонерастворимые полисахаридные фракции стимулировали макрофаги, хотя этим свойством обладают и не все нерастворимые полисахариды. Это противоречило нашему заключению о том, что водорастворимые полисахариды стимулируют макрофаги в брюшной полости, - богатом источнике этих моноядерных фагоцитов. Стимулирование макрофагов в брюшной полости является важным механизмом, приводящем к противораковой и противовирусной активности вне места введения этих растительных полисахаридов- иммуномодуляторов.

Предыдущие работы Roe (1952-1972), см. выше, Nakahara (1964), см. выше, и Osswald (1968), см. выше, проводились главным образом с водными суспензиями коммерческого трагаканта, включающего водорастворимую, нерастворимую и гель-фракции. Roe обнаружила, что ингибиторная активность трагакантов из различных регионов отличается, но не связала этот факт с внутри- и межвидовыми различиями. Отличия могут быть обусловлены обработкой или условиями произрастания. В противоположность этому здесь открыты различия в активности пяти разных видов Astragalus. Каждое из растений подвида Tragacantha вида Astragalus отличается по внешнему виду и особенностям роста. Исследование показывает, что трагакантные полисахариды из каждого вида также отличаются. Полисахариды, получаемые из трех видов Astragalus из турецких источников (Anderson & Bridgeman "The Composition of Proteinaceous Polysaccharides Exuded by Astragalus Microcephalus, A. Gummifer and A. Kurdicus - Sources of Turkish Gum Tragacanth", Phytochem, 24:2301 (1985) ["Состав полисахаридов, выделяемых Astragalus Microcephalus, A. Gunimifer: and A. Kurdicus - источники турецкого смолистого трагаканта"]), и из четырех видов Astragalus из иранских источников, но произрастающих в США (Anderson & Grant "Chemical Composition Nitrogen Containing Gum Tragacanth Exudates From Asiatic Astragalus Species Grown in Noth America, Food Hydrocolloids 3:217 (1989) ["Химический состав азотосодержащего эксудата смолы трагаканта из азиатского вида Astragalus, выращенного в Северной Америке"]), как было показано, отличались по содержанию моносахаридов, включая галактуроновую кислоту, галактозу, арабинозу, ксилозу, фукозу и рамнозу. Полисахариды также отличались в зависимости от вида по процентному содержанию азота, метоксигрупп и золы (металлы), а также по аминокислотному составу присутствующих минорных белков. Также наблюдались различия в количествах водорастворимых и нерастворимых полисахаридов. Наши исследования показали, что кислотность, вязкость растворов водорастворимых трагакантов, инфракрасные спектры и площади пиков на хроматограммах также были различны среди видов. Благодаря этим различиям в смолистых эксудатах из различных видов Astragalus не было неожиданным найти различия и в антивирусной и противоопухолевой активности среди видов. Каждое растение вида отличается по внешнему виду, химии полисахаридов и степени биологической активности от каждого другого растения внутри этого рода Astragalus. Все полные смолы называются трагакантами, и поэтому классифицируются в подвиде Tragacantha, но имеют физические, композиционные и иммуномодуляторные различия в полисахаридах внутри вида.

Антиканцерогенные агенты, которые предотвращают образование опухолей, снижают количество опухолей или размер в первоначальной ткани, предотвращают или ингибируют распространение опухоли в другие ткани, могут оказаться полезным медицинским средством. Такие агенты могут быть использованы в качестве вспомогательных средств в хирургии, лекарственной и радиационной терапии, ингибировании метастазирования. Многие вирусные заболевания должны быть чувствительны к этим полисахаридным иммуномодуляторным агентам. Трагакантные продукты могут быть также использованы в лечении пациентов с иммунодефицитной системой. Смола трагаканта используется в пищевых продуктах, таких как мороженое, соусы и приправы, много лет как общепризнанный безвредный (с официальной этикеткой GRAS) пищевой ингредиент (Informatics, Inc., "GRAS (Generally Recognized As Safe) Food Ingredients: Gum Tragacant", Report PB-221-204, publ. National Technical Information Services, July 1972) ["Общепризнанные безвредные (GRAS) пищевые ингредиенты: Смола трагаканта"]. Смола трагаканта является нетератогенной, немутагенной и обычно нетоксичной (Anderson "Evidence for the Safety of Gum Tragacanth (Asiatic Astragalus spp.) and Modern Criteria for the Evaluation of Food Additives", Food Addit. Contam. 6: 1 (1989) ("Доказательство безвредности смолы трагаканта (Asiatic Astragalus spp. ) и соответствие современным критериям оценки пищевых добавок"]). Однако Bachman и др. ("Biochemical Effects of Gum Arabic, Gum Tragacanth, Methycellulose and Carboxymethycellulose-Na in Rat Heart and Liver", Pharmacol. 17: 39 (1978) ["Биохимическое действие смолы Arabic, смолы Tragacanth, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы-Na на сердце и печень крыс"] ) обнаружили, что коммерческая смола трагаканта, введенная крысам, ингибирует окислительное фосфорилирование в митохондриях печени и сердца и нарушает функции оксидаз в печени. Предполагают, что эти негативные эффекты могут вызывать низкомолекулярные примеси в смоле трагаканта. Открытия, описанные здесь, расширяют предыдущий уровень техники новыми и безвредными растительными полисахаридами для лечения болезней и нарушений, чувствительных к иммуномодулирующим агентам.

Strobel и др. ["Immunogenecity of Foods and Food Additives - In Vivo Testing of Gum Arabic, Karaya and Tragacanth", Toxicol. Lett., 14:247 (1982) ("Иммунногенность пищи и пищевых добавок - Изучение In Vivo смолы Arabic, Karaya and Tragacanth"]) показали иммунногенность смолы трагаканта на мышах. Belkin и др. ("Swelling and Vacuolization Induced in Ascites Tumor Cells by Polysaccharides from Higher Plants", Canser Res., 19:1050 (1959) ("Опухоли и вакуолизация, вызванные в асцитных раковых клетках полисахаридами из высших растений"] ) сообщали, что семнадцать полисахаридных препаратов из высших растений вызывают специфический цитологический ответ в различных асцитных опухолевых клетах. Было найдено, что смола канта неактивна.

Это изобретение относится к очищенным полисахаридым фракциям смолы трагаканта, которые модулируют иммунную систему. Иммунная система организма хозяина стимулируется или подавляется этими фракциями для того, чтобы справиться с раковыми клетками, вирусными инфекциями или иммунологическими заболеваниями естественными способами. Описываются процессы выделения и очистки, которые дают иммуномодуляторные водорастворимые полисахаридные фракции, свободные от примесей веществ с низким молекулярным весом из неочищенной смолы, которые могут вызывать отрицательные побочные эффекты.

При введении млекопитающим очищенные фракции трагаканта предотвращают образование, размножение, рост и распространение автохтомных злокачественных опухолей. Эти опухоли могут быть вызваны карциногенами, таким как N-метил-N-нитрозомочевина (МНМ) и вирусными агентами, такими как амфотропный мышиный вирус лейкемии (MuLV-IOAl). В качестве примера такой противораковой активности здесь описывается ингибирование размножения карциномы молочной железы у крыс-самок и ингибирование роста селезеночной лимфомы у мышей водорастворимой полисахаридной фракцией трагаканта. Ингибирование летального вируса Punta toro у мышей также является примером иммуномодуляторной активности этих полисахаридов.

Трагакант состоит из полисахаридов, содержащих D-галактуроновую кислоту, D-галактозу, L-фукозу, D-ксилозу, L-арабинозу и L-рамнозу. Галактуроновая кислота обнаружена главным образом в полимерной основе и, наряду с пятью другими моносахаридами, также и в боковой цепи. Некоторые полисахариды растворимы в воде, а другие нерастворимы. Полный эксудат смолы содержит мало или совсем не содержит моносахаридов, но содержит некоторые растворимые в спирте гликозиды и другие метаболиты, определенные тонкослойной хроматографией (ТСХ) или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖК). По данным ТСХ и ВЭЖК спиртовых экстрактов установлено, что в эксудатах из пяти видов Astragalus, описанных здесь, встречаются 15-20 различных низкомолекулярных соединений. Общее количество растворимых в спирте веществ в каждом виде составляет не более 5% (таблица А). Эксудаты также содержат катионы металлов, включая калий, кальций и магний, а также небольшое количество белка. Иммуномодуляторная активность некоторых полисахаридов связана также с конформационными факторами и последовательностью моносахаридов боковой цепи. Потеря активности трагаканта в кипящей воде может быть результатом конформационных изменений или гидролиза полисахаридов боковой цепи. По этой причине все обработки трагаканта проводились при комнатной или более низкой температуре. Более низкие температуры, используемые в процессе обработки, позволяют сохранить целостность полисахаридов к химическим и конформационным изменениям и, тем самым, их иммуномодуляторную активность.

Эксудаты смолы трагаканта фракционировали на водорастворимую, водонерастворимую и спирторастворимую части. Использовались экстракция и ионообмен. Полосы трагаканта из многочисленных растений каждого вида были собраны, объединены и хранились в холодильнике, пока они не стали готовы для обработки. Образец порошка трагаканта, полученный из коммерческого источника под названием Astragalus spp.#1, был также разделен на три фракции. Общий выход в этих трех фракциях составлял 75-82% от первоначального продукта. В таблице А дается сводка выхода по фракциям для шести различных образцов трагаканта. Приведенные величины основаны на данных одного наблюдения. Понятно, что выход будет отличаться у различных видов в зависимости от условий культивирования, а также методики проведения процесса. Коммерческие полоски смолы трагаканта из образца Astragalus spp. #2 были превращены в форму различных натриевых солей.

Очищенная водорастворимая фракция была охарактеризована величинами кислотности и вязкости 1%-ного раствора, инфракрасными спектрами и анализом по азоту. Для характеризации фракций была также использована хроматография. Физические характеристики помогли дифференцировать водорастворимые полисахариды из каждого вида. Эти физические параметры, приведенные в виде единственной цифры, в действительности имеют некоторый диапазон значений, которые различаются в зависимости от условий культивирования растения и методики проведения процесса выделения (таблица В).

Для изучения водорастворимых фракций была использована ИК-спектроскопия. Все природные полисахариды содержали полосы поглощения, обусловленные наличием карбоксильной группы (COOH) при 1735 см^-1 и карбоксилат-иона (COO-) при 1610 см^-1. Последний пик маскируется слабой полосой при 1640 см^-1, соответствующей амидной группировке. Величины по ИК-спектрам в таблице В приведены как отношение интегральных площадей пиков при 1735/(1620 + 1640) см^-1. Эти отношения различны и используются при оценке относительного количества карбоксигрупп в водорастворимых фракциях. Типичный пример этой области ИК-спектра показан на фиг. 1. для AV213. Карбоксилатанион может быть превращен в свободную карбоксильную группу при обработке катионатом в H⁺-форме, таким как дауэкс, амберлит, био-рекс, аминенкс, леватит, вофатит, рексан, кастел, имак и другие. Все катионы металлов удаляются и замещаются водородом. Таким путем демаскируется амидный пик при 1640 см^-1. В случае AV213 в ИК-спектре представлено отношение COOH/CONH. ИК-спектроскопия является методом контроля за взаимопревращением карбоксилатной соли и свободного карбоксила и измерения относительных количеств этих функциональных групп в очищенных продуктах.

Используя ИК-спектроскопию для контроля продуктов, катионообменный процесс применялся для превращения всех карбоксилатных групп галактуроновой кислоты в карбоксильные группы. Это приводило к полисахаридам, которые отличались от природных продуктов в эксудатах смолы. Новый продукт может быть генерирован с помощью катионообменной методики и содержать соответствующие катионы металлов природной структуры вместо карбоксилатаниона. Экстракция спиртом удаляет все продукты метаболизма с меньшим молекулярным весом, которые находятся в эксудате смолы, а также стерилизует продукт. Мономолекулярные соединения легко контролируются с использованием хроматографии, которая позволяет отделить эти соединения от полисахаридов.

Новый продукт хорошо растворяется в воде. Он не содержит катионов металлов и низкомолекулярных соединений. Впервые разработаны практичные процессы очистки порционного типа для отделения иммуномодуляторных полисахаридов от других нежелательных компонентов в сырых эксудатах смолы. Эти процессы могут быть применены к полисахаридным видам смолы из приводимых здесь видов Astragalus, а также родственных полисахаридам из A.gossypinus, A. microcephalus, A. gummifer, A. kurdicus, A.adscendens, A.sherineh, A.elymaiticus, A. geminanus, A. globiflorus, A.myriacanthus, A.polixus, A.versus, A.senganensis, A.brachycalyx, A.creticus, A.cylleneus, A.eriostylus, A.heratensis, A. leidocladus, A.pycnocladus, A.strobiliferus, A.stromatodes и других подвидов Tragacantha видов Astragalus.

Полисахариды были изучены с помощью размерной эксклюзионной хроматографии (SEC) на сферогеле TSK 400SW с колонкой 7,5 х 300 мм. В качестве элюента был использован фосфатный буфер (pH 4,4) - ацетоннитрил (9:1), пропускаемый со скоростью 1,0 мл/мин. УФ-детектор был установлен при 210-220 мм и 0.01-0.1 AUF для 1,0%-ного раствора полисахаридов. Типичная хроматография фракции водорастворимого экстракта показана на фиг. 2. Полисахариды представлены ликами со временем элюции 5 мин. Пики с временами удерживания 11,5 и 15 мин соответствовали низкомолекулярным веществам сырого образца, которые позднее экстрагировали спиртом. На фиг. 3 все нежелательные низкомолекулярные примеси были удалены экстракцией спиртом. Таким образом, метод SEC может быть использован для контроля гомогенности полисахаридов. Этот метод позволяет также идентифицировать смеси полисахаридов из отдельных видов благодаря различию в характере полисахаридных пиков.

В предпочтительном методе раствор полоски смолы трагаканта Astragalus spp. # 2 превращали в свободную карбоксильную форму путем подкисления катионитом, как показано в примере 4. Это давало раствор с pH 2,7. ИК-спектр показал отсутствие карбоксилатного пика, что указывает на полный обмен всех катионов металлов природного продукта на водород. Для сохранения стерильности после экстракции спиртом прибавляют небольшое количество антимикробных агентов. Часть этого раствора доводили до pH 8,0-11,6 гидратом окиси натрия. ИК-спектр указывает, что при pH 8,0 нейтрализация проходит на 50%, а полная нейтрализация карбоксила COOH в карбоксилат COO происходит только при pH 11,6. Некоторые из этих солевых форм были выделены лиофилизацией с экстракцией спиртом или осаждением спиртом, давая ряд из пяти продуктов. Эти натриевые соли более растворимы в воде и более устойчивы в воде, чем природные металлические соли, которые первоначально подкислялись. Обработка спиртом используется как для стерилизации продуктов, так и для удаления нежелательных низкомолекулярных веществ, давая полисахарид-гомогенные продукты.

Введение карциногена MHM (N-метил-N-нитрозомочевина) крысам-самкам вызывает образование карциномы молочной железы. Водорастворимые очищенные полисахариды трагаканта ингибируют эту опухолевую систему в течение 18-недельного изучения, как показано в таблице С. Данные полисахариды вводились крысам внутрибрюшинно в пяти дозах за 1 день до введения MHM, а затем - через 1, 2, 4 и 8 недель после введения. За 63 дня, т.е. через 1 неделю после последней инъекции полисахарида эффект AV208 (А. brachycetntrus) и AV212 (A. echidnaeformis) на распространение опухоли в животном составлял в сумме соответственно 4 и 3 общих опухоли по сравнению с 18 в контроле. За 126 дней наблюдалось заметное снижение общего числа опухолей для каждого продукта. Наиболее активным продуктом был AV208, в опытах с которым 14 выживших крыс имели в целом 26 опухолей, или 1,73 на одну крысу. 14 выживших контрольных крыс имели в целом 61 опухоль, или 4,07 на одну крысу.

Множественность опухолей действительно ингибировалась в различной степени при обработке водорастворимыми очищенными полисахаридами трагаканта. Когда недельные данные были нанесены на график за все 18 недель, то диаграммы показали, что продолжительная обработка полисахаридами свыше 18 недель может иметь поддерживающий подавляющий эффект на распространение опухоли. Сходство в результатах AV212 (A. echidnaeformis) и AV210 (A. echidnaeformis "elongata") за 126 дней коррелируется с таксонометрическим и хемотаксонометрическим подобием этих видов. Увеличение веса тела не было отмечено в каких-либо опытных группах.

Амфотропный мышиный вирус лейкемии (McLV-10Al) был выделен из диких мышей, пойманных в некоторых областях Южной Калифорнии. Этот ретровирус вызывает селезеночную лимфому у 93% и более грызунов, инфицированных этим вирусом в лабораторных условиях, включая мышей линии NIH Swiss. Опухоль развивалась в форме увеличения селезенки и становилась заметной через 1-2 месяца. В наших опытах мыши линии NIH Swiss были инфицированы этим ретровирусом через два дня после рождения. Мышам вводили полисахариды внутрибрюшинно в первый день, а затем 10 инъекций через день в течение 21 дня. Вводились пять водорастворимых полисахаридов, а также растворитель (PBS) и кукурузный крахмал в качестве плацебо. Результаты таблицы D показывают, что через 120 дней средний вес селезенки после введения контроля PBS и плацебо был 147 мг и 169 мг соответственно. У нормальных мышей линии NIH Swiss за это время вес селезенки составил около 88 мг. Следовательно, вирус-индуцированная селезеночная лимфома была инициирована в контроле PBS, а кукурузный крахмал не обладал ингибиторным эффектом. В группах, получавших водорастворимые полисахариды, средний вес селезенки был в пределах от 105 мг для AV209 (A. parrowianus) до 123 мг для AV210 (A. echidnaeformis "elongata"). Осредненный вес селезенки всех 23 мышей, которым вводили трагакант, был 116 мг, что составило около 50% ингибирования. AV208 (A. brachycetntrus) также изменял вес селезенки до 109 мг. Эти результаты показывают, что продукты из трагаканта обладают ингибиторным эффектом по отношению к MuLV-10Al, вызываемой селезеночной лимфомой.

Смола трагаканта содержит водорастворимые и нерастворимые в воде полисахариды, белок, ионы некоторых металлов и другие низкомолекулярные растворимые в спирте соединения. Полученные здесь результаты подтверждают, что водорастворимая фракция трагаканта вызывает ингибирование опухолей. Противораковое действие водорастворимых полисахаридов из отдельных видов Astragalus отличается, так же как и их физические характеристики. Полисахаридные фракции из различных видов различаются по их противораковой активности в зависимости от типа опухоли и метода введения. Представленные здесь данные указывают, что существуют структурные различия между полисахаридами этих видов Astragalus, которые дают возможность различать их и по противораковым свойствам. Впервые было обнаружено, что различие в иммуномодулирующей активности полисахаридов трагаканта соответствует отличиям в физических характеристиках продуктов из различных видов растений Astragalus подвида Tragacantha. В предыдущих экспериментах использовалась коммерческая смола трагаканта. Эта коммерческая смола представляла собой эксудаты из неидентифицированных растений Astragalus, дающих продукт в виде ленты или порошка. Данное изобретение содержит описание различий в противораковой активности среди различных видов отдельных эксудатов смолы трагаканта.

Три из полисахаридных продуктов трагаканта, AV208, AV212 и AV211, были испытаны на активность против летального вируса мышей Punta toro. Уровень единичных внутрибрюшинных доз для этих трех продуктов составлял 12,5-200 мг/кг. Было обнаружено, что продукты были активны при введении за 24 ч и через 4 и 24 ч после инфицирования вирусом; при введении после инфицирования были эффективны более низкие дозы. Продолжительность эксперимента составляла 21 день, см. таблицы E и F.

Данные этих таблиц показывают, что AV208 позволяет добиться 100% коэффициента выживаемости среди 10 мышей после единичной пост-24-часовой дозы 6.25 мг/кг. При 1,56 мг/кг выжили 9/10 мышей. AV208 более активен при более низких дозах в 1-6 мг/кг, чем при дозах 100-200 мг/кг. Для указанных трех продуктов не было выявлено никакой заметной токсичности в дозах до 200 мг/кг, и все они были более активны, чем рибавирин, известный антивирусный препарат. Средние значения титра печени и титра вирусной сыворотки для мышей, обработанных рибавирином в количестве 350 мг/кг, были 1,6 и 4,3 соответственно при сравнении с мышами, обработанными AV208 в дозе 6,25 мг/кг, - 0,3 и 0,4. Более того, AV208 оказывает небольшое влияние на ферменты печени - сыворотку глютамат-оксалаттрансаминазы (SGOT) по сравнению с рибавирином, который ингибирует эти ферменты. AV212 имеет антивирусную активность, сравнимую с AV208. Эти трагакантные полисахаридные продукты стимулируют иммунную систему в низких дозах, тогда как в высоких дозах, очевидно, подавляют.

Для обработки лимфомы селезенки, индуцированной двумя различными ретровирусами, были использованы пониженные дозы. Мыши были инокулированы ретровирусом лейкемии Rauscher (RZV) и обработаны очищенным полисахаридом AV205 (таблица D, пример 9). AV205, полученный из ленты коммерческой смолы трагаканта, вводился мышам ежедневно по 3,10 и 30 мг/кг внутрибрюшинно в течение 14 дней. Селезенка взвешивалась, и определялся титр вируса в смешанной сыворотке. Ингибирование спленомегалии было значимым при 10 и 30 мг/кг, но ингибирование размножения вирусов не было существенным при этом уровне доз. Это говорит об отдельном воздействии на лимфому и на вирус.

Многократно меньшие дозы были использованы для обработки быстрорастущей лимфомы селезенки, индуцированной ретровирусом Friend (FV). Мыши были инокулированы FV, затем были обработаны внутрибрюшинно пятью дозами AV219 3, 10 и 30 мг/кг в течение 17 дней, см. таблицу H, пример 10. AV219 - очищенный полисахарид трагаканта, полученный из Astragalus echidnaeformis, вводился каждые четыре дня за 4 ч до инфицирования FV. Через 17 дней селезенка удалялась и взвешивалась. Были измерены титры вируса в селезенке и плазме. При дозе 3 мг/кг происходило некоторое ингибирование спленомегалии, но не наблюдалось никакого ингибирования при более высоких дозах, что, возможно, связано с подавлением иммунной системы при дозах 10 и 30 мг/кг. При 3 мг/кг FV-титр селезенки составлял 48% по сравнению с титром FV в плазме - 47%. Ретровирус Friend оказался более чувствительным к ингибированию, чем ретровирус Rauscher, и при более низких дозах. Ингибирование спленомегалии, как оказалось, зависит от уровня дозы и частоты введения. Различия в трагакантных полисахаридах из двух видов Astragalus также объясняют некоторые различия в их активности.

Это первый случай, когда вирусы и автохтомные опухоли ингибировались трагакантными полисахаридами. Впервые опухоль молочной железы и селезенки ингибировалась трагакантом; обе опухоли находились вне места введения полисахарида. Это первый случай того, что химически- и вирус-индуцированные опухоли были ингибированы трагакантными полисахаридами. Результаты, сообщенные здесь, показывают, что впервые водорастворимые полисахариды трагаканта, не содержащие нерастворимых веществ и низкомолекулярных примесей, могут быть использованы как ингибиторы роста раковых клеток и размножения вирусов, находящихся вне брюшной полости, куда были введены полисахариды. До сих пор только трансплантированные суспендированные асцитные клетки, культивированные в брюшной полости, могли быть ингибированы смолой трагаканта, также введенной в брюшную полость. Эти результаты новые, уникальные и полезные для лечения раковых, вирусных и других заболеваний, где присутствует иммунодефицит.

Пример 1.

Очистка полисахаридной фракции из A. parrowlanus
Полоски трагаканта A. parrowianus, 11,53 г, перемешивали в 200 мл метанола в течение нескольких часов. Полоски собирали и сушили на воздухе и получили 11,00 г. Высушенные полоски суспендировали в 1100 мл дистиллированной воды и перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды в закрытой трехлитровой круглодонной колбе. Образующуюся непрозрачную суспензию центрифугировали при 2400 об/мин не менее 60 мин. Супернатант водорастворимых полисахаридов декантировали от геля и более тяжелых частиц. Менее растворимый гель и фракция частиц хорошо перемешивали с дополнительным количеством дистиллированной воды и снова центрифугировали. Супернатант декантировали от нерастворимых частиц и соединили с первым водорастворимым экстрактом.

Водорастворимая фракция была лиофилизована, образуя белый хлопкоподобный продукт. Он был растерт в 400 мл метанола для удаления растворимых в спирте примесей и, кроме того, для стерилизации продукта. В этих лиофилизованных продуктах всегда было небольшое количество остаточной воды, которое было также экстрагировано метанолом, давая необходимый безводный полисахарид. Фильтрация и сушка на воздухе давали в результате 4,4 г (38,7%) белого, волокнистого, скрученного водорастворимого продукта. Внешний вид всех других водорастворимых продуктов был подобен данному продукту. Фракция менее растворимого геля и частиц была обработана этанолом для полного осаждения фракции, названной водонерастворимой. Суспензию центрифугировали и этанольный супернатант декантировали. Водонерастворимые частицы сушили на воздухе, измельчали в белый порошок, 4,28 г (37,1%). Спиртовые экстракты и промывки были объединены, упарены досуха в вакууме на роторном испарителе. В случае A. parrowianus было выделено только 0,12 г вещества, растворимого в спирте.

Были приготовлены 1%-ные растворы каждой водорастворимой фракции полисахаридов, AV208-AV213, из пяти видов коммерческого продукта. Кислотность этих растворов была измерена pH-метром. Вязкость тех же самых 1%-ных растворов была измерена вискозиметром Brookfield при температуре 21^oС. Инфракрасные спектры водорастворимых фракций были сняты на спектрометре Rye Unicam SP3-200, снабженном электронным процессором. Образцы были приготовлены в виде пленки путем упаривания 1%-ного раствора на пластинке бромистого серебра под тепловой лампой. Каждый продукт давал два пика поглощения карбонила, один при 1735 см^-1, соответствующий свободной карбоксильной группе (COOH) и второй пик - при 1610 см^-1, соответствующий главным образом (COO-), плюс скрытый пик 1640 см^-1, возможно, соответствующий амидной группе (CONH). Площади под пиками были интегрированы и были вычислены соотношения. Анализ на азот указывал на содержание белков в полисахаридах. Подсчет белка, полученный из многочисленных анализов на азот, был 6,3. В таблице В приведены эти физические характеристики.

Пример 2
Очистка полисахаридной фракции из A. brachycetntrus
7,75 г полоски A. brachycetntrus tragacanth было суспендировано в 800 мл дистиллированной воды в трехлитровой колбе, снабженной мешалкой. После 12 ч перемешивания при комнатной температуре суспензия центрифугировалась 60 мин. при 2400 об/мин. Супернатантный раствор водорастворимых полисахаридов декантировался с геля и нерастворимых частиц. Менее растворимые частицы растирали с 200 мл дистиллированной воды и снова центрифугировали. Супернатантные водные экстракты объединялись и высушивались лиофильно при -54^oC 20-40 мин. Белый хлопкоподобный продукт растирали с метанолом для экстракции растворимых в спирте продуктов. Продукт собирали на стеклянном фильтре и высушивали в течение ночи в вакуумном эксикаторе. Сухой водорастворимый продукт весил 4,2 г (54,2%). Гель и нерастворимые частицы были растерты с этанолом с получением осадка нерастворимой фракции. Общее количество нерастворимых веществ было собрано на фильтре, промыто этанолом, высушено на воздухе с получением белого порошка весом 1,9 г (24,5%). Объединенные спиртовые экстракты, упаренные досуха на роторном испарителе в вакууме, весили 0,26 г (3,4%).

Пример 3.

Очистка полисахаридной фракции из Astragalus spp.#1
10 г коммерческого порошка трагаканта, названного Astragalus spp. #l, суспендировали в 800 мл дистиллированной воды, содержащей 20 капель зефирана и 0,13%-ный раствор бензалкония хлорида в качестве антимикробного агента. Закрытая система перемешивалась с умеренной скоростью до диспергирования и растворения порошка, на что потребовалось несколько часов. Когда весь порошок был диспергирован или растворен, была добавлена ионообменная смола DOWEX 50W X 8 в водородной форме, и смесь хорошо перемешивалась. До и после обработки катионообменной смолой были сняты инфракрасные спектры. После обработки пик при 1610 см^-1, характерный для карбоксилата, превратился в карбоксил при 1735 см^-1, и амидный пик при 1640 см^-1 был размаскирован. Перед обработкой соотношение пиков 1735/1610 в ИК-спектрах было 0,80. После обработки это соотношение стало 1,96. Обработка дополнительным количеством смолы DOWEX 50W X 8 как в смеси, так и на колонке не влияла больше на карбоксильный и амидный пики, фиг. 1.

Смесь была центрифугирована при 2600 об/мин в течение часа с разделением компонентов на три фазы: верхняя - относительно прозрачная фаза, средняя - гель и нижняя - смола. Верхнюю водорастворимую фракцию осторожно декантировали с геля и смолы. Нижние фазы снова экстрагировали 200 мл дистиллированной воды и снова центрифугировали. Водный слой объединяли с первоначально полученной водорастворимой фракцией. После лиофилизации водорастворимой фракции при -54^oC и 10-20 мин. получена белая хлопкообразная масса. Эту массу суспендировали в 300 мл метилового спирта, перемешивали в течение ночи для экстракции растворимых в спирте веществ. Кривые SEC, снятые до и после экстракции метиловым спиртом, показывают, что эта операция полностью удаляет вещества, растворимые в спирте, которые появляются как пик при элюции в области 11,5 мин (фиг.2 и 3). Водорастворимая фракция, полученная таким образом, представляющая собой белую хлопкоподобную волокнистую массу, собиралась на стеклянном фильтре и высушивалась в вакуумном эксикаторе, выход 6,36 г (63,6%). Нерастворимая гель-фракция лиофилизировалась и растворимая в спирте фракция была получена как описано в предыдущем примере. Растворимая в спирте фракция содержала низкомолекулярные соединения с более сильным поглощением при 210-222 нм, чем полисахариды.

Пример 4
Полисахаридные кислотные и солевые формы из Astragalus spp.#2
33 г коммерческой ленты (полоски) Astragalus spp. #2 были обработаны 300 мл метанола в течение нескольких часов при перемешивании. Продукт был собран и высушен на воздухе с защитой от микробного загрязнения. Полученные 32 г стерильно экстрагированной полоски были суспендированы в 3000 мл дистиллированной воды, содержащей 32 мг бензалкония хлорида (Зефирана). После 4 ч перемешивания полоска растворялась, давая сильно вязкий раствор с pH 4,7. К раствору при постоянном перемешивании было добавлено 60 r катионообменной смолы DOWEX 50W X 8. Через 20 мин кислотность была доведена до pH 2,7. Как показывают инфракрасные спектры, все карбоксилатное поглощение при 1610см^-1 было превращено в карбоксильное при 1735 см^-1 с небольшим количеством карбоксамида при 1640 см^-1. Смесь центрифугировалась в течение часа при 2600 об/мин, с отделением ионообменной смолы и небольшого количества нерастворимых веществ и геля от чистого бесцветного супернатанта. Из этого супернатантного раствора было приготовлено несколько продуктов с различным содержанием кислоты и натриевой соли.

Лиофилизированный продукт pH 2,7
Порция супернатантного раствора была лиофилизирована, затем экстрагирована метанолом в течение 6 ч с хорошим перемешиванием и получением белого волокнистого вещества карбоксильной кислоты полисахаридного продукта, pH 2,7. После высушивания в вакуум-эксикаторе выход 1,54 г.

Лиофилизированный продукт pH 8
Оставшийся супернатантный раствор был доведен до pH 8.0 путем постепенного прибавления 1N раствора гидроокиси натрия при хорошем перемешивании, используя pH-метр для определения кислотности. Из-за высокой вязкости раствора при прибавлении щелочи pH устанавливается медленно. Большая порция раствора высушивалась лиофильно, экстрагировалась метанолом, как описано выше, для удаления растворимых в спирте веществ и сохранения стерильности. Полученный белый волокнистый полисахаридный продукт, pH 8, высушивался в вакуум-эксикаторе, выход 18,1г. Инфракрасный спектр указывал, что этот продукт содержит 40% формы карбоксильной кислоты и 60% в форме карбоксилата натрия.

Осажденный продукт pH 8
Порция раствора при pH 8 была добавлена при хорошем перемешивании к трем объемам изопропилового спирта в течение часа. Нитеобразная масса продукта собиралась вокруг лопастей мешалки. Белый хлопкообразный продукт был собран на нецеллюлозный фильтровальный диск. После промывки метанолом и высушивания продукт весил 4,30 г. Следовые количества низкомолекулярных примесей были удалены путем экстракции массы в течение нескольких часов этанолом при перемешивании. Полученный продукт являлся гомогенным полисахаридом (по данным SEC) и весил 4,26 г. Время элюции для полисахарида было 4,6 мин с плечом у пика при 5 мин, и не было никаких пиков низкомолекулярных соединений при времени элюции 11-12 мин.

Осажденный продукт при pH 9,0
Порция раствора с pH 8 была доведена до pH 9 осторожным постепенным прибавлением 1N гидроокиси натрия. Продукт был осажден путем медленного прибавления раствора к трем объемам этанола при хорошем перемешивании. Нитеобразный белый продукт был собран на нецеллюлозный фильтровальный диск, хорошо промыт этанолом и высушен, выход 4,33 г. Инфракрасный спектр указывает только на небольшое увеличение натриевой соли в сравнении с продуктом при pH 8.

Осажденный продукт при pH 11,6
Оставшийся раствор при pH 8 был обработан 1N гидроокисью натрия, и инфракрасные спектры были использованы для контроля превращения карбоксильной группы в нейтрализованную форму натрий карбоксилата. Это превращение было на 80% при pH 10,7 и 95% при pH 11,4. При pH 11,6 карбоксильная группа полностью превращалась в форму ее натриевой соли. Продукт был осажден путем прибавления этанола и было получено 2,10 г сухих белых волокон, похожих по виду на все другие описанные здесь полисахаридные продукты производные трагаканта.

Пример 5
Низкомолекулярные полисахаридные примеси
Растворимые в спирте экстракты пяти идентифицированных видов были изучены с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) на силикагелевых G-пластинках, и жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) - на колонках с силикагелем 5 мкм. С помощью TLC, используя различные методы определения, включая опрыскивание 10%-ной серной кислотой с последующим нагреванием, было найдено, что каждый экстракт содержал не менее четырех различных низкомолекулярных соединений. Было определено с помощью TLC по крайней мере семь различных соединений в пяти спиртовых экстрактах плюс первоначальный материал. HPLC с ультрафиолетовым определением указывает на присутствие по крайней мере шести поглощающих в УФ соединений, ни одно из которых не соответствует другим пяти или более соединениям, определенным с помощью показателя преломления. Эти хроматографические исследования указывают на присутствие в эксудате смолы трагаканта, возможно, пятнадцати или более различных низкомолекулярных соединений, ни одно из которых не является редуцирующим моносахаридом. Эти примеси составляют свыше 5% полного эксудата смолы и могут считаться причиной негативного побочного действия, наблюдаемого у цельной смолы.

Пример 6
Ингибирование химически индуцированной опухоли крыс
Карциноген N-метил-нитрозомочевины (МНМ) был введен самкам крыс Sprague-Dawley в возрасте 50-ти дней однократно (50 мг/кг) внутривенно в подкисленном физиологическом растворе. Эти крысы были разделены на контрольные группы по 15 животных в каждой. Одна контрольная группа получала МНМ в физиологическом растворе, вторая контрольная группа - только физиологический раствор. За 24 ч до введения МНМ опытным животным вводили внутрибрюшинно 1%-ный раствор водорастворимого полисахарида в физиологическом растворе в дозе 100 мг/кг. Полисахариды в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно вводились повторно через 1, 2, 4 и 8 недель. Крысы взвешивались и контролировались путем пальпации еженедельно, затем на 126 день опыт завершают CO₂ асфиксией. У контрольных животных, получавших только физиологический раствор, опухоль не наблюдалась. Результаты даны в табл. С.

Пример 7
Ингибирование медленно растущей селезеночной лимфомы у мышей
Новорожденным мышам линии NIH Swiss вводили внутрибрюшинно в объеме 0,02 мл дикий мышиный ретровирус (MULV-10Al) с активностью 1000000 образующих опухоль единиц через 2 дня после рождения. Водорастворимые полисахариды, включая кукурузный крахмал (плацебо), растворяли в фосфатном буферном физиологическом растворе (ФБФР) в 0,5% концентрации. Полисахаридные растворы вводили внутрибрюшинно в 1, 3, 5, 7 и 9 день no 0,02 мл; на 11, 13 и 15 день по 0,05 мл и на 17, 19 и 21 день по 0,08 мл. Контрольные группы получали ФБФР после первоначального введения вируса MULV. Все животные содержались на обычной лабораторной диете. Каждую группу животных содержали с их матерью до 28 дня, после чего они были разделены по полу. На 120 день животных забивали, селезенку извлекали и взвешивали. Увеличение веса селезенки непосредственно связано с ростом опухоли. Средний вес селезенки в опытных группах мышей был ниже, чем в контрольных, получавших ФБФР и крахмал (плацебо). Результаты даны в табл. D.

Пример 8
Лечение вирусной инфекции у мышей
Мышам C56BL16 в возрасте 3 недель вводили подкожно летальный вирус Адамса (штамм Punta toro). Через 24 ч мышам делали внутрибрюшинные инъекции полисахаридов в стерильном физиологическом растворе в дозах 0,78 - 200 мг/кг. В каждой дозе 10 мышей были инфицированы и получали полисахариды, а 5 мышей получали только полисахарид для контроля токсичности. Дополнительные контроли включают в себя инфицированных мышей, получавших рибавирин (350 мг/кг) или только физиологический раствор, а также нормальных животных. Продолжительность эксперимента составила 21 день. Протиопуховолевую активность оценивали по среднему времени выживания (СВВ), изменению цвета печени, вирусному титру в плазме и печени, уровню ферментов SGOT и SGPT в печени и изменению веса в контроле токсичности мышей через 18 ч после обработки. Результаты представлены в табл. E для высоких доз AV208, AV212 и AV213 и в табл F для низких доз AV208. Для AV208 значительная активность была проявлена в дозах от 1,56 до 50 мг/кг.

Пример 9
Ингибирование селезеночной лимфомы, индуцированной ретровирусом лейкемии Раушера у мышей
Мышам Balb/c в возрасте 3-4 недель вводили внутрибрюшинно стандартную дозу селезеночного гомогената ретровируса лейкемии Раушера. AV205 полисахарид вводили внутрибрюшинно в дозах 3, 10 и 30 мг/кг 3 группам по 10 животных в каждой с 1 по 13 день. AV205 был очищен в форме частичной натриевой соли из коммерческой смолы трагаканта. Введение полисахарида проводилось ежедневно в течение 14 дней в трех дозах. После этого извлекали селезенку из опытной группы мышей и взвешивали. Для определения вирусного титра объединяли сыворотку крови каждой группы. Селезеночная лимфома значительно ингибировалась в дозах 10 и 30 мг/кг, но максимальное ингибирование вируса составило только 9 и 7% соответственно. Результаты даны в табл.G.

Пример 10
Влияние на быстрорастущую селезеночную лимфому, вызванную ретровирусом Friend у мышей
Самкам мышей (В10. А x A/WySn) F массой 22 - 24 г инокулировали внутрибрюшинно стандартную дозу ретровируса Friend. Препарат полисахарида AV219 получали в форме частичной натриевой соли из смолы трагаканта из Astragalus echidnaeformis. AV219 в стерильном физиологическом растворе вводили внутрибрюшинно в дозах 3, 10 и 30 мг/кг в день за 4 ч до инокуляции ретровируса и на 4, 8, 12 и 16 дни после инокуляции в трех группах по 7 мышей в каждой. Через 17 дней животных забивали, извлекали селезенку и кровь. Измеряли вес и титр вируса. В качестве контроля использовали группу из 7 неинфицированных и нелеченных животных. Для контроля токсичности служили 17 инфицированных мышей, которым вводили физиологический раствор (плацебо). Результаты даны в табл. Н.

Изобретение относится к области медицины, а именно получению и использованию очищенных фракций полисахаридного эксудата определенных видов растений Astraqalus для лечения иммунозависимых болезней. Способ выделения, очистки и модификации полисахаридной фракции смолы трагакант из растений вида Astraqalus включает удаление природных катионов из водорастворимой фракции с помощью ионообменной смолы, выделение полисахаридного продукта упариванием или осаждением низшим спиртом и экстракцию полисахаридного продукта низшим спиртом, выбранным из группы: метанол, этанол и изопропанол для стерилизации продукта и для удаления оставшихся низкомолекулярных примесей. Описана также композиция на основе полисахаридной фракции смолы, способ ингибирования роста раковой опухоли с помощью композиции и способ ингибирования вирусных инфекций. Изобретение расширяет арсенал средств для борьбы с раковыми заболеваниями и вирусными инфекциями. 4 с. и 14 з. ф-лы, 8 табл., 3 ил.

1. Способ выделения полисахаридной фракции от необработанного эксудата трагаканта смолы растения рода Astragalus, включающий водную экстракцию смолы с отделением растворимых веществ от нерастворимых, отличающийся тем, что из водорастворимой фракции удаляют природные катионы с помощью ионообменной смолы, доводят рН в интервале 1,5 - 12,0 основанием щелочного металла, полисахаридный продукт восстанавливают путем лиофилизации, или упаривания на роторном вакуумном испарителе, или осаждения низшим спиртом, выбранным из группы: метанол, этанол, пропанол или изопропанол, и экстрагируют твердую полисахаридную фракцию низшим спиртом для окончательного удаления любых остаточных молекул и для стерилизации очищенного трагакантина. 2. Композиция на основе полисахаридной фракции необработанного эксудата трагаканта смолы, отличающаяся тем, что композиция содержит твердую полисахаридную фракцию - трагакантины, полученную по п.1, содержащую моносахаридные структурные субъединицы D-галактуроновой кислоты, D-галактозы, D-ксилозы, D-глюкозы, L-фруктозы, L-арабинозы, L-рамнозы в пропорции для каждого моносахарида в пределах до 60% от общего количества моносахаридов, содержит максимум 0,5% по весу неполимерных органических соединений с молекулярным весом ниже 200 дальтонов, максимум 10% ковалентно связанного белка, имеет вязкость от 40 до 10000 сПз для 1%-ного раствора, растворима в воде, водный раствор содержит свободные карбоксильные группы и карбоксилаты (соли) в структурной субъединице галактуроновой кислоты в пропорации, согласующейся с рН водного раствора, проявляет in vivo способность ингибировать аутохромные опухоли, находящиеся вне брюшной полости, при введении полисахаридного продукта в брюшную полость и проявляет in vivo способность ингибировать вирусные инфекции при введении полисахаридного продукта в брюшную полость. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из Astragalus parrowianus. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из Astragalus brachycetntnrus. 5. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из Astragalus cerasocrenus. 6. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из Astragalus echidnaeformis. 7. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из Astragalus echidnaeformis "elongata". 8. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что полисахаридная фракция получена из коммерческой смолы трагаканта. 9. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что очищенная полисахаридная фракция получена из вида Astragalus, выбранного из группы, содержащей A.gossypinus, A.microcephalus, A.gummifer, A.kurdicus, A.adscendtns, A.sherineh, A. elymaiticus, A. geminanus, A.globiflorus, A.myriacanthus, A.polixus, A. eriostylus, A. heratenis, A.leiocladus, A.pycnocladus, A.verus, A.segnanensis, A. brachycalyx, A.creticus, A.cylleneus, A.strobiliferus и A.stromatodes. 10. Способ ингибирования роста раковой опухоли млекопитающих, включающий в себя введение млекопитающим, пораженным опухолью, полисахаридной композиции, отличающийся тем, что осуществляют введение млекопитающим, пораженным опухолью, полисахаридной композиции по п.2 в дозе от 0,01 до 100 мг/кг. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что раковые клетки индуцируют химически. 12. Способ по п.10, отличающийся тем, что обрабатывают раковые клетки, находящиеся в молочной железе. 13. Способ по п.10, отличающийся тем, что раковые клетки индуцируют вирусов. 14. Способ по п.10, отличающийся тем, что обрабатывают раковые клетки, находящиеся в селезенке. 15. Способ по п.10, отличающийся тем, что при лечении брюшная полость не содержит аутохромных раковин клеток. 16. Способ ингибирования вирусных инфекций млекопитающих, включающий в себя введение инфицированным млекопитающим полисахаридной композиции, отличающийся тем, что осуществляют введение инфицированным млекопитающим композиции по п.2, в дозе от 0,01 до 100 мг/кг. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что осуществляют лечение ретровирусной инфекции. 18. Способ по п.16, отличающийся тем, что при лечении брюшная полость не содержит вирусной инфекции.