СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА С НИЗКИМ УРОВНЕМ ФИБРОТИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ Российский патент 2002 года по МПК A61K31/455 A61K31/721 A61P31/06 

Изобретение относится к медицине (фтизиатрии) и химико-фармацевтической промышленности.

Традиционные противотуберкулезные препараты обладают выраженным профибротическим действием. Заживление очагов туберкулезного воспаления при химиотерапии характеризуется высоким уровнем склерозирования органов даже в сравнении с "естественным" затуханием процесса.

Давно ведется поиск противотуберкулезных лекарственных форм, препятствующих развитию избыточного поствоспалительного склерозирования в органах.

Известен противотуберкулезный препарат изониазид-декстран с молекулярной массой (ММ) 40 кД который, по сравнению с изониазидом характеризуется меньшим уровнем фибротических осложнений (Шкурупий В.А., Филимонов П.Н., Курунов Ю. Н., Панасенко С.Г., Пупышев А.Б. Исследование процессов фиброзирования в печени и легких при лечении лизосомотропным препаратом изониазида хронического туберкулеза у мышей / Пробл. туберкулеза. - 1999. - 1).

Подана заявка на изобретение "Конъюгат изониазид-декстрана и его применение в качестве противотуберкулезного препарата" авторов Шкурупия В.А., Курунова Ю. Н. , Пупышева А.Б., Панасенко С.Г., Козяева М.А., Шориной Г.Н., где показана противотуберкулезная активность препарата изониазид-декстран с ММ 65-75 кД. Данная заявка, однако, не содержит сведений об уровне фибротических осложнений, который характерен для данного препарата.

Сущность изобретения
Задачей заявляемого изобретения является создание средства для лечения туберкулеза с еще более низким уровнем фибротических осложнений по сравнению с известным средством. Исследования созданного препарата показали, что он характеризуется меньшим уровнем фибротических осложнений по сравнению с изониазид-декстраном с ММ 40 кД при использовании обоих в равных дозах по изониазиду и одинаковой схеме лечения.

Таким образом, предлагается эффективное средство для лечения туберкулеза с низким уровнем фибротических осложнений, представляющее собой конъюгат изониазида и декстрана, имеющий ММ 65-75 кД.

Конъюгат изониазид-декстран имеет следующую формулу:

где R₁ - Н - остаток глюкозы или полиглюкозильный остаток указанного на рисунке вида;
R₂ - остаток изониазида формулы
или гидроксильная группа.

Препарат применяется в разовых дозах по изониазиду согласно рекомендациям (Машковский М. Д. Лекарственные средства. В 2-х томах. - Вильнюс. - 1993. - Т.2. - С.283-284), но в интермиттирующем режиме - 2 раза в неделю.

Фиг.1 - объемная плотность коллагеновых волокон в БЦЖ-гранулемах в печени мышей.

Фиг.2 - содержание фиброзной ткани в печени мышей.

Примечание. На всех фигурах графических изображений: БЦЖ - группа контроля; КФИ (комплексная форма изониазида) - предлагаемый препарат.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с реализацией назначения
1. Получение конъюгата изониазид-декстран с ММ 65-75 кД.

Препарат может быть получен следующим способом:
Получение промежуточного продукта - диальдегиддекстрана. К раствору 537 мг декстрана с ММ 65-75 кД, например, 70 кД (декстран-70), в 27 мл дистиллированной воды прибавляли 250 мг NaIO₄ в 5,9 мл H₂O, перемешивали на магнитной мешалке 45 мин при комнатной температуре. Приливали 7,4 мл чистого этиленгликоля, перемешивали 20 мин. Раствор подвергали диализу в течение 24 ч против 50 объемов дистиллированной воды, осаждали продукт добавлением 228 мл охлажденного (4-6^oС) этанола в течение 24 ч. Взвесь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход - 296 мг (54% от теоретического).

Получение конъюгата. К раствору 296 мг диальдегиддекстрана (рН 4,6) в 5,2 мл дистиллированной воды прибавляли 0,5 мл 5% СН₃СООН (рН 2,9), 265 мг твердого изониазида и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Прибавляли каплю спиртового раствора фенолфталеина и затем 0,5 н. NaOH до розовой окраски (рН 8,0). После этого вводили 125 мкл буфера 1 М трис-НС1 (рН 7,5) и перемешивали 5 мин (окраска исчезала). Прибавляли 2,96 мл водного раствора NaBН₄ (4 мг/мл), перемешивали 30 мин. Раствор конъюгата диализовали 24 ч против 50 объемов дистиллированной воды. Продукт осаждали охлажденным этанолом (189 мл, 5 час) и центрифугировали. Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход - 60% от теоретического (расчет на диальдегиддекстран).

Конечный продукт представляет собой растворимый в воде порошок желтовато-белого цвета.

Общий выход конъюгата - 32,4% от теоретического, расчет на декстран. Весовое содержание изониазида в конъюгате составляет 6,79-9,16% (молярное соотношение изониазид/декстран 34,1-47,3). Концентрацию изониазида определяли спектрофотометрически.

Конъюгат изониазид-декстран устойчив при 4-6^oС при хранении в сухом виде по крайней мере в течение 1,5 лет. Снижения общего содержания изониазида в продукте или его отщепления не обнаружено.

С помощью спектроскопии протонного магнитного резонанса было установлено, что изониазид присоединен к декстрану одинарной C-N связью. Двойная связь C=N, группы СНО и СООН отсутствуют. Спектр протонного магнитного резонанса был записан в ИХКиГ СО РАН на ЯМР-спектрометре JEOL FX 90 Q. В инфракрасном спектре (записан ИНХ СО РАН на спектрофотометре SPECORD - IR) имеются полосы поглощения карбонильной группы и пиридинового кольца изониазида. Таким образом, спектральные данные вполне согласуются с химическим строением конъюгата.

2. Сведения, подтверждающие снижение уровня фибротических осложнений при использовании предлагаемого препарата
Работа выполнена на мышах-самцах линии BALB/c двухмесячного возраста, массой тела 20-22 г. В опытах использовано 90 животных. Их содержали на стандартной лабораторной диете, они имели свободный доступ к воде и пище. Перед проведением экспериментов животных в течение двух недель адаптировали к условиям содержания. Все экспериментальные воздействия и взятие образцов органов осуществляли в утренние часы (с 9 до 10 ч).

Диссеминированный туберкулезный процесс моделировали однократным интраперитонеальным введением животным вакцины БЦЖ (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва). Каждому животному вводили 0,5 мл вакцины на физиологическом растворе. У мышей подопытной серии через 1 месяц после заражения развивалось диссеминированное гранулематозное туберкулезное воспаление с поражением всех паренхиматозных органов, что указывало на генерализованность процесса. Животные были разделены на три группы. Первая группа - нелеченные - служила контролем. Мышей второй группы через 1 месяц после заражения начинали лечить в интермиттирующем режиме (2 раза в неделю) внутрибрюшинными инъекциями свободного изониазида в дозе 14 мг на 1 кг массы тела (Машковский М.Д., там же). Мышей третьей группы в те же сроки и в том же режиме лечили комплексной формой изониазида на декстрановой матрице (молекулярная масса препарата 65-75 тыс. Д). Лечение продолжали в течение 5 месяцев. Для исследования органы у животных второй и третьей групп получали через 1, 2, 3 и 5 месяцев от начала лечения, контрольной группы - через 1 и 5 месяцев с момента введения вакцины БЦЖ.

Объектом исследования служила печень.

Для морфологического исследования в каждой группе использовали по 8-10 мышей. Животных умерщвляли путем дислокации позвонков в шейном отделе.

Образцы печени для целей световой и электронной микроскопии брали из края левой латеральной доли и подвергали соответствующим стандартным обработкам согласно рекомендациям (Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 645 с.; Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии и гистологической техники. - М.: Медицина. - 1971. - С.243-254; Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. - Спб.: Наука, 1994. - 400 с.).

Морфометрическое исследование образцов печени проводили в соответствии с рекомендациями (Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.). Используя окулярную сетку из 214 квадратов, подсчитывали объемную плотность фуксинофильных коллагеновых волокон в процентах к площади гранулемы. Определяли содержание соединительной ткани в печени; в связи с тем, что у мышей всех экспериментальных групп объем коллагеновых волокон в печени был весьма незначителен, считали, что основная масса фиброзной ткани сосредоточена в гранулемах. Результаты морфометрического анализа представлены на фиг.1 и 2.

В печени животных во всех трех экспериментальных группах в динамике увеличивалось количество и возрастала степень фиброзирования туберкулезных гранулем. Темпы роста фиброзирования гранулем у животных, леченных конъюгированной формой изониазида, были ниже, чем у получавших свободную форму изониазида, а в контрольной группе - значительно ниже, чем в обеих группах леченных животных. Во все сроки наблюдения объем фиброзной ткани в гранулемах у животных, леченных конъюгированной формой изониазида, был меньшим в сравнении с получавшими свободный изониазид животными. Через 5 мес лечения по сравнению с 1 мес объемная плотность коллагеновых волокон в гранулемах печени у животных, получавших конъюгированную лекарственную форму изониазида, увеличилась в 3,7 раза, в группе животных, получавших изониазид, - в 6,6 раза, в контрольной группе - в 2,8 раза. Степень фиброзирования гранулем к концу эксперимента в обеих группах леченных животных была значительно выше, чем в контрольной группе, а при лечении комплексной формой изониазида в 1,84 раза ниже, чем у получавших свободный изониазид животных.

Для того чтобы на органном уровне оценить эффекты лечения на развитие склеротических процессов в печени, подсчитывали объем коллагеновых волокон на единицу площади среза печени. Обнаружили, что при лечении комплексной формой изониазида через 5 мес объем фиброзной ткани в печени оказался в 2 раза меньшим, чем у нелеченных животных, и в 3 раза меньшим в сравнении с лечением свободным изониазидом.

Полученные данные свидетельствуют о том, что степень фибротических осложнений при лечении комплексной формой изониазида значительно ниже, чем при лечении свободным изониазидом.

3. Сведения, подтверждающие получение технического результата
Эксперименты, позволяющие провести прямое сравнение предлагаемого препарата с прототипом, не проводили. Было проведено их косвенное сравнение на основе изучения эффектов изониазид-декстрана-40 (Филимонов П.Н. Морфологические особенности развития хронического диссеминированного воспаления в печени и легких при лечении лизосомотропной пролонгированной формой изониазида / Дис....канд. мед. наук. - Новосибирск. - 1996. - 158 с.) и предлагаемого препарата в сравнении с эффектами свободной формы изониазида.

Через 3 мес лечения изониазид-декстраном-40 степень фиброзирования туберкулезных гранулем была на 34% ниже, чем при лечении свободным изониазидом в течение этого периода. Через 3 мес лечения предлагаемым препаратом степень фиброзирования гранулем оказалась на 32% ниже, чем при лечении свободным изониазидом. В более поздние сроки эксперимента (5 мес) степень фиброзирования гранулем при лечении изониазид-декстраном-40 была на 18% меньше, чем у животных, леченных свободным изониазидом. При лечении туберкулезного процесса в эти же сроки предлагаемым препаратом степень фиброзирования гранулем оказалась на 46% меньше, чем при лечении свободным изониазидом. Таким образом, по мере увеличения сроков лечения предлагаемым препаратом отчетливо проявляется снижение уровня фиброзирования туберкулезных гранулем в сравнении с результатами лечения изониазид-декстраном-40.

Если сравнивать степень фиброзирования не только туберкулезных гранулем, а в целом органа (печени), то низкий профибротический эффект предлагаемого препарата по сравнению с изониазид-декстраном-40 еще более очевиден. Через 3 мес лечения изониазид-декстраном-40 объем фиброзной ткани в печени оказался в 1,5 раза меньшим, а при лечении предлагаемым препаратом - в 2,1 раза меньшим, чем при лечении животных свободным изониазидом в течение этого периода. При лечении животных в течение 5 мес изониазид-декстраном-40 объем фиброзной ткани в печени был в 1,9 раза меньшим, чем у леченных свободным изониазидом животных, а при лечении в эти же сроки предлагаемым препаратом объем фиброзной ткани в печени оказался в 3 раза меньшим в сравнении с результатами лечения изониазидом.

Изобретение относится к медицине, в частности к средству для лечения туберкулеза с низким уровнем фибротических осложнений, представляющему собой конъюгат изониазид-декстрана с молекулярной массой 65-75 кД, формулы:

где R₁-Н - остаток глюкозы или полиглюкозильный остаток указанного на рисунке вида;
R₂- остаток изониазида формулы

или гидроксильная группа. Средство характеризуется существенно меньшим уровнем фибротических осложнений по сравнению с изониазид-декстраном с ММ 40 кД при использовании в равных дозах по изониазиду и одинаковой схеме лечения. 2 ил.

Средство для лечения туберкулеза с низким уровнем фибротических осложнений, отличающееся тем, что оно представляет собой конъюгат изониазид-декстран с ММ 65-75 кД, формулы

где R₁-Н, остаток глюкозы или полиглюкозильный остаток указанного на рисунке вида;
R₂ - остаток изониазида формулы

или гидроксильная группа.