Штамм бактерий RноDососсUS еRYтнRороLIS, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов Советский патент 1993 года по МПК C02F3/34 E02B15/04 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, используемого для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий Rhodococcus erythropolls, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти.

Предлагаемый штамм депонирован в В КМ и имеет регистрационный номер Rhodococcus erythropolis № 2 BKM AC-1399

д. Штамм Rhodococcus erythropolls получен путем селекции из природных образцов нефтесодержащих почв Крайнего Севера в районе г. Надыма, Для селекции 1 г почвы вносили в колбу объемом 250 мл, содержащей 99 мл стерильной воды, и после даль- . нейшего разведения до 109-106 степени делали посевы на МПА, среду Чапека, СА, (3-4° и 5-6°Б), После 7-15 суток культивирования наиболее типичные колонии испытывали на способность расти на твердой минеральной среде. Маккланга, г/л диет, воды: МаМОз - 2,0; MnS04 7НгО - 0,5,

СО

$

о ю VI

Fe2(S04b - 0,001, К2НР04 - 1,0, ZnSCU - 0,002, агар - 10-15, содержащей в качестве единственного источника углерода жидкий парафин. Для этого в чашку Петри разливали стерильную питательную минеральную среду. После того как среда застынет стерильным пробочным сверлом делали лунку. В лунку вносили стерильный парафин. Посев микроорганизмов производили штрихом. О посеве судили после 15 суток культивирования по появлениям колоний по штриху. Наиболее активный штамм идентифицировали. Штамм хранят в лиофилизиро- ванном виде.

4 Штамм имеет следующую характеристику. Морфологические признаки: клетки после 18 часов культивирования палочко- видные, короткие, редко, но всречаются с боковыми ветками. Через 33 часа происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура грамположительна, имеет IY тип клеточной стенки, содержит галактозу, арабинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на МПА и МПА + СА (1:1) окрашены в палево- розовые цвета, Форма колоний округлая, размер колоний (средний( - 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к эмульгированию равномерная. Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка.

Физико-биологические признаки. Отношение к источникам углерода: используют галактозу, арабинозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, рамнозу, сорбит, сахарозу, глюкозу, лимоннокислый натрий. Не разлагает целлюлозу, крахмал.

Отношения к источникам азота: использует мочевину, аммонийный азот, нитратный азот.

Не разжижает желатину, не разлагает казеин.

Не обладает лецитиназной, тирозиназ- ной и нитратредуктазной активностью. Не растет в присутствии 7% NaCI.

Не требует в среде присутствия факторов роста.

Аэроб.

Растет в диапазоне температуры от 10 до 40°С, оптимальная область от 25 до 30°С.

Растет в диапазоне рН 4-9, оптимальная зона от 7 до 8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Биотехническая характеристика штамма Rhodococcus erythropolis.

Изучена активность штамма при его выращивании на среде с добавлением в качестве единственного источника углерода сырой нефти или ее фракций.

Для получения посевного материала используют среду Маккланга. Среду разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 минут. Засевают 3% бактериальной взвеси, нефть вносят стерильно в количестве 1% вес. Выращивание осуществляют на термо0 статированной качалке: 180 об/мин, 1°зо°с.:

Опыты ставятся в трех повторностях. Контролями служат: минеральная среда с культурой без нефти; минеральная среда 5 и нефть без бактерий.

По истечении двух суток в опытных колбах происходит исчезновение нефти, образуется муть, что не наблюдается в контрольных колбах.

0 о биотрансформации нефти судят элек- трофотометрически на приборе ЙЯ-20 при 2923 , предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом.

Кроме того ежесуточно определяют ко- 5 личество жизнеспособных клеток методом Коха, а также биомассу весовым методом на мембранных фильтрах. Для этого мембранные фильтры № 1 предварительно доводят до постоянного веса. Результаты приведе- 0 ны в табл. 1. Как видно из табл. 1, длительность лаг. фазы составляет менее 1 суток. Экспоненциальная фаза продолжает около 2 суток, стационарная - 3 суток/затем происходит 5 отмирание культуры. Прирост биомассы на 2 сутки составляет 0,075 г/л. Данные по биодеструкции нефти представлены в табл. 1,-

Как видно из табл. 2, наибольшая сте- 0 пень биоразложения нефти (80-87%) достигается на 2-3 сутки.

П р и м е р. В серии опытов штамм выращивали в минеральной среде с добав- Лением в качестве единственного источника 5 углерода: парафин, дизельное топливо, нефть, универсин В, содержащий тяжелые нефтяные остатки: гудрон и экстракты масляных фракций,

Минеральную среду Маккланга (состав 0 приведен выше) разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Засевают из расчета 3% по объему бактериальной взвеси. В качестве единственного источника углерода 5 добавляют парафин, дизельное топливо, нефть, универсин В в количестве 1, 2, 3, 4. 5% вес.

Условия выращивания описаны выше. О биоразложении нефти, универсина, дизельного топлива судят путем количественного анализа методом экстракции этих соединений четыреххлористым углеродом с последующим измерением оптической плотности экстракта при 2923 на спектрофотометре HR-20, а парафина при 1460 .

На чертеже представлены результаты изучения зависимости, биодеструкции парафина, дизельного топлива, нефти и уни вёрсйна В в воде через 40 часов (1 - парафин, 2 - дизельное топливо, 3 - нефть, 4-универсин В).

Из приведенных данных видно, что предлагаемый штамм Rhodococcus eryjthropoHs Ns 2 В КМ АС 1339Д способен использовать не только легкие фракции нефти, такие как парафин, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, такие как парафин, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, как уни- верЫн В, т.е. разлагать широкий спектр углеводородов. Причем штамм не теряет свою окислительную активность при содержании парафина, дизельного топлива, нефти v универсина при 5% вес. Максимальная био|деструкция наблюдается при содержаний исследуемых нефтепродуктов в количестве 1 % вес. и составляет для парафина - 85%, дизельного топлива - 80%, нефти - 78%, универсина - 45%.

Проводили также изучение активности штамма при разложении нефти в почве. Для в пробирку объемом 50 мл вносят песок в количестве 25 г., стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 мин. Вносят минеральное удобрение диам- мофрс из расчета 0,03% вес и нефть в количестве 0,41 г на 25 почвы. Посевной материал вносят из расчета 3% по объему бактериальной взвеси. Контролем служат пробирки без бактерий. Микроорганизмы культивируются при комнатной температуре, время культивирования 40 суток. Количественный учет биоразложения нефти ведуУ спектрофотометрически на приборе ИЯ-2|0 при 2923 , предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом. В табл. 3 приведены результаты исследований.

Таким образом предлагаемый штамм Rhoo ococcus erythropolis № 2 ВКМ АС- 1339Д остается активным и в почве. Биоразложение нефти через 40 суток культивирования составляет76%. В контроле естественная убыль нефти оставляет 0,01 г.

Пример. Очистка стоков Уфимского нефтеперерабатывающего завода им. XXII съезда КПСС.

Посевной материал выращивают в жидкой минеральной среде Маккланга. В качестве единственного источника углерода добавляют жидкий парафин в количестве 5 3% вес. Для этого среду разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 мин. Парафин стерилизуют отдельно и вносят перед посевом. Микроорганизмы вносят путем

0 смыва из косячков. Выращивание осуществляют на термостатированной качалке: 180 об/мин, t° -30°C. Посевной материал выращивают в течение 1 суток. 2 л сточной воды, содержащей 100 мг/л нефти, наливают в

5 лабораторный аэротенк объемом 5 л. Вносят посевной материал в количестве 5% от объема. При помощи 5% раствора МаНСОз доводят рН до 7. В аэротенк при помощи компрессора продувается воздух в количе0 стве 15-20 л в минуту. О биоочистке сточной воды от нефти судят спектрофотометрически на приборе HR-20 при 2923 , предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом.

5 Из табл. 4 видно, что предлагаемая культура Rhodococcus erythropolis способна очищать и реальные стоки, при этом за 24 часа содержание нефти уменьшается с 100 мг/л до 10 мг/л.

0 Пример. Очистка почвы от нефти и нефтепродуктов.

Отбираются нефтезагрязненные пробы почвы у буровой скважины. Содержание нефти и нефтепродуктов в почве составляло

5 3% вес. Отобранная почва насыпается в эксикатор. Для сохранения влажности на дно эксикатора ставят стакан с водой. Для воздухообмена с крышки эксикатора отводится . стеклянная трубка, которая закрыта ватным

0 фильтром.

-Для -очистки почвы готовят водную смесь, включающую штамм Rhodococcus erythropolis с плотностью 105-106 клеток в 1 мл и диаммофос из расчета 0,03%. Микро5 организмы выращивают в жидкой минеральной среде Маккланга с парафином, Приготовленную водную смесь равномерно распределяют на нефтезагрязненную почву из расчета 1 л на 1 м . По истечении 40 и 60

0 суток оценивают количество оставшейся нефти .методом спектрофотометрии.

В результате исследований выявлено количество нефти и нефтепродуктов после 5 40 суток культивирования уменьшается с 3% до 1%, а после 60 суток до 0,21%.

Таким образом, предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis способен очищать реальную нефтезагрязненную почву.

Формула изобретения Штамм бактерий Rhodococcus erythropolls BKM Ас 1339Д, используемый

для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Использование: очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм Rhodococcus erythrop.olls BKM Ас-1339Д имеет следующую характеристику: клетки после 18 ч культивирования палочковидные, короткие, редко, но встречаются с боковыми ветками. Через 33 ч происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура крамположительна, имеет IY тип клеточной стенки, содержит галактозу, ара- бинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на МПА и МПА + СА (1:1)окрашены в палево-розовые цвета. Форма колоний округлая, размер колоний (средний) 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к эмульгированию равномерная. Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка. Штамп бактерий характеризуется высокими скоростью.утилизации нефти и степенью биотрансформации ее тяжелых фракций. 1 ил., 4 табл. ё

Т а б л и ц а 1 Результаты роста микроорганизмов в среде с нефтью

Табл ица2 Влияние длительности культивирования на степень биоразложения нефти

Результаты биоразложения нефти в почве (

Результаты очистки реальных стоков

ТаблицаЗ

Таблица4