ШТАММ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SP. N 56 ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/14 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/14 C12R1/77 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма микромицета, используемого для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов, способные разрушать нефть и нефтепродукты в слабоминерализованных водах, однако применение этих штаммов с целью очистки высокоминерализованных нефтесодержащих сточных вод и буровых отходов, содержащих полимерные добавки, неизвестно.

Известен штамм актиномицета Actinomyces flavus, обладающий способностью усваивать углеводороды нефти. Однако данный штамм не способен разрушать нефть, нефтепродукты и буровые отходы в высокоминерализованных нефтесодержащих сточных водах и почве.

Известен штамм Streptormyces alboaxialis "с", используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктов в сточных водах, содержащих до 10% NaCl. Недостатком известного штамма является низкая эффективность очистки высокоминерализованной воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, штамм не способен очищать буровые отходы от нефти, нефтепродуктов в присутствии полимерных добавок, например омыленных синтетических жирных кислот и др.

Известны микроорганизмы, окисляющие различные нефтепродукты, например н-алканы C₁₀-C₄₀ (авторское свидетельство СССР N 525751, кл. C 12 N 3/00), дизельное топливо (авторское свидетельство СССР N 77226, кл. C 12 N 11/08), сырую нефть (авторское свидетельство CCCP N 803482, кл. C 12 N 11/08).

Известен способ разложения нефти и нефтепродуктов с использованием микромицетов рода Actinomucor elegans штамм NTC-405 АТСС 20613; Jeotrichum marlum, Thirumalachar sp. nov. ATCC 20614 патенты США N 4415662, кл. C 12 N 11/14, C 12 N 1/26, C 10 O 32/00; N 4415661, кл. C 12 N 11/00, C 12 N 11/26, C 12 N 1/14, C 10 N 32/10).

Недостатком этих способов является низкая скорость роста предлагаемых микромицетов, более сложные и дорогостоящие добавки-биостимуляторы в питательный раствор и более длительный период адаптации к нефтепродуктам, а также низкая скорость роста и степень биотрансформации тяжелых фракций нефти, ароматических углеводородов (фенола) и др. Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ АС 1339Д (патент РФ N 1805097 C 02 F 3/34, E 02 B 15/04). Недостатком известного штамма является низкая скорость утилизации нефти и неполная степень биотрансформации фракций нефти и токсичных органических добавок: омыленных синтетических жирных кислот и др. в высокоминерализованных средах.

Целью изобретения является получение нового штамма микромицета Fusarium sp. N 56, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти и органических добавок в буровой раствор.

Предлагаемый штамм Fusarium sp. депонирован в РАСХН, г. Санкт-Петербург и имеет регистрационный номер 56. Штамм микромицета получен путем селекции из природных образцов нефтесодержащих почв НГДУ "Туймазанефть" Республики Башкортостан. Для селекции 1 г почвы вносили в колбу объемом 250 мл, содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды и после дальнейшего разведения до 10⁵-10⁶ степени делали посевы на среду Чапека, CA 3^o Б. После 7 суток культивирования наиболее типичные колонии испытывали на способность расти на твердой минеральной среде Маккланга, г/л дистиллированной воды: NaNO₃ - 2,0; MnSO₄•7H₂O - 0,5; K₂HPO₄ - 1,0; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001; ZnSO₄ - 0,002; агар - 15, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии гексадекан. Для этого в чашки Петри разливали стерильную питательную минеральную среду. После того как среда застынет, стерильным пробочным сверлом делали лунку. В лунку вносили стерилизованный заранее гексадекан. Посев микроорганизмов производили штрихом. О росте судили после 15 суток культивирования по появлению колоний на штрихе. Наиболее активный штамм идентифицировали. Штамм хранится в лиофилизированном виде.

Штамм имеет следующую характеристику: oбразует хорошо развитый мицелий на сусле 3^oБ, а также среде Чапека следующего состава, г/л дистиллированной воды: NaNO₃ - 2; глюкоза - 20; K₂HPO₄ - 1,0; MnSO₄•7H₂O - 0,5; KCl-0,5; FeSO₄•7H₂O - 0,01.

Вегетативный мицелий не окрашен, молодые колонии белые или сероватые. По мере развития колонии приобретают серую окраску. Пигмент диффундирует в среду. Воздушный мицелий хрупкий, слегка пушистый, вначале сероватый, затем темно-серый. Конидиеносцы легко отделяются от гиф, легко ломаются, одиночные или ветвистые, бесцветные или слабо пигментированные, септированные; различной длины, прямые или изогнутые, светлые, гладкие, ветвистые.

Питательную ценность углеводов учитывали по массе образующегося с ним мицелия. Исследования показали, что особенно хорошо из числа cахаров усваивается глюкоза, хуже фруктоза, галактоза, L-арабиноза. Из дисахаридов лучше усваивается сахароза, чем лактоза.

Глюкозу окисляют в тесте Хью-Лайфсона. Не содержат арилсульфатазы, не разлагают целлюлозу, ксантин, эластин. Как правило, не разлагают гипоксантин, казеин, желатину, не гидролизуют крахмал.

Слабо используют муравьиную кислоту HCOOH. Щавелевая кислота COOH-COOH практически не потребляется и обладает токсичностью.

Хорошо усваивают жиры, предварительно расщепляя их на жирную кислоту и глицерин липазами. Из продуктов расщепления жиров Fusarium sp. N 56 раньше всего потребляет глицерин, а потом уже жирные кислоты: пальмитиновую, стеариновую, олеиновую.

На смесях углеводов рост Fusarium sp. N 56 заметно усиливается.

Хорошо усваивают маннит, глюконовую, сахарную кислоты.

Хорошо растут на среде с парафиновыми углеводородами: проявляют активный рост на индивидуальных н-алканах C₁₃-C₃₇.

Не обладают лецитиназной активностью, что указывает на то, что патогенные свойства у культур не должны проявляться.

Хорошо усваивают кислоты, особенно валериановую, хуже масляную и пропионовую.

Культура является одним из штаммов Fusarium, у которого обнаружены следующие свойства: использует галактозу, арабинозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, рамнозу, сорбит, сахарозу, глюкозу, лимоннокислый натрий, мочевину; не проявляет тирозиназную активность, нитрат-редуктазную активность, не растет в присутствии 7%-ного хлористого натрия. Не использует лактат натрия, ксилозу.

Аэробы, растут в диапазоне температур от 10 до 40^oC, оптимальная область от 25 до 30^oC. Растет в диапазоне pH = 4-8, оптимальная зона от 7 до 8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Биотехнологическая характеристика штамма Fusarium sp. N 56.

Изучена активность штамма при его выращивании на среде с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии сырой нефти Туймазинского месторождения и ее фракций и наиболее широко используемых добавок в буровой раствор: ОСЖК, КМЦ.

Для получения посевного материала используют среду Маккланга с гексадеканом.

Исследования проводились по следующей методике.

Пример 1. Минеральную среду Маккланга разливали по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин. Предварительно простерилизованную нефть вносили в количестве 1 мас.%, засевали 3 об.% бактериальной взвеси. Выращивание осуществляли на термостатированной качалке при 180 об/мин и температуре 30^oC. Опыты ставились в трех повторностях. Контролем служили: минеральная среда с культурой без нефти, минеральная среда и нефть без бактерий. По истечении 36 ч в опытных колбах наблюдается значительное уменьшение количества нефти. О биотрансформации нефти судили спектрофотометрически на спектрофотометре UR-20 при 2923 см^-1, предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом. Кроме того, ежесуточно определяли количество жизнеспособных клеток методом Коха (Теппер В.3., Шильникова Г. И. Практикум по микробиологии.-М.: Колос, 1979, 211 с.), а также биомассу весовым методом на мембранных фильтрах. Для этого мембранные фильтры N 1 предварительно доводили до постоянного веса. Результаты приведены в табл. 1 и 2.

Как видно из табл. 1, скорость роста микромицетов выше скорости роста с Rhodococcus erithropolis AC 1339Д и составляет через 36 ч 5•10⁸ кл/мл (нач. 1-10⁶ кл/мл), а прирост биомассы за это же время превышает 0,65 г/л. Степень биоразложения нефти за 36 ч в среде с Fusarium sp. N 56 на 20% выше, чем в среде с Rhodococcus erithropolis AC 1339Д (табл. 2).

Пример 2. В серии опытов штамм микромицетов выращивали в минеральной среде Чапека с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии гексадекана, дизельного топлива, сырой нефти, мазута, КМЦ в количестве 1 мас.%; ОСЖК - 0,1 мас.%. Условия засева и выращивания описаны выше. Культивирование проводили в течение 48 ч. О биодеградации дизельного топлива, нефти, мазута судили путем количественного анализа методом экстракции этих соединений четыреххлористым углеродом с помощью измерения оптической плотности экстракта при 2923 см^-1 на спектрофотометре UR-20, а гексадекана при 1460 см^-1.

О биодеградации ОСЖК судили по его остаточному количеству, которое определяли известным весовым методом после экстракции четыреххлористым углеродом.

В результате исследований выявлено, что предлагаемый штамм Fusarium sp. N 56 способен биотрансформировать не только легкие фракции нефти, гексадекан и дизельное топливо, но и тяжелую фракцию нефти - мазут, а также буровые реагенты (ОСЖК и КМЦ). После 48 ч культивирования микромицетов степень очистки достигает для гексадекана в среднем 90%, дизельного топлива - 50%, нефти - 87%, мазута - 49%, ОСЖК - 80% (см. чертеж).

О степени биодеградации КМЦ судили косвенно по приросту общей биомассы микроорганизмов, изменению содержания редуцирующих cахаров в культуральной жидкости, динамике активности дегидрогеназы в культуральной жидкости и изменению pH среды. Для сравнения использовался известный штамм Rhodococcus erythropolis 1339 Д и ассоциация микроорганизмов Rhodococcus erythropolis 1339 Д+Fusarium sp. N 56. Результаты исследований представлены в табл.3.

Установлено, что вышеназванные микроорганизмы способны интенсивно деградировать КМЦ. Свидетельством этому служит активный прирост общей микробной биомассы. Tак, через 10 суток в среде с монокультурами биомасса увеличилась в среднем в 1,6 раза, а в среде с ассоциацией - в 2,5 раза.

Через пять суток культивирования наблюдался значительный прирост количества редуцирующих cахаров, причем максимальное количество их образуется в среде с ассоциацией микроорганизмов. Далее наблюдается закономерное уменьшение количества редуцирующих сахаров, которое объясняется тем, что они как промежуточные продукты ферментативного гидролиза КМЦ вовлекаются в дальнейший каскад биохимических превращений вплоть до образования микробиологического белка.

О биодеградации КМЦ свидетельствует и высокий уровень активности дегидрогеназы в культуральной жидкости. Самое высокое значение обнаружено в опыте с ассоциацией микроорганизмов: Rhodococcus erythropolis 1339 Д + Fusarium sp. N 56 - 0,53 мг формазана.

Пример 3. Изучали влияние содержания NaCl 1,3,5% на биотрансформацию нефти и ОСЖК. Начальное количество нефти составляло 1 мас.%, ОСЖК - 0,01 мас. %. Культивирование проводили в течение трех суток. Инокуляцию микромицета и культивирование микромицета проводили по вышеописанной методике на минеральной среде (табл. 4).

Как видно из табл.4, микромицеты способны активно биотрансформировать нефть и ОСЖК в среде с NaCl до 5%. При этом степень окисления нефти (1 мас. %) после трех суток культивирования составляет 40%; ОСЖК 0,1 и 0,05 мас.% - 30 и 20% соответственно.

Пример 4. Проводили изучение активности штамма Fusarium sp. N 56 при разложении нефти и ОСЖК в почве. Для этого в фарфоровые чашки объемом 0,2 л помещали по 100 г чернозема. Влажность почвы доводили до 60% от полной влагоемкости. В первую серию чашек вносили нефть - 1 мас.%, во вторую ОКО - 0,5 мас. %. Посевной материал вносили из расчета 5% по объему. Контролем служили серии чашек без инокуляции. Плесневый гриб культивировали при комнатной температуре. Время культивирования - 40 суток. Количественный учет биоразложения нефти и ОСЖК вели известным весовым методом (Лурье Ю.Ю. Унифицированные методы анализа вод.-М.: Химия, 1973, 215 с.), предварительно экстрагировав загрязнители четыреххлористым углеродом. Результаты исследований приведены в табл. 5.

Таким образом, предлагаемый штамм Fusarium sp. N 56 остается активным и почве. Биоразложение нефти через сорок суток культивирования составляет 77,53%. В контроле естественная убыль нефти составляет 2,62%.

Пример 5. Очистка стоков Новоуфимского нефтеперерабатывающего завода.

Посевной материал выращивали в жидкой минеральной среде Чапека. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли гексадекан в количестве 3% по объему. Для этого среду разливали по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизовали при 1 атм. в течениe 30 мин. Гексадекан стерилизовали отдельно и вносили перед посевом. Микроорганизмы вносили путем смыва с косячков. Выращивание микромицета осуществляли на термостатированной качалке при 95 об/мин, и температуре 30^oC. Посевной материал выращивали в течениe 3 суток. Два литра сточной воды, содержащей 0,05 мас.% ОСЖК, наливали в лабораторный аэротенк объемом 5 л. Вносили посевной материал в количестве 5% от объема. При помощи 5%-ного раствора NaHCO₃ доводили pH до 7. В аэротенк при помощи компрессора продувался воздух в количестве 15-20 л в минуту. О биодеструкции ОСЖК судили по его остаточному количеству, которое определяли известным весовым методом после экстракции четыреххлористым углеродом, и фракционному составу ОСЖК и продуктов его биоразложения, который определяли на масс-спектрометре МИ 12-01Б (при давлении 10^-7 мм рт. ст., температуре от 20 до 500^oC). Косвенно о биоразложении ОСЖК в водной среде судили по приросту численности микроорганизмов и увеличению биомассы. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что предлагаемая культура Fusarium sp. N 56 способна очищать воду от ОСЖК (при этом через 14 суток культивирования процент биоразложения ОСЖК составил 85,143%) и может быть использована при бурении нефтяных и газовых скважин для биоочистки отработаного бурового раствора от ОСЖК. Предлагаемая культура Fusarium sp. N 56 может быть также использована для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов при аварийных разливах нефти в нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей промышленности, при транспортировке нефти.

Изобретение относится к нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленностям и может быть использовано при аварийных разливах нефти и утилизации нефтепродуктов. Предлагается новый штамм микромицета Fusarium sp. N 56, характеризующийся высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти и органических добавок в буровой раствор. Технический результат изобретения-повышение эффективности очистки от нефтезагрязнений. 6 табл. 1 ил.

Штамм микромицета Fusarium sp. N 56 (депонирован во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. С. -Петербург) для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.