СОСТАВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННЫХ ИНЪЕКЦИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНИТЕТА Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 A61P37/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биомедицины, и, в частности, оно относится к составу для внутривенных инъекций, предназначенному для повышения иммунитета.

Уровень техники

Иммунная система организма состоит из органов иммунной системы (например, селезенки, тимуса, лимфатических узлов и т.п.), иммунных клеток (например, мононуклеарных фагоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и т.п.), а также из иммунологически активных веществ (например, антител, системы комплемента, интерлейкинов и т.п.). Иммунная система представляет собой важную систему защиты организма и непосредственно связана с устойчивостью организма к заболеваниям. За счет иммунной системы организм может уничтожать вирусы, бактерии, грибы, паразиты, раковые клетки и т.п. с целью предупреждения возникновения заболеваний. Иммунная система может уничтожать патогены в основном за счет неспецифического иммунитета и специфического иммунитета. Под неспецифическим иммунитетом подразумевается естественная устойчивость к патогенам, характеризующаяся неспецифической направленностью, при этом патогены устраняются за счет барьерной функции кожи и слизистых оболочек, фильтрующей функции лимфатических тканей, фагоцитоза системой мононуклеарных фагоцитов, а также цитолитической функции лизоцимов и т.п. Под специфическим иммунитетом подразумевается целенаправленное воздействие лимфоцитов на некоторые специфические антигены, при котором продуцируются соответствующие антитела или возникает местная клеточная реакция с уничтожением специфических патогенов: например, T-клетки после контакта с патогенами превращаются в сенсибилизированные лимфоциты и могут непосредственно атаковать патогены, обладающие специфической антигенностью, обеспечивая клеточный иммунитет; B-лимфоциты после контакта с патогенами могут превратиться в секреторные плазматические клетки, секретирующие антитела, при этом антитела могут проявлять иммунную реакцию, которая в отношении патогенов представляет собой реакцию нейтрализации, реакцию преципитации, агглютинации или лизис, за счет чего уничтожаются патогены и обеспечивается гуморальный иммунитет.

Когда иммунитет организма снижается, то снижаются и защитные функции организма, из-за чего легко происходит инфицирование патогенными микроорганизмами или паразитами, а также возникает рак и т.п. Существует много факторов, которые могут вызывать снижение иммунитета организма; причем снижение иммунитета может возникать тогда, когда в отношении организма имеют место стрессовые реакции, длительное утомление, большие нагрузки на работе или он получает ионизирующее излучение от радиоактивных веществ и т.п.; иммунитет организма могут подавлять некоторые лекарственные средства, например, дексаметазон, циклофосфан, циклоспорин, хлоромицетин, сульфамидные средства и т.п.; подавлять иммунитет также могут некоторые токсины, например афлатоксин, охратоксин и т.п. Кроме того, иммуносупрессию в организме может вызывать очень много отдельных заболеваний, например, в практике лечения людей в условиях стационара, синдром приобретенного иммунодефицита, злокачественные опухоли, лепроматозная лепра, третичный сифилис, поздняя стадия туберкулеза, стронгилоидоз и т.п.; из практики лечения в ветеринарных клиниках также известно очень много вызывающих иммуносупрессию заболеваний, например инфекционная анемия лошадей, лейкоз крупного рогатого скота, эпизоотии среди мелкого рогатого скота, репродуктивно-респираторный синдром свиней, заболевания, вызываемые цирковирусом свиней, гиперплазия ретикулоэндотелиальной системы у птиц, нейролимфоматоз кур, чума собак, заболевания, вызываемые собачьим парвовирусом, и т.п.

К лекарственным средствам, которые в настоящее время применяют для повышения иммунитета у организма, в основном относятся: полисахариды, например, полисахарид из астрагала хуанчи, полисахарид из шиитаке, полисахарид из траметеса разноцветного, полисахарид из женьшеня, полисахарид из тремеллы фукусовидной, полисахарид из трутовика зонтичного и т.п.; цитокины, например, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, рекомбинантный интерлейкин-2, тимулин, трансфер-фактор, колониестимулирующий фактор, полипептиды из селезенки и т.п.; антитела, например, антитела куриного желтка, антитела сыворотки крови, моноклональные антитела, гамма-иммуноглобулины и т.п.; лекарства из китайской медицины, например, лечебный порошок из нефрита, изгоняющий патогенный ветер, кордицепс китайский, прополис и т.п.; витамины, например витамин C, фолиевая кислота, витамин B₁₂, витамин A и т.п.; микроэлементы, например глюконат цинка, селенит натрия, декстран железа и т.п.; фармацевтические лекарственные средства, например левамизол, изопринозин, пидотимод и т.п.

Кроме вышеуказанных иммуномодулирующих лекарственных средств, разрабатывают все больше и больше лекарственных средств, в которых микроорганизмы и их составные компоненты или метаболиты используются в качестве иммуномодулирующих средств, но многие из них представляют собой препараты, которые изготовлены из патогенных бактерий или не являющихся полезными бактерий, которые ослаблены или инактивированы, или их составных компонентов, или их метаболитов. Например, противотуберкулезная вакцина Кальметта и Герена, представляющая собой вакцину БЦЖ, обладает иммуностимулирующим действием и за счет перорального, подкожного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введений может применяться в дополнительной терапии для профилактики туберкулеза и опухолей. Препараты на основе бактерий Propionibacterium acnes представляют собой суспензии на основе убитых бактерий Propionibacterium acnes и они могут повышать неспецифический иммунитет организма, а также применяться в дополнительной терапии некоторых опухолей путем подкожного, внутримышечного, внутриопухолевого или внутривенного капельного введений и т.п. Препараты на основе стрептококков группы A представляют собой лиофилизированные бактериальные препараты на основе мутантного штамма Su гемолитических стрептококков группы A с низкой токсичностью типа III, при этом они также содержат калиевую соль пенициллина G и т.п., непосредственно уничтожают опухолевые клетки и активируют иммунитет хозяина, а также могут применяться в дополнительной терапии рака путем подкожного, внутримышечного, внутриопухолевого или внутривенного введений. Препараты на основе синегнойной палочки, продукты, полученные после инактивации фимбрий синегнойной палочки, могут модулировать иммунитет организма и вводиться подкожно или в часть опухоли с целью проведения дополнительной терапии. Препараты на основе Mycobacterium graminis, основным составляющим компонентом которых является инактивированная Mycobacterium graminis, применяются для лечения таких снижающих иммунитет заболеваний, как хронический бронхит, опухоли, гепатит, диабет, легочный и внелегочный туберкулез и т.п., путем глубокого внутримышечного введения. Кроме того, в качестве иммуномодулирующих средств дополнительно применяются цельные бактериальные клетки бактерий рода Rhodococcus, бактерий рода Gordonia, бактерий рода Nocardia, бактерий рода Dietzia, бактерий рода Tsukamurella и бактерий рода Nocardioides (публикация патента под номером CN1735431A). Лекарственные средства, получаемые с использованием полученных за счет дополнительной обработки составляющих компонентов некоторых патогенных бактерий и применяемые для иммуномодуляции, содержат предназначенные для введения каркасы клеточной стенки Nocardia rubra, которые получают путем ферментации и разрушения Nocardia rubra с последующим извлечением каркаса клеточной стенки (N-CWS) и последующим добавлением соответствующего количества эмульгатора, подвергают лиофилизации, при этом основными составляющими компонентами бактериальной клеточной стенки являются миколовые кислоты, арабиногалактаны, мукопептиды и т.п., которые можно использовать в дополнительной терапии рака. Препараты на основе полисахаридов и нуклеиновых кислот из БЦЖ получают из полисахаридов и нуклеиновых кислот, выделенных из БЦЖ, и при внутримышечном введении они могут предупреждать и лечить хронический бронхит, простуду, астму и т.п. Маннатид представляет собой полученный из культуральной среды стрептококков группы A α-маннан, действующий в качестве иммуностимулятора, и применяется для дополнительной терапии в процессе лучевой и химиотерапии опухолей. Бактериальные лизатные препараты представляют собой бактериальные лизаты, полученные путем гидролиза с помощью щелочной протеазы 8 видов бактерий, а именно Haemophilus influenzae, Diplococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans и Neisseria catarrhalis, являются одной из разновидностей иммуностимуляторов и при пероральном введении могут предупреждать возникновение рецидивирующих инфекций дыхательных путей и острых приступов хронического бронхита. Препараты на основе липополисахаридов Salmonella typhi получают путем ферментации и выделения культуры тифозной палочки, и они предназначены для пациентов с хроническим бронхитом, а также обладают определенной терапевтической активностью в отношении предупреждения острых респираторных инфекций и облегчения течения болезни. Препараты на основе фильтрата Staphylococcus aureus представляют собой светло-желтую прозрачную жидкость, полученную с применением штамма золотистого стафилококка, полученного путем выделения из гноя у пациентов с хроническим остеомиелитом, с удалением клеток бактерий после ферментации культуры, и представляют собой белковый продукт из золотистого стафилококка, при этом одним из его активных ингредиентов является энтеротоксин C; они обладают иммуномодулирующим действием и при внутримышечном или внутрибрюшинном введении могут применяться в дополнительной терапии злокачественных опухолей. Кроме того, в качестве иммунизирующих антигенов также использовали инактивированные микобактерии туберкулеза, при этом для иммунизации кроликов использовали внутривенное введение в ушную вену, чтобы можно было получить сыворотку с высоким титром антител (публикация патента под номером CN105504054A).

Вышеуказанные представляют собой иммуномодулирующие средства, полученные с применением патогенных бактерий или не являющихся полезными бактерий, а также их составных компонентов или метаболитов, при этом все больше внимания уделяется исследованиям, которые касаются применения полезных бактерий (то есть пробиотических бактерий) в качестве иммуномодулирующих средств. Полезные бактерии – это общее название активных микроорганизмов, которые оказывают положительное воздействие на здоровье хозяина. При этом все больше внимания среди полезных бактерий уделяется исследованиям молочнокислых бактерий. Молочнокислые бактерии – это общее название группы неспорообразующих, грамположительных бактерий, у которых основным продуктом сбраживания углеводов является молочная кислота. Молочнокислые бактерии имеют большое значение для защиты здоровья организма людей и животных. Сегодня множество исследований доказывает, что пероральный прием живых молочнокислых бактерий может повышать иммунитет организма. Также было установлено, что некоторые инактивированные молочнокислые бактерии по-прежнему обладают биологическими функциями, например, клетки инактивированных молочнокислых бактерий по-прежнему обладают свойством адгезии в отношении клеток аденокарциномы толстого кишечника человека, клеток Caco-2, культур in vitro, а при смешивании с кормами улучшают рост и другие физиологические активности у животных (публикация патента под номером CN104906143A). Кроме того, составляющие компоненты молочнокислых бактерий также обладают определенными физиологическими функциями или фармакологическим действием, например внутрибрюшинное введение мышам лизатов клеточной стенки Enterococcus faecalis, полученных при обработке высокой температурой и высоким давлением, может усиливать способность макрофагов к фагоцитозу (публикация патента под номером CN101953855A); также установлено, что ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) генома молочнокислых бактерий за счет изменения соотношения Th1/Th2 может повышать у людей устойчивость к аллергиям (публикация патента под номером US2014/0288159A1); также существуют сведения о том, что пептидогликан в составе клеточных стенок молочнокислых бактерий или пептидогликан отдельно при пероральном и подкожном введениях или при внутрибрюшинном введении характеризуется иммуномодуляцией, антианафилактическим или противоопухолевым действием (ссылка [1]: 苏广伟，孙进，施用晖，乐国伟.乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体免疫功能的调节作用.中国生物工程杂志，2006, 26(8) : 98-102; ссылка [2]: 谷超，王志锐，魏骏飞，宋立学，陈锦英.双歧杆菌细胞壁组分免疫调节作用的研究.天津医科大学学报，2004, 10(2) : 179-181; ссылка [3]: 陈玉梅，程茜.双歧杆菌完整肽聚糖对食物过敏小鼠调节性T细胞影响的研究.中国微生态学杂志，2012, 24(10) : 865-867; ссылка [4]: 宋娜娜，宋静慧.乳杆菌胞外多糖及肽聚糖抗肿瘤作用研究进展.内蒙古医学院学报，2012, 34(6) : 996-999). Также имеются сведения о введении чужеродных генов, которые могут экспрессировать цитотоксичные белки в сальмонеллу, кишечную палочку, молочнокислые бактерии, бифидобактерии и т.п. с последующим внутривенным введением общей бактериальной массы для целевого лечения опухолей (публикация патента под номером US2015/0225692A1).

По сравнению с применением патогенных бактерий в качестве иммуномодулирующих средств, полезные бактерии более безопасны. Патогенные бактерии, или их составляющие компоненты, или их метаболиты обычно содержат токсичные компоненты, причиняющие вред организму, или их токсичные компоненты отдельно применяются для профилактики и лечения заболеваний, поэтому для организма существует скрытая угроза, в частности при внутривенном введении лекарственного средства могут в большей степени проявляться побочные эффекты. Поскольку в молочнокислых бактериях токсичных веществ мало или они вообще отсутствуют, то внутривенное введение инактивированных молочнокислых бактерий для организма является значительно более безопасным. В настоящее время еще не существует сведений о применении внутривенного введения инактивированных молочнокислых бактерий с целью повышения иммунитета, поэтому авторы провели исследования лечебного эффекта при внутривенном введении инактивированных молочнокислых бактерий и установили, что это оказывает сильное иммуностимулирующее действие на организм, поэтому имеет широкие перспективы для применения в будущем.

Сущность изобретения

Состав для инъекций, предназначенный для повышения иммунитета, где основной компонент данного состава для инъекций представляет собой инактивированные молочнокислые бактерии, при этом с помощью окрашивания по Граму и иммерсионной микроскопии инактивированных молочнокислых бактерий выявлено, что инактивированные молочнокислые бактерии сохраняют морфологию интактных бактерий. Используемое в данном документе выражение «сохраняют морфологию интактных бактерий» означает, что форма и морфология в основном соответствуют форме и морфологии живых бактерий перед инактивацией. Выражение «в основном неизменны» по существу подразумевает, что в процессе инактивации молочнокислых бактерий стенка клетки бактерии может незначительно изменяться, например, в результате вымывания части поверхностных компонентов, но такое изменение очень незначительно или происходит редко.

Указанный состав для инъекций содержит 10⁵–10¹² интактных клеток инактивированных молочнокислых бактерий в одном миллилитре раствора для инъекций.

Указанные молочнокислые бактерии выбраны из бактерий рода Lactobacillus, рода Enterococcus, рода Lactococcus, рода Bifidobacterium, рода Leuconostoc и рода Streptococcus.

Кроме того, способ инактивации молочнокислых бактерий выбран из какого-либо из следующих: инактивации с помощью высокой температуры, инактивации с помощью высокой температуры и высокого давления, инактивации ультрафиолетовым излучением, инактивации химическими соединениями или инактивации ионизирующим излучением.

Кроме того, указанный состав для инъекций дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, при этом вспомогательное вещество содержит достаточное количество соли или моносахарида для обеспечения того, чтобы значения осмотического давления суспензионного раствора для инъекций и крови были одинаковыми или сходными.

Применяемая форма состава для инъекций, получаемого на основе инактивированных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предусматривает: порошок для инъекций, суспензионный состав для инъекций и т.п. Указанный порошок для инъекций получают посредством высушивания распылением или сублимационного высушивания и составляется в виде суспензии при применении.

Указанный состав для инъекций представляет собой состав для внутривенных инъекций.

Предпочтительно указанные инактивированные молочнокислые бактерии представляют собой бактерии одного рода, при этом с помощью окрашивания по Граму и иммерсионной микроскопии инактивированных молочнокислых бактерий выявлено, что инактивированные молочнокислые бактерии сохраняют морфологию интактных бактерии, при этом их форма и морфология в основном соответствуют форме и морфологии живых бактерий перед инактивацией; при этом лекарственное средство вводится путем внутривенной инъекции.

Кроме того, указанные инактивированные молочнокислые бактерии представляют собой смесь из двух или более видов вышеуказанных инактивированных молочнокислых бактерий, при этом с помощью окрашивания по Граму и микроскопии инактивированных молочнокислых бактерий выявлено, что инактивированные молочнокислые бактерии в основном сохраняют морфологию интактных бактерий, при этом лекарственное средство вводится путем внутривенной инъекции. С целью получения указанных инактивированных молочнокислых бактерий применяют какой-либо способ инактивации из следующих: инактивации с помощью высокой температуры и высокого давления, инактивации ультрафиолетовым излучением, инактивации химическими соединениями или инактивации ионизирующим излучением. Указанные молочнокислые бактерии выбраны из бактерий рода Lactobacillus, рода Enterococcus, рода Lactococcus, рода Bifidobacterium, рода Leuconostoc и рода Streptococcus.

Из указанных инактивированных молочнокислых бактерий выделяют ДНК, и путем секвенирования генов или проведения секвенирования с ПЦР-амплификацией 16S rDNA и других целевых участков можно определить вид молочнокислых бактерий.

Кроме того, указанные инактивированные молочнокислые бактерии получены из бактерий, выбранных из следующих молочнокислых бактерий, подвергаемых обработке с целью инактивации: (1) бактерий рода Lactobacillus: палочки Дельбрюка (L. delbrueckii), болгарской палочки (L. bulgaricus), швейцарской палочки для сырной закваски (L. helviticus), ацидофильной палочки (L. acidophlus), бактерии вагинальной микрофлоры (L. gasseri), бактерии из слюны (L. salivarius), палочковидной бактерии из слюны (L. plantarum), палочковидной бактерии из толстой кишки (L. reuteri), бактерии для гетероферментативного молочнокислого брожения (L. brevis), бактерии из ротовой полости (L. casei), бактерии для производства пищевых добавок и продуктов из ферментированного молока (L. fementi) и т.п.; (2) бактерий рода Leuconostoc: бактерии для квашения капусты (L. mesenteroides), а также ее подвида для производства масла (L. cremoris) и ее подвида для производства сыров (Leuc. dextranicun); бактерии, сбраживающей сахар (L. lactis), винной бактерии (L. oenos) и т.п.; (3) бактерий рода Enterococcus: энтерококк фэциум (E. faecium), энтерококк фекальный (E. faecalis) и т.п.; (4) бактерий рода Lactococcus: бактерии для заквасок (L. lactis subsp. lactis), бактерии для твердых сыров (L. lactis subsp. cremoris), бактерии для производства сливочного масла (L. lactis subsp. hordniae) и т.п.; (5) бактерии рода Streptococcus: молочнокислого стрептококка (S. lactis), бактерии для йогуртовой закваски (S. diacetilactis), сливочного стрептококка (S. creamoris), бактерии для ферментированных продуктов (S. thermophilus) и т.п.; (6) бактерий рода Bacillus bifidus: бактерии для пробиотических кисломолочных продуктах (B. bifidum), бактерии для закваски пробиотических продуктов (B. longum), бактерии, населяющей кишечник (B. breve), бактерии, населяющей кишечник детей (B. infantis), бактерии, населяющей кишечник взрослых (B. adolescentis), бактерии, населяющей толстый кишечник большинства млекопитающих (B. animalis) и т.п.; (7) молочнокислых бактерий других родов.

Указанное вспомогательное вещество для состава для внутривенных инъекций выбрано из октилфеноксиполиэтоксиэтанола, тилоксапола, моноолеата полиэтиленгликоль-сорбитана, полиоксиэтиленмоностеарата, производного полиоксиэтилена, твин-80, полиалкилбензолсульфоната натрия, лаурилсульфата натрия, полисахаридной сульфатной соли щелочного металла, декстрансульфата натрия, диоктилсульфосукцината, аравийской камеди, гуммиарабика, поливинилпирролидона, полиэтилсиликата, этанола, глицерина, сорбитола, меда, агар-агара, крахмала, глюкозы, фруктозы, солодового экстракта, какао, винной кислоты, лимонной кислоты, цитрата натрия, каррагинана, альгиновой кислоты, альгината натрия, дубильной кислоты, цикламовой кислоты, минерального масла, порошкообразного анальгетика на основе карбаспирина кальция, кристаллозы, камеди гхатти, камеди карайи, трагакантовой камеди, пектина, хондруса курчавого, желатина, карбоксиметилцеллюлозы, сульфата целлюлозы, метилцеллюлозы, натрийкарбоксиметилцеллюлозы, ацетат-сульфата натрий-целлюлозы, гидроксиэтила натрий-целлюлозы, метилполисилоксана, сорбата калия, каолина, диатомита, бентонита, силиката алюминия, гидроксида алюминия, коллоидного гидроксида алюминия, алюминий-магния силиката, монтмориллонита магния, трисиликата магния, алюмосиликата натрия, гидрокарбоната натрия, карбоната натрия, метилпарагидроксибензоата, пропилпарабена, этилванилина, лимонного масла, апельсинового масла, ванилина, казеина и т.п.

Предпочтительно указанные молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению выбраны из: бактерий для заквасок (название на латинском языке – Lactococcus lactis subsp. lactis, номер штамма – CICC6246), бактерий для производства кисломолочных продуктов (название на латинском языке – Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, номер штамма – CICC6240), бактерий для закваски пробиотических продуктов (название на латинском языке – Bifidobacterium longum, номер штамма – CICC6196), бактерий для гетероферментативного молочнокислого брожения (название на латинском языке – Lactobacillus brevis, номер штамма – CICC6239) и Enterococcus faecium (название на латинском языке – Enterococcus faecium, номер штамма – CICC6049). В отношении каждого из вышеуказанных 5 видов молочнокислых бактерий использовали общепринятые способы инактивации, а затем внутривенно вводили мышам, чтобы проследить возможность усиления иммунитета организма мышей как результат внутривенного введения вышеуказанных 5 видов инактивированных молочнокислых бактерий. После этого выделяли Enterococcus faecium и определяли их характеристики, при этом было установлено, что инактивированные Enterococcus faecium по-прежнему окрашивались по Граму, а иммерсионная микроскопия показала, что инактивированные Enterococcus faecium в основном сохраняют форму и морфологию живых Enterococcus faecium. Затем суспензию инактивированных Enterococcus faecium в физиологическом растворе центрифугировали, сливали надосадочную жидкость с получением осадка и выделяли ДНК, при этом посредством ПЦР по-прежнему можно осуществлять амплификацию фрагмента гена 16S rDNA и посредством секвенирования также можно определять вид молочнокислых бактерий.

Дальнейшее изучение показало, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium может эффективно повышать неспецифический иммунитет и специфический иммунитет у нормальной мыши и мышиной модели со сниженным иммунитетом, а также может повышать вес органов иммунной системы организма.

Состав для внутривенных инъекций на основе указанных инактивированных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению можно применять для предупреждения, лечения или дополнительной терапии различных заболеваний, таких как различные бактериальные заболевания, вирусные заболевания, микозы, паразитарные заболевания, рак и различные другие заболевания, вызывающие снижение иммунитета у людей и животных.

До недавних пор в отношении применения внутривенного введения инактивированных молочнокислых бактерий с целью повышения иммунитета организма не проводили исследовании, в которых основное внимание уделялось бы вопросу безопасности внутривенного введения инактивированных молочнокислых бактерий: в отличие от обычно используемых составов для внутривенных инъекций на основе водорастворимых веществ, состав для внутривенных инъекций на основе инактивированных молочнокислых бактерий представляет собой суспензию с веществами в виде твердых частиц, а внутривенное введение таких веществ в виде твердых частиц связано с относительно высоким риском. На основании имеющихся исследований считается, что путем внутривенного введения патогенных бактерий и их составляющих компонентов можно лечить заболевания по принципу «изгонять яд с помощью яда», тогда как полезным бактериям трудно оказывать такое действие, и длительные исследования в отношении настоящего изобретения показали, что внутривенное введение инактивированных молочнокислых бактерий оказывает на организм сильное иммуностимулирующее действие и может обеспечить «большее изгнание яда».

Из предшествующих исследований известно, что поверхностные компоненты молочнокислых бактерий, например липотейхоевая кислота (LTA), пептидогликан (PG) клеточной стенки, белки клеточной поверхности (белок S), а также некоторые неизвестные выделяемые поверхностью вещества, после их распознавания в качестве лигандов Toll-подобными рецепторами могут активировать сигнальный путь для активации иммунитета, за счет чего повышается иммунитет организма (справочный документ [5]: 章文明，汪海峰，刘建新.乳酸杆菌益生作用机制的研究进展.动物营养学报，2012, 24(3) : 389-396). В частности, пептидогликан в качестве поверхностного вещества молочнокислых бактерий является необходимым компонентом клеточной стенки молочнокислых бактерий, а также позволяет молочнокислым бактериям воздействовать на Toll-подобные рецепторы для активации иммунной системы, поэтому является важным веществом (ссылка [6]: 刘朝，乔建军，朱宏吉.乳酸菌肽聚糖的研究进展.微生物学通报，2016, 43(1) : 188-197). Согласно настоящему изобретению вышеуказанные поверхностные компоненты не выделяют из молочнокислых бактерий, а осуществляют внутривенное введение молочнокислых бактерий непосредственно после инактивации общепринятыми способами, чтобы было можно повысить иммунитет организма; кроме того, было обнаружено, что молочнокислые бактерии после инактивации в основном сохраняют форму и морфологию молочнокислых бактерий до инактивации, а также подтверждено, что внутривенное введение типичных штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к разным родам (например, бактерий для заквасок, бактерий для производства кисломолочных продуктов, бактерий для закваски пробиотических продуктов, бактерий для гетероферментативного молочнокислого брожения и Enterococcus faecium), с их предварительной инактивацией может повышать иммунитет организма, что свидетельствует об универсальности активации иммунной системы за счет внутривенного введения инактивированных молочнокислых бактерий.

Поэтому авторы пришли к выводу, что, несмотря на инактивацию молочнокислых бактерий, поверхностные компоненты на всей клеточной стенке бактерии по-прежнему могут распознаваться Toll-подобными рецепторами иммунных клеток, за счет чего иммунная система активируется. Таким образом, преимущества внутривенного введения инактивированных молочнокислых бактерий в качестве иммуностимуляторов заключаются в следующем: для модуляции иммунитета поверхностные компоненты молочнокислых бактерий не нужно выделять, а достаточно их непосредственно инактивировать, поэтому процедура становиться простой; кроме того, инактивированные молочнокислые бактерии, транспортируясь с потоком крови, могут попадать в тимус, селезенку, лимфатические узлы и прочие органы иммунной системы и непосредственно воздействовать на Toll-подобные рецепторы иммунных клеток, поэтому их функция в плане активации иммунитета становится более интенсивной и быстрой.

Описание графических материалов

На фиг. 1 представлена фотография, на которой изображены живые Enterococcus faecium, окрашенные по Граму, при иммерсионной микроскопии;

на фиг. 2 представлена фотография, на которой изображены инактивированные Enterococcus faecium, окрашенные по Граму, при иммерсионной микроскопии;

на фиг. 3 представлена фотография электрофореза продуктов ПЦР-амплификации на предмет выявления 16SrDNA Enterococcus faecium, где M – маркер, а 1, 2 и 3 – три дорожки, соответствующие продуктам ПЦР-амплификации 16SrDNA Enterococcus faecium.

Конкретные способы осуществления

Пример осуществления 1

Проводили посев Enterococcus faecium (приобретенных у Китайской коллекции промышленных микроорганизмов, название на латинском языке – Enterococcus faecium, номер штамма – CICC6049) в питательную среду MRS; культивирование осуществляли в термостате при 37°C в течение 24 часов; затем центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут; удаляли надосадочный слой культуральной среды, оставляя осадок; добавляли стерильный физиологический раствор для промывания осадка; центрифугировали 5 минут; после повторного промывания 3 раза добавляли стерильный физиологический раствор и однородно перемешивали с осадком с получением суспензии. Определенное количество суспензии в физиологическом растворе с Enterococcus faecium помещали в спектрофотометр для измерения ее величины OD (оптической плотности) при 690 нм; если величина OD для конечной концентрации при разведении стерильным физиологическим раствором составляла 0,38, то суспензия в физиологическом растворе с Enterococcus faecium при такой низкой концентрации представляет собой однократную (1×) концентрацию; с помощью счетной камеры THOMA определяли количество бактерий, содержащихся при такой концентрации, при этом в каждом миллилитре суспензии содержалось приблизительно 10⁸ цельных бактерий Enterococcus faecium. Отбирали небольшое количество суспензии в физиологическом растворе с Enterococcus faecium с концентрацией 1×, окрашивали ее по Граму и проводили иммерсионную микроскопию для визуальной оценки формы живых бактерий (см. фиг. 1). Готовую суспензию Enterococcus faecium в физиологическом растворе с концентрацией 1× инактивировали в течение 15 минут при температуре 121°C и давлении 0,12 МПа; получали раствор для инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium; отбирали небольшое количество раствора для инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium, окрашивали по Граму и проводили иммерсионную микроскопию для визуальной оценки формы инактивированных бактерий (см. фиг. 2). При сравнении было выявлено, что инактивированные бактерии в основном сохранили форму и морфологию живых бактерий, а количество бактерий после инактивации существенно не отличалось от количества бактерий перед инактивацией. Суспензию в физиологическом растворе с инактивированными Enterococcus faecium центрифугировали, сливали надосадочную жидкость с получением осадка, выделяли ДНК; образцы для выявления 16S rDNA после ПЦР-амплификации подвергали электрофорезу в агарозном геле (см. фиг. 3); также путем секвенирования можно было определить вид молочнокислых бактерий.

Пример осуществления 2

Проводили посев Enterococcus faecium (приобретенных у Китайской коллекции промышленных микроорганизмов, название на латинском языке – Enterococcus faecium, номер штамма – CICC6049) в питательную среду MRS; культивирование осуществляли в термостате при 37°C в течение 24 часов; затем центрифугировали при 3000 оборотов в течение 5 минут; удаляли надосадочный слой культурной среды, оставляя осадок; добавляли 0,9%-ный стерильный физиологический раствор для промывания осадка; центрифугировали 5 минут, после повторного промывания 3 раза добавляли соответствующее количество 0,9%-ного стерильного физиологического раствора и однородно перемешивали с осадком. Определенное количество суспензии молочнокислых бактерий помещали в спектрофотометр для измерения ее величины OD при длине волны 690 нм; если величина OD для конечной концентрации при разведении стерильным физиологическим раствором составляет 0,38, то суспензия молочнокислых бактерий при такой слабой концентрации представляет собой однократную (1×) концентрацию. На основании этого физиологический раствор, содержащий молочнокислые бактерии, разбавляли с получением физиологического раствора разных концентраций, чтобы можно было получить суспензии молочнокислых бактерий с концентрацией 5×, 1× и 0,2×. После этого полученные суспензии с Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2× по отдельности инактивировали при температуре 121°C и давлении 0,12 МПа в течение 15 мин; в результате этого получили лекарственные средства в виде суспензий инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×. С помощью карбон-клиренс теста проверяли влияние раствора для внутривенных инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у нормальных мышей. Свободных от патогенной микрофлоры мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу с тимопентином (контрольная группа с положительной реакцией на лекарственное средство) и группы с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium. В каждой группе было по 10 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Мышам из нормальной контрольной группы в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор, а из группы с тимопентином – тимопентин, при этом вводимая доза составляла 0,2 мг/кг; мышам из групп с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium соответственно внутривенно вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×. Объем введения лекарственных средств во всех вышеуказанных группах составлял 0,1 мл/10 г, при этом их вводили в хвостовую вену 5 дней подряд, ежедневно 1 раз в сутки. В день 5 через 2 часа после введения лекарственных средств мышам в хвостовую вену вводили угольные частицы в объеме 0,05 мл/10 г и через 1 минуту и 10 минут соответственно из орбитального венозного сплетения отбирали кровь в объеме 40 мкл, которую добавляли в 4 мл 0,1%-ного раствора Na₂CO₃ и взбалтывали; с помощью спектрофотометра при длине волны 680 нм проводили колориметрию и измеряли оптическую плотность (оптическая плотность образцов крови, отобранных через 1 минуту и 10 минут, представлена в виде OD₁ и OD₁₀ соответственно); по приведенной ниже формуле рассчитывали значение показателя выведения угольных частиц K. Показатель выведения угольных частиц K=(lgOD₁–lgOD₁₀)/(t₁₀–t₁). С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 1. В таблице 1 видно, что по сравнению с нормальной контрольной группой в группах с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium отмечается существенное повышение значения показателя выведения угольных частиц K; кроме того, по сравнению с характеризующейся положительной реакцией на лекарственное средство группой с тимопентином в группе с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium по-прежнему отмечается существенное повышение значения показателя выведения угольных частиц K. Вышеприведенное свидетельствует о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium может повышать функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у нормальных мышей, то есть повышает неспецифический иммунитет у мышей.

Таблица 1. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у нормальных мышей

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,05.

Пример осуществления 3

Использовали суспензию с инактивированными Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2× согласно примеру осуществления 2; с помощью карбон-клиренс теста проверяли влияние внутривенного введения суспензии с инактивированными Enterococcus faecium на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов в мышиной модели с иммуносупрессией. Свободных от патогенной микрофлоры мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу с иммуносупрессией, группу с тимопентином и группы с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium. В каждой группе было по 10 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Ежедневно 1 раз в сутки в течение непрерывных 5 дней мышам внутрибрюшинно вводили дексаметазон, при этом его доза составляла 40 мг/кг, чтобы получить мышиные модели с иммуносупрессией. После получения мышиных моделей с иммуносупрессией в тот же день мышам из нормальной контрольной группы и группы с иммуносупрессией в хвостовую вену вводили физиологический раствор, а из группы с тимопентином в хвостовую вену вводили тимопентин, при этом вводимая доза составляла 0,2 мг/кг; мышам из групп с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium соответственно в хвостовую вену внутривенно вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×. Объем введения лекарственных средств во всех вышеуказанным группам составлял 0,1 мл/10 г. Введение лекарственных средств во всех группах мышей проводили в течение 5 дней, ежедневно 1 раз в сутки. Через 2 часа после последнего введения лекарственных средств мышам в хвостовую вену вводили угольные частицы в объеме 0,05 мл/10 г и через 1 минуту и 10 минут соответственно из орбитального венозного сплетения отбирали кровь в объеме 40 мкл, которую добавляли в 4 мл 0,1%-ного раствора Na₂CO₃ и взбалтывали; с помощью спектрофотометра при длине волны 680 нм проводили колориметрию и измеряли оптическую плотность (оптическая плотность образцов крови, отобранных через 1 минуту и 10 минут, представлена в виде OD1 и OD10 соответственно); по приведенной ниже формуле рассчитывали значение показателя выведения угольных частиц K. Показатель выведения угольных частиц K=(lgOD₁–lgOD₁₀)/(t₁₀–t₁). С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 2. В таблице 2 можно увидеть, что в группе с иммуносупрессией в сравнении с нормальной контрольной группой отмечалось значимое снижение значения показателя выведения угольных частиц K, что свидетельствует об успешном получении мышиных моделей с иммуносупрессией; в группах с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с группой с иммуносупрессией отмечалось очень значимое или значимое повышение значения показателя выведения угольных частиц K; в группе с высокой дозой инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с группой с тимопентином по-прежнему отмечалось значимое повышение значения показателя выведения угольных частиц K. Вышеприведенное свидетельствует о том, что внутривенное введение суспензии инактивированных Enterococcus faecium может повышать функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у мышиных моделей с иммуносупрессией, то есть повышает неспецифический иммунитет мышиных моделей с иммуносупрессией.

Таблица 2. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у мышиных моделей с иммуносупрессией

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,05; ^# указывает на значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,05.

Пример осуществления 4

С помощью суспензии инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 1× согласно примеру осуществления 2 определяли влияние внутривенного введения суспензии инактивированных Enterococcus faecium на специфический иммунитет у нормальных мышей. Свободных от патогенной микрофлоры лабораторных мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в контрольную группу (то есть группа нормальных мышей, зараженных ньюкаслской болезнью) и группу с введенными инактивированными Enterococcus faecium; при этом в каждой группе было по 10 мышей с одинаковым количество самок и самцов. Мышам из контрольной группы в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор, а мышам из группы с введенными инактивированными Enterococcus faecium в хвостовую вену вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 1×; при этом объем введения лекарственных средств во всех группах мышей составил 0,1 мл/10 г. Через 24 часа после введения лекарственных средств 1 раз мышам в хвостовую вену вводили вирус ньюкаслской болезни, после чего через 3 дня у мышей из орбитального венозного сплетения отбирали кровь; на основании реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации определяли уровень антител к возбудителю ньюкаслской болезни. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 3. В таблице можно увидеть, что в группе с введенными инактивированными Enterococcus faecium в сравнении с контрольной группой отмечалось явное повышение уровня антител к возбудителю ньюкаслской болезни, что свидетельствует о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium может повышать уровень антител к возбудителю ньюкаслской болезни у нормальных мышей, то есть повышать специфический иммунитет у нормальных мышей.

Таблица 3. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на уровень антител к вирусу ньюкаслской болезни у нормальных мышей

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с контрольной группой, P<0,05.

Пример осуществления 5

С помощью суспензии с инактивированными Enterococcus faecium с концентрацией 1×, полученной согласно примеру осуществления 2, определяли влияние внутривенного введения суспензии инактивированных Enterococcus faecium на специфический иммунитет в мышиных моделях с иммуносупрессией. Свободных от патогенной микрофлоры лабораторных мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в контрольную группу (то есть группу нормальных мышей, зараженных ньюкаслской болезнью), группу с иммуносупрессией и группу с введенными инактивированными Enterococcus faecium; при этом в каждой группе было по 16 мышей с одинаковым количеством самок и самцов. Ежедневно 1 раз в сутки в течение непрерывных 3 дней мышам внутрибрюшинно вводили дексаметазон, доза которого составляла 80 мг/кг, чтобы получить мышиные модели с иммуносупрессией. После получения мышиных моделей с иммуносупрессией в тот же день мышиным моделям из группы с введенными инактивированными Enterococcus faecium в хвостовую вену вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 1×; мышам из контрольной группы и группы с иммуносупрессией в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор; при этом объем введения лекарственных средств составлял 0,1 мл/10 г. Через 24 часа после введения лекарств во всех группах мышам в хвостовую вену вводили равное количество вируса ньюкаслской болезни, после чего через 3 дня у мышей из орбитального венозного сплетения отбирали кровь; на основании реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации определяли уровень антител к возбудителю ньюкаслской болезни. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 4. Из таблицы 4 можно понять, что в группе с иммуносупрессией в сравнении с контрольной группой титр антител к возбудителю ньюкаслской болезни значительно снизился; в группе с введенными инактивированными Enterococcus faecium в сравнении с группой с иммуносупрессией отмечали очевидное повышение уровня антител к возбудителю ньюкаслской болезни; кроме того, группа с введенными инактивированными Enterococcus faecium в сравнении с контрольной группой не показала значимой разницы; вышеприведенное свидетельствует о том, что у мышей в группе с введенными инактивированными Enterococcus faecium уровень антител к возбудителю ньюкаслской болезни восстановился до нормального уровня, то есть внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium может повышать специфический иммунитет организма мышей при сниженном иммунитете.

Таблица 4. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на уровень антител к вирусу ньюкаслской болезни в мышиных моделей с иммуносупрессией

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,05.

Пример осуществления 6

С помощью суспензии инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×, полученной согласно примеру осуществления 2, определяли влияние внутривенного введения суспензии инактивированных Enterococcus faecium на индексы органов иммунной системы у нормальных мышей. Свободных от патогенной микрофлоры мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу с тимопентином (контрольная группа с положительной реакцией на лекарственное средство) и группы с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium. В каждой группе было по 10 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Мышам из нормальной контрольной группы в хвостовую вену вводили физиологический раствор, из группы с тимопентином в хвостовую вену вводили тимопентин, при этом вводимая доза составляла 0,2 мг/кг; мышам из групп с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium соответственно в хвостовую вену вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×; при этом объем введения лекарственных средств во всех вышеуказанных группах составлял 0,1 мл/10 г. Лекарства во всех группах мышей вводили в хвостовую вену в течение непрерывных 5 дней, ежедневно 1 раз в сутки; через 2 часа после последнего введения лекарственных средств у мышей определяли селезеночный индекс. Селезеночный индекс=вес селезенки/вес тела мыши. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 5. В таблице 5 видно, что в группе с высокой дозой инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с нормальной контрольной группой отмечалось очень значимое повышение селезеночного индекса; в группах со средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с нормальной контрольной группой не отмечали значимой разницы в отношении селезеночного индекса. В группе с высокой дозой инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с группой с тимопентином также отмечали значимое повышение селезеночного индекса. Вышеприведенное говорит о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium может способствовать повышению индексов органов иммунной системы у нормальных мышей. Селезеночный индекс представляет собой важный показатель для оценки влияния лекарственного средства на иммунитет; повышение селезеночного индекса свидетельствует о том, что селезенка увеличилась относительно веса организма, что является результатом действия лекарственного средства на органы иммунной системы и свидетельством улучшения иммунитета.

Таблица 5. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на селезеночный индекс у нормальных мышей

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,05.

Пример осуществления 7

С помощью суспензии с инактивированными Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×, полученной согласно примеру осуществления 2, определяли влияние внутривенного введения суспензии инактивированных Enterococcus faecium на индексы органов иммунной системы у мышиных моделей с иммуносупрессией. Свободных от патогенной микрофлоры мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу с иммуносупрессией, группу с тимопентином и группы с высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium. В каждой группе было по 10 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Ежедневно 1 раз в сутки в течение непрерывных 5 дней мышам внутрибрюшинно вводили дексаметазон, при этом его доза составляла 40 мг/кг, чтобы получить мышиные модели с иммуносупрессией. После получения мышиных моделей с иммуносупрессией в тот же день мышам из нормальной контрольной группы и группы с иммуносупрессией в хвостовую вену вводили физиологический раствор, а из группы с тимопентином в хвостовую вену вводили тимопентин в дозе 0,2 мг/кг; мышам из групп, в которых вводят высокую, среднюю и низкую дозы Enterococcus faecium, соответственно вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×. После этого лекарственные средств животным всех групп внутривенно вводили в течение непрерывных 5 дней, ежедневно 1 раз в сутки. После последнего введения лекарственных средств у мышей определяли селезеночный индекс. Селезеночный индекс=вес селезенки/вес тела мыши. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 6. В таблице 6 видно, что в сравнении с нормальной контрольной группой у группы мышиных моделей отмечали значительное снижение селезеночного индекса; в группе, в которой вводили высокую дозу бактерий, в сравнении с группой мышиных моделей отмечали очень значимое повышение селезеночного индекса; кроме того, группа, в которой вводили высокую дозу бактерий, в сравнении с нормальной контрольной группой не показала значимой разницы. Это свидетельствует о том, что высокая доза инактивированных Enterococcus faecium может повышать селезеночный индекс у мышиных моделей с иммуносупрессией, при этом возможно восстановление до нормального уровня.

Таблица 6. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на селезеночный индекс у мышиных моделей с иммуносупрессией

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с иммуносупрессией, P<0,05; ^## указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,01.

Пример осуществления 8

Согласно настоящему изобретению у Китайской коллекции промышленных микроорганизмов (CICC) приобрели 5 видов молочнокислых бактерий, а именно: бактерии для заквасок (название на латинском языке – Lactococcus lactis subsp. lactis, номер штамма — CICC6246), бактерии для производства кисломолочных продуктов (название на латинском языке – Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, номер штамма – CICC6240), бактерии для закваски пробиотических продуктов (название на латинском языке – Bifidobacterium longum, номер штамма – CICC6196), бактерии для гетероферментативного молочнокислого брожения (название на латинском языке – Lactobacillus brevis, номер штамма – CICC6239) и Enterococcus faecium (название на латинском языке – Enterococcus faecium, номер штамма – CICC6049). С помощью способа согласно примеру осуществления 1 на основе вышеуказанных 5 видов молочнокислых бактерий соответственно получали раствор для внутривенных инъекций на основе инактивированных молочнокислых бактерий с концентрацией 5×; с помощью карбон-клиренс теста проверяли влияние 5 видов инактивированных молочнокислых бактерий и их смесей на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у мышей. Свободных от патогенной микрофлоры лабораторных мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу с инактивированными бактериями для заквасок, группу с инактивированными бактериями для производства кисломолочных продуктов, группу с инактивированными бактериями для закваски пробиотических продуктов, группу с инактивированными Enterococcus faecium, группу с инактивированными бактериями для гетероферментативного молочнокислого брожения и группу со смесью из 2-х видов инактивированных молочнокислых бактерий (то есть группа со смесью из инактивированных Enterococcus faecium и инактивированных бактерий для гетероферментативного молочнокислого брожения в равном соотношении). В каждой группе было по 10 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Мышам из нормальной контрольной группы в хвостовую вену вводили физиологический раствор, а из группы с 5 видами разных инактивированных молочнокислых бактерий и группы со смесью из 2-х видов инактивированных молочнокислых бактерий соответственно в хвостовую вену вводили соответствующее лекарственное средство. Объем введения лекарственных средств во всех вышеуказанных группах составлял 0,1 мл/10 г, при этом их вводили в хвостовую вену 5 дней подряд, ежедневно 1 раз в сутки. В день 5 через 2 часа после введения лекарственных средств мышам в хвостовую вену вводили угольные частицы в объеме 0,05 мл/10 г и через 1 минуту и 10 минут соответственно из орбитального венозного сплетения брали кровь в объеме 40 мкл, которую добавляли к 4 мл 0,1%-ного раствора Na₂CO₃ и взбалтывали; с помощью спектрофотометра при длине волны 680 нм проводили колориметрию и измеряли оптическую плотность (оптическая плотность образцов крови, отобранных через 1 минуту и 10 минут, представлена в виде OD1 и OD10 соответственно); по представленной ниже формуле рассчитывали значение показателя выведения угольных частиц K. Показатель выведения угольных частиц K=(lgOD₁–lgOD₁₀)/(t₁₀–t₁). С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 7. В таблице 7 видно, что в группе с 5 видами разных инактивированных молочнокислых бактерий и группе со смесью из 2 видов инактивированных молочнокислых бактерий в сравнении с нормальной контрольной группой отмечали значимое или очень значимое повышение функции фагоцитоза мононуклеарных макрофагов мышей. Это свидетельствует о том, что внутривенное введение разных инактивированных молочнокислых бактерий и их смеси может повышать неспецифический иммунитет мышей.

Таблица 7. Влияние внутривенного введения пяти видов инактивированных молочнокислых бактерий и их смеси на функцию фагоцитоза мононуклеарных макрофагов у мышей

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05.

Пример осуществления 9

Согласно теории иммунитета укрепление иммунитета способствует тому, что организм устраняет патогены для предупреждения инфекций. С помощью состава для внутривенных инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 1×, полученного согласно примеру осуществления 2, проверяли профилактическую и терапевтическую активность состава для внутривенных инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium в отношении инфицированных сальмонеллой мышей. Свободных от патогенной микрофлоры лабораторных мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в 3 группы, а именно в нормальную контрольную группу, группу с сальмонеллой и группу с инактивированными Enterococcus faecium; при этом в каждой группе было 30 мышей с одинаковым количеством самок и самцов. Мышам из нормальной контрольной группы и группы с сальмонеллой в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор, а из группы с инактивированными Enterococcus faecium в хвостовую вену вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 1×; при этом объем введения лекарственных средств составлял 0,1 мл/10 г. Через 24 часа после введения лекарственных средств мышам из группы с сальмонеллой и группы с инактивированными Enterococcus faecium соответственно в хвостовую вену вводили сальмонеллу энтерика (Китайская ветеринарная коллекция микроорганизмов, название на латинском языке – Salmonella enteritidis, номер штамма – CVCC3377). Осуществляли непрерывное наблюдение за мышами в течение 7 дней и регистрировали ежедневную смертность. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку на соответствие по критерию хи-квадрат, результаты которой показаны в таблице 8. В таблице 8 видно, что в сравнении с контрольной группой с сальмонеллой в группе с инактивированными Enterococcus faecium отмечалось очень значимое снижение смертности мышей. Это свидетельствует о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium проявляет профилактическую и терапевтическую активность в отношении инфицированных сальмонеллой мышей.

Таблица 8. Лечебно-профилактическая активность в результате внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium в отношении смертности мышей от сальмонеллы

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с сальмонеллой, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с сальмонеллой, P<0,05.

Пример осуществления 10

С помощью суспензии инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×, полученной согласно примеру осуществления 2, проверяли влияние состава для внутривенных инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium на смертность мышей при заражении штаммом PR8 вируса гриппа. Отобранных для исследования свободных от патогенной микрофлоры лабораторных мышей Kunming с весом тела 18–22 г распределяли в нормальную контрольную группу, группу мышиных моделей со штаммом PR8 (то есть группа мышиных моделей, зараженных штаммом PR8 вируса гриппа) и группы с введенными высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium. В каждой группе было по 30 мышей, причем количество самцов и самок было одинаковым. Мышам из групп с высокой, средней и низкой дозами инактивированных молочнокислых бактерий соответственно в хвостовую вену вводили суспензию инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×; мышам из нормальной контрольной группы и группы мышиных моделей со штаммом PR8 в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор; при этом объем введения лекарственных средств во всех группах составлял 0,1 мл/10 г. Через 24 часа после введения лекарств 1 раз всем группам мышей, кроме нормальной контрольной группы, под легкой анестезией диэтиловым эфиром вкалывали в носовую полость аллантоисную жидкость куриного эмбриона, содержащую штамм PR8 вируса гриппа, каждой особи по 0,05 мл, чтобы заразить мышей штаммом PR8 вируса гриппа. После этого в течение 10 дней наблюдали и регистрировали смертность мышей в каждой группе. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку на соответствие по критерию хи-квадрат, результаты которой показаны в таблице 9. В таблице 9 видно, что в группе с введенными высокой и средней дозами инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с группой мышиных моделей со штаммом PR8 можно было отметить очень значимое снижение смертности мышей, а в группе с низкой дозой в сравнении с группой мышиных моделей со штаммом PR8 можно было отметить значимое снижение смертности мышей. Вышеприведенное свидетельствует о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium можно использовать в профилактике и терапии вирусных заболеваний.

Таблица 9. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на мышей, зараженных штаммом PR8 вируса гриппа

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с нормальной контрольной группой, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой мышиных моделей со штаммом PR8, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой мышиных моделей со штаммом PR8, P<0,05.

Пример осуществления 11

С помощью суспензии с инактивированными Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×, полученной согласно примеру осуществления 2, проверяли влияние внутривенного введения суспензии с инактивированными Enterococcus faecium на вес тела и селезеночный индекс у мышей с асцитной опухолью. Мышей ICR весом 18–22 г распределяли в 5 групп, а именно в группу мышиных моделей с асцитной опухолью, группу с тимопентином и группы с введенными высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium; в каждой группе было по 10 мышиных моделей с асцитной опухолью. Мышам в группе мышиных моделей с асцитной опухолью в хвостовую вену вводили стерильный физиологический раствор, а в группе с тимопентином в хвостовую вену вводили тимопентин в дозе 0,2 мг/кг; мышам в группе с введенными высокой, средней и низкой дозами инактивированных Enterococcus faecium соответственно в хвостовую вену вводили раствор для внутривенных инъекций на основе инактивированных Enterococcus faecium с концентрацией 5×, 1× и 0,2×; при этом объем введения лекарственных средств составлял 0,1 мл/10 г. Лекарства вводили однократно за день до получения мышиных моделей с асцитной опухолью Эрлиха (EAC), то есть через 24 часа после введения лекарственных средств мышам внутрибрюшинно вводили суспензию клеток асцитной опухоли Эрлиха, чтобы получить мышиные модели с асцитной опухолью Эрлиха (EAC). После этого в течение 7 подряд снова вводили лекарственные средства; определяли повышение веса тела и селезеночный индекс у мышей с асцитной опухолью, при этом селезеночный индекс=вес селезенки/вес тела мыши. С помощью программного обеспечения SPSS11.5 в отношении лабораторных данных проводили проверку по критерию значимости, результаты которой показаны в таблице 10. В таблице 10 видно, что в сравнении с группой мышиных моделей с асцитной опухолью в группе с введенной высокой дозой инактивированных Enterococcus faecium отмечали значимое снижение показателя увеличения веса тела у мышей с асцитной опухолью. Поскольку у мышиных моделей с асцитной опухолью Эрлиха появилась асцитная опухоль, вес тела мышей с опухолью быстро увеличивался, при этом исследования показали, что введение высокой дозы инактивированных Enterococcus faecium в хвостовую вену может замедлить темпы повышения веса тела у мышей с опухолью и, соответственно, может использоваться для подавления образования асцитной опухоли. Кроме того, у мышей с асцитной опухолью в группе с введенными высокой дозой и средней дозой инактивированных Enterococcus faecium в сравнении с группой мышиных моделей с асцитной опухолью отмечали соответственно очень значимое и значимое повышение селезеночного индекса. Следовательно, это свидетельствует о том, что внутривенное введение инактивированных Enterococcus faecium также может улучшать иммунитет у мышей с асцитной опухолью.

Таблица 10. Влияние внутривенного введения инактивированных Enterococcus faecium на повышение веса тела и селезеночный индекс у мышей с асцитной опухолью

Примечание: ** указывает на очень значимое различие в сравнении с группой мышиных моделей с асцитной опухолью, P<0,01; * указывает на значимое различие в сравнении с группой мышиных моделей с асцитной опухолью, P<0,05; ΔΔ указывает на очень значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, P<0,01; Δ указывает на значимое различие в сравнении с группой с тимопентином, Р<0,05.

Изобретение относится к составу для инъекций, предназначенному для повышения специфического иммунитета. Предложенный состав для инъекций представляет собой состав для внутривенных инъекций, где основной компонент данного состава представляет собой инактивированные молочнокислые бактерии Enterococcus faecium (CICC6049), приобретенные у Китайской коллекции промышленных микроорганизмов (CICC). При этом с помощью окрашивания по Граму и иммерсионной микроскопии инактивированных молочнокислых бактерий выявлено, что инактивированные молочнокислые бактерии сохраняют морфологию интактных бактерий. При этом количество интактных клеток инактивированных молочнокислых бактерий в одном миллилитре состава для инъекций составляет 10⁵–10¹². Изобретение обеспечивает повышение специфического иммунитета. 4 з.п. ф-лы, 10 табл., 11 пр., 3 ил.

1. Состав для инъекций, предназначенный для повышения специфического иммунитета, при этом указанный состав для инъекций представляет собой состав для внутривенных инъекций, где основной компонент данного состава для инъекций представляет собой инактивированные молочнокислые бактерии, при этом с помощью окрашивания по Граму и иммерсионной микроскопии инактивированных молочнокислых бактерий выявлено, что инактивированные молочнокислые бактерии сохраняют морфологию интактных бактерий; при этом количество интактных клеток инактивированных молочнокислых бактерий в одном миллилитре состава для инъекций составляет 10⁵–10¹²; при этом указанные молочнокислые бактерии представляют собой Enterococcus faecium (CICC6049); при этом указанные молочнокислые бактерии приобретены у Китайской коллекции промышленных микроорганизмов (CICC).

2. Состав для инъекций по п. 1, где способ инактивации выбран из какого-либо из следующих: инактивации с помощью высокой температуры, инактивации с помощью высокой температуры и высокого давления, инактивации ультрафиолетовым излучением, инактивации химическими соединениями или инактивации ионизирующим излучением.

3. Состав для инъекций по п. 1, где указанный состав для инъекций дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, при этом вспомогательное вещество содержит достаточное количество соли или моносахарида для обеспечения того, чтобы значения осмотического давления суспензионного состава для инъекций и крови были одинаковыми или сходными.

4. Состав для инъекций по п. 1, где указанный состав для инъекций получен в виде порошка с помощью высушивания распылением или сублимационного высушивания и составляется в виде суспензии при применении.

5. Состав для инъекций по любому из пп. 1–4, где указанный состав для инъекций получен с помощью следующего способа: осаждение центрифугированием при 3000–5000 об/мин молочнокислых бактерий после их культивирования в традиционной жидкой питательной среде в течение 12–36 ч, последующее тщательное промывание осадка с составлением в суспензию необходимой концентрации и инактивация при температуре 120–122°С и давлении 0,1–0,2 МПа в течение 15–30 мин с получением состава для инъекций, содержащего инактивированные молочнокислые бактерии.