ШТАММ ARTHROBACTER SP. ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/06 

Изобретение относится к миробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, которые могут быть, например, использованы для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ B-3078 (36a-1), Rhodococcus luteus ВКПМ В-3077(25) и Micrococcus flavus ВКПМ B-3079 (53) /ав. св. 1493666, C 02 F 3/34, 1989/.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материально и -энерго затратах.

Наиболее близким аналогом является штамм бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1339Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов /ав. св. 1805097, C 02 F 3/34, 1993/. Недостатками известного штамма являются недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Целью изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Arthrobacter sp, OC-1, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики" под номером Ас - 1556.

Выделение штамма осуществлялось путем высева исходных образцов вод на мясо-пептонный агар с 0,5% нефти с предварительным пассивированием исходных образцов через жидкую среду Раймонда с нефтью.

Хранится штамм на агаризованных питательных средах при температуре 6-8^oC в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки и клетки округлой формы, расположенные преимущественно парами, а также по одиночке, реже соединенные в цепочки по 3 и более клеток. Культура полиморфна. Встречаются ветвящиеся цепочки и палочки, расположенные под углом друг к другу, а также отдельные более мелкие кокковидные клетки и цисты. Клетки подвижные, образуют капсулу, спор не образуют. Размеры клеток варьируют в пределах (0,7-0,8)-(0,8-2,5) мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2-е суток роста при 30^oC образует колонии плоские, круглые с матовым слегка приподнятым центром и полупрозрачным ровным опалесцирующим на свету краем. На МПА, содержащем вместо глюкозы 0,5% нефти, образует сильно выпуклые, круглые, блестящие, беловато-кремового цвета колонии. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде выпуклых слизистых образований беловато-кремового цвета, с маслянистым блеском.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаруживалось.

На мясо-пептонном бульоне при 30^oC через 3-е суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, а также небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, пленка на поверхности среды. Оптимум роста при 28-30^oC, pH 6,8-7,2.

На минеральной среде Раймонда с глюкозой образует беловатый тонкий осадок, слегка опалесцирующую муть в толще среды и тонкое пристеночное кольцо.

На минеральной среде Раймонда с нефтью в качестве единственного источника углерода наблюдается легкая опалесцирующая муть в толще среды.

Активность штамма определяли по среде Раймонда с нефтью визуально по степени деградации нефти.

Составы среды для размножения штамма следующие; г/л:
Мясо-пептонный ангар:
Мясная вода - 100
Агар - 20
NaCl - 5
Пептон - 10
Глюкоза - 7
Вода водопроводная - Остальное до 1 л
Агаризованная среда Раймонда с нефтью:
Na₂CO₃ - 0,1
CaCl - 0,01
MnSO₄ - 0,02
FeSO₄ - 0,01
MgSO₄ - 0,2
Na₃Cl - 2,0
NaCl - 5,0
Na₂HPO₄ - 1,5
KH₂PO₄ - 1,0
Агар - 20,0
Мясо-пептонный бульон - 500,0
Вода дистиллированная - Остальное до 1 л
Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 28-30^oC, pH 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 ч.

Состав ферментационной питательной среды, %:
Кормовые дрожжи (БВК) - 2
Кукурузный экстракт - 1
Культура Arthrobacter sp ВКПМ Ac - 1556 не патогенна для теплокровных животных.

На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляете (2-3)•10¹⁰ кл/мл, активность на среде Раймонда с нефтью - на 5-е сутки биодеградация нефти отмечается с разведением 10¹-10¹⁰. Активность на среде Раймонда с нефтью определяли визуально по степени деградации нефти.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб растет в диапазоне 18-30^oC. Крахмал гидролизует слабо, молоко не пептонидирует, желатин не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленном средой Раймонда в соотношении 1:1, с NaCl в концентрации 0,5 и 1,0%. При выращивании на средах с 5% NaCl наблюдается очень легкое помутнение среды, образование пристеночного кольца. При концентрации NaCl 10, 15, 20% рост отсутствует.

Отношение к источникам углерода.

Штамм ассимилирует углеводы с образованием кислот: из гексоз - глюкозу; из полисахаридов - слабо крахмал и из спиртов - маннит. При этом наблюдается подкисление среды от pH 7,0 до 5,5. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. На средах с арабинозой и лактозой рост не наблюдался.

Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (C₁₀-C₁₃), гексадекане и сырой нефти; причем рост в этом случае наблюдается главным образом на границе раздела фаз. На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть и парафины в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом (NaNO₃, NH₄NO₃, NH₄Cl), когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода.

Примеры конкретного использования.

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями, а именно способностью к активному росту на средах с углеводородами (нефть, парафин, гексадекан).

Пример 1.

Анализировалась способность штамма Arthrobacter sp ВКПМ Ac-1556 к росту и образованию метаболитов (жирных кислот) при выращивании его на смеси жидких парафинов (C₉-C₂₂) и гексадекана. Углеводороды стерилизовались отдельно при 1 ати 30 мин и стерильно добавлялись в концентрации 5% к агаризованной среде Раймонда, указанной выше.

Среда разливалась в качалочные колбы емкостью 300 мл по 100 мл среды. Колбы инокулировались на качалке с 350 об/мин суспензией штамма Arthrobacter sp, полученной смывом со скошенного агара и содержащей 2,5•10¹⁰ кл/мл.

Культивирование осуществляли в качалке при температуре 30^oC в течение 14 суток. Обнаружено, что заявляемый штамм активно образует жирные кислоты при выращивании на углеводородах в следующих количествах:
в культуральной жидкости, мкг/л
С_16:0 - 99,8
С_16:1 - 2,20
С_18:0 - 111,70
С_18:1 - 8,0
в углеводородах, мкг/л
С_16:0 - 382
С_16:1 - 115
С_18:0 - 763
С_18:1 - 167
Следует отметить, что большая часть жирных кислот C₁₆-C₁₈ растворена в углеводородах.

Значение pH к концу культивирования снизилось от первоначального 7,1 до 5,0, что дополнительно указывает на активную жизнедеятельность штамма при росте на углеводородных субстратах, что подтверждает наличие активного роста микроорганизмов на нефтесодержащей среде (см. таблицу).

Пример 2.

Были поставлены опыты по определению степени биодеградации сырой нефти под воздействием штамма Arthrobacter sp. Культурой, содержащей 9,5•10⁹ кл/мл, были засеяны колбы со средой Раймонда (100 мл среды Раймонда в 300 мл конических колбах) с 5% нефти Сосновского месторождения и инкубировали на качалке 30 дней.

Через 30 дней нефть в колбах изменяла свою прежнюю консистенцию, хотя культуральная жидкость была прозрачна.

pH культуральной жидкости снизился от 7,1 до 5,5, что подтверждает наличие жизнеспособности активно развивающихся на нефти клеток микроорганизмов.

Результаты деструкции учитывались по исчезновению нефтяной пленки.

Через 30 дней наблюдалось на 98-99% исчезновение нефтяной пленки. Результаты деструкции приведены в таблице. В процессе эксперимента изменялось содержание нефти и углеводорода.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Arthrobacter sp ВКПМ Ac-1556 может быть достигнута интенсивная деградация нефти при высоком содержании ее (до 15%) к объему загрязненного субстрата и он может быть использован при удалении нефтяных загрязнений с поверхности почв и водоемов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, которые могут быть использованы для очистки загрязненных поверхностей. Штамм бактерий Arthrobacter sp. ОС-1 выделен из воды, загрязненной нефтью, депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики" под номером Ас-1556. На производственной среде продуктивность биомассы составляет (2-3)•10¹⁰ кл/мл, активность на среде Раймонда с нефтью на 5-е сутки биодеградации нефти отмечается с разведением 10¹-10¹⁰. Степень биодеградации по сырой нефти под воздействием штамма в течение 30 дней составляет 98-99%. Штамм может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почв и водоемов. 1 табл.

Штамм бактерий Arthrobacter sp. ВКПМ Ас-1556, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов.