СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ИЗОНИАЗИД-ДЕКСТРАН Российский патент 1999 года по МПК A61K31/715 A61K31/455 

Изобретение относится к области органической химии, химии высокомолекулярных соединений, биохимии, а именно реакции ковалентной сшивки полисахаридов (на примере декстрана) с производными гидразина (на примере гидразида изоникотиновой кислоты, изониазида).

Необходимость данного изобретения продиктована потребностями медицины в разработке новых противотуберкулезных лекарственных препаратов повышенной эффективности на основе конъюгации распространенного противотуберкулезного препарата изониазида с гидролизуемыми (в т.ч. полисахаридными) носителями. Назначение конъюгации связывается с получением препаратов пролонгированного действия. Известны конъюгаты изониазида с производными поливинилпирролидона (1, 5, 8), поликонденсата формальдегида с производным бензальдегида (6), карбоксаметилсефадекса (7). Общим недостатком этих носителей может рассматриваться их низкая гидролизуемость в организме, возможность накопления внутри лизосом с провоцированием неблагоприятных последствий.

Среди методов конъюгации изониазида с декстраном известен окислительный путь, осуществляющийся в два этапа (9, 11):
1) окисление декстрана до диальдегиддекстрана,
2) присоединение изониазида по реакционноспособным альдегидным группам диальдегиддекстрана.

В разработке метода сшивки изониазида с декстраном в качестве отправной взята технология, представленная в изобретении Шкурупия В.А. и соавт. (11). Авторы проводили окисление декстрана периодатом натрия (0,03 М) с остановкой реакции с помощью этиленгликоля. Образовавшийся диальдегиддекстран осаждали этанолом и центирифугировали. Полученный диальдегиддекстран растворяли в воде, и к нему в слабокислой среде прибавляли водный раствор изониазида (0,09 М). По завершении реакции проводили восстановление конъюгата водным раствором боргидрида натрия в щелочной среде. Продукт осаждали этанолом и центрифугировали. В результате содержание изониазида в конъюгате достигало 30 моль/моль декстрана.

При воспроизведении данного метода мы столкнулись с теми трудностями, что продукт получается загрязненным неорганическими примесями и нестойким. Кроме того, для повышения терапевтической эффективности препарата представлялось целесообразным увеличить содержание действующего начала - изониазида в конъюгате.

Поэтому задачей изобретения явилась разработка метода конъюгации изониазида с декстраном, обеспечивающего повышенное содержание изониазида, достаточную чистоту и стабильность препарата.

Получение диальдегиддекстрана возможно с помощью иодной кислоты (10), периодата натрия и других окислителей (4, 11, 13). Выбранный нами способ обработки декстрана периодатом представляется более мягким в сравнении с действием иодной кислоты, однако, и он не лишен недостатка, связанного с возможностью частичной окислительной деградации декстрана (2). В этих условиях, вероятно, целесообразно использование в качестве исходного материала декстрана с молекулярным весом 40000 (декстран-40,), имеющего запас полимерности в сравнении с применявшимся ранее декстраном с молекулярным весом 28000-40000 (11).

В наших экспериментах обнаружено, что на перовом этапе конъюгации (реакции окисления декстрана) выделение диальдегиддекстрана при помощи только осаждения этанолом приводило к получению конъюгата, загрязненного неорганическими примесями (предположительно NaIO₄, NaIO₃ и NaI). Использование такого неочищенного диальдегиддекстрана в реакции конъюгации давало конечный продукт с низким содержанием изониазида, нестойкий при хранении, например, в отдельном опыте был получен продукт с содержанием изониазида 7 моль/моль декстрана, через 2 недели хранения при 4^oC содержание изониазида понизилось до 4 моль/моль декстрана.

Поэтому применили удаление непрореагировавшего периодата и других примесей с помощью диализа смеси против дистиллированной воды. Очистку осуществляли путем осаждения диальдегиддекстрана этанолом с последующим переосаждением и высушиванием из ацетона. Процедура диализа способствовала заметному увеличению чистоты конечного продукта, связыванию диальдегиддекстрана с изониазидом, стабильности конъюгата. Так, соотношение изониазид:декстран в конъюгате возросло с 7 до 20 моль/моль декстрана, а содержание изониазида в нем не изменялось по крайней мере в течение 1 года хранения препарата в холодильнике (4-6^oC).

При проведении реакции конъюгации нашли, что к раствору диальдегиддекстрана при pH 2,9 предпочтительно добавлять сухой изониазид в концентрации 0,3 моль/л, трехкратно превышающей стандартную (11). Эта модификация позволила повысить содержание изониазида в конъюгате до 32 - 35 моль/моль декстрана. Стабилизацию конъюгата восстановлением образующихся двойных связей (типа Шиффова основания) осуществляли добавлением боргидрида натрия в щелочной среде. Одновременно боргидрид восстанавливал непрореагировавшие с изониазидом альдегидные группы, полученные при окислении декстрана.

Повышенная очистка конечного продукта достигалась сочетанием диализа, осаждения конъюгата этанолом и промывки ацетоном.

Конечный продукт представляет собой растворимый в воде порошок желтовато-белого цвета.

Общий выход конъюгата - 32,4% от теоретического, расчет на декстран. Продукт содержит 30-35 моль изониазида в расчете на 1 моль декстрана-40, что выше, чем у других авторов (12). Концентрацию изониазида определяли спектрофотометрически (3).

Продукт устойчив при хранении в сухом виде при 4-6^oC по крайней мере в течение 1,5 лет. Снижение общего содержания изониазида в продукте или его отщепления не обнаружено. При нагревании до 100^oC препарат разлагается (не подлежит термостерилизации).

Таким образом, в предложенной нами методике конъюгации принципиально важными являются следующие моменты:
1) процедура обязательной очистки окисленного декстрана с помощью диализа до его осаждения (этанолом),
2) внесение в реакционную смесь изониазида в сухом виде в насыщающих концентрациях (0,3 М),
3) процедура диализа конъюгата перед осаждением этанолом.

Пример. Получение конъюгата изониазида с декстраном.

1. Получение диальдегиддекстрана.

К раствору 155 мг декстрана-40 ("Fluka", Швейцария) в 7,85 мл дистиллированной воды прибавляли 1,70 мл 0,2 М раствора NaIO₄, перемешивали на магнитной мешалке 45 мин при комнатной температуре. Приливали 2,1 мл чистого этиленгликоля, перемешивали 20 мин. Раствор подвергали диализу в течение 24 часов против 50 объемов дистиллированной воды, осаждали продукт добавлением 65 мл охлажденного (+4-6^oC) этанола в течение 24 ч. Взвесь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин (центрифуга К-23, "Janetzky"). Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход - 84 мг (54% теоретического).

2. Получение конъюгата.

К раствору 84 мг диальдегиддекстрана (pH 4,6) в 1,54 мл дистиллированной воды прибавляли 0,14 мл 5% CH₃COOH (pH 2,9), 75,6 мг твердого изониазида и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Прибавляли каплю спиртового раствора фенолфталеина и затем 0,5 N NaOH до розовой окраски (pH 8,0). После этого вводили 33,6 мкл буфера 1 М трис-HCl pH 7,5 и перемешивали 5 мин (окраска исчезала). Прибавляли 0,84 мл водного раствора NaBH₄ (4 мг/мл), перемешивали 30 мин. Раствор конъюгата диализовали 24 ч против 50 объемов дистиллированной воды. Продукт осаждали охлажденным этанолом (54 мл, 5 ч) и центрифугировали. Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход 50,8 мг (60% от теоретического, расчет на диальдегиддекстран).

Список литературы
1. Вавилин Г.И., Ильина Т.Б., Рабинович И.М., Кропачев В.А., Трухманова Л. Б. , Маркелова Т.М. // О возможности использования полимеров для пролонгирования действия тубазида в эксперименте. - Пробл. туб. - 1968. - N 4. - С. 74-77.

2. Гибиетис Я.Л., Зицманис А.Х., Спинце Б.А. // Способ получения диальдегиддекстрана. - Авт. свид. N 1530630.

3. Гребенник Л.И. // Об определении производных гидразида изоникотиновой кислоты и продуктов их превращения в организме. - Пробл. туб. - 1961. - N 4. С. 69-74.

4. Линденбаум Г. М. , Миргородская О.А., Москвичев Б.В. // Химическая модификация водорастворимых декстранов. -Хим. фарм. журн. - 1977. - т.11, N 6. - С.80-83.

5. Перельман А.Е., Княжецкий С.И., Вавилин Г.И., Кропачев В.А., Трухманова Л.Б. // Продолжительность сохранения активного гидразида изоникотиновой кислоты в организме экспериментальных животных после введения его полимерного азометинового производного. - Хим. фарм. журн. - 1977. - Т. 11, N 8. - С. 10-17.

6. Сокирко Т.А. // Фармакология пролонгированной формы изониазида. - Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Киев. - 1990. - 18 С.

7. Туркебаева К.А., Шипунова О.В., Кривцова А.Е., Мошкович С.А., Жубанов Б.А. // О возможности лечения туберкулеза полимерным изониазидом пролонгированного действия. - Пробл. туб. - 1990. - N 6. - С. 32-36.

8. Ушаков С. Н., Кропачев В.А., Трухманова Л.Б., Маркелова Т.М. // Полимерные азометиновые производные п-аминосалициловой кислоты и гидразида изоникотиновой кислоты. - Высокомолек. соед. - 1972.- Сер.А, Т.14, N 10. - С. 2023-2027.

9. Хомяков К. П., Вирник А.Д., Ушаков С.Н., Роговин З.А. // Синтез полимерных лекарственных соединений на основе производных декстрана. - Высокомолек. соед. - 1965. - Т.7, N 6. - С. 1035-1040.

10. Хомяков К.П., Пененжик М.А., Вирник А.Д., Роговин З.А. // Синтез диальдегид- и дикарбоксилдекстрана. - Высокомолек. соед. - 1965. - Т.7, N 6. С.1030-1034.

11. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Чернова Т.Г. // Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса. - Заявка на изобр. N 93-015116.

12. Шкурупий В.А., Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. // Изменения гранулемы при лечении туберкулеза пролонгированной формой изониазида в эксперименте. - Пробл. туб. - 1993. - N 1. - С.38-41.

13. Molteni L. // Dextran and Inulin Conjugates as Drug Carriers. - Meth. Enzymol. - 1985. - V.112. - Pt.A.- P.285-297.

Изобретение относится к органической химии, химии выcoкoмoлeкуляpных соединений, биохимии, монет использоваться при разработке новых противотуберкулезных лекарственных препаратов повышенной эффективности. Проводят окисление декстрана периодатом натрия, осаждение этанолом, конъюгацию полученного диальдегиддекстрана с изониазидом и восстановление образовавшегося Шиффова основания боргидридом натрия. Причем перед осаждением этанолом осуществляют диализ диальдегиддекстрана. Конъюгацию проводят путем внесения изониазида в сухом виде в количестве, обеспечивающем его концентрацию 0,3 моль/л, и осуществляют диализ раствора конъюгата перед его осаждением этанолом. Способ обеспечивает повышенное содержание изониазида, высокую чистоту и стабильность продукта.

Способ получения конъюгата изониазид-декстран, включающий окисление декстрана периодатом натрия, осаждение этанолом, конъюгацию полученного диальдегиддекстрана с изониазидом и восстановление образовавшегося основания Шиффа боргидриом натрия, отличающийся тем, что до стадии осаждения этанолом диальдегиддекстран подвергают диализу, конъюгацию проводят путем внесения изониазида в сухом виде в раствор диальдегиддекстрана в количестве, обеспечивающем его концентрацию 0,3 моль/л, после стадии восстановления осуществляют диализ раствора конъюгата и осаждение продукта этанолом.