СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОСИМБИОЗА РАСТЕНИЕ/БАКТЕРИЯ, СПОСОБНОГО К АЗОТФИКСАЦИИ В ЧАСТЯХ РАСТЕНИЙ Российский патент 1999 года по МПК A01H4/00 A01G7/00 

Данное изобретение касается способа получения нового типа растений, способных фиксировать азот также в их листьях.

Известно, что азот является основным лимитирующим фактором культивирования сельскохозяйственных растений, поскольку использование азота с помощи удобрения является хотя и эффективным, но очень дорогим и сопровождается сильным загрязнением окружающей среды. Всемирно распространяющаяся концепция, концепция "поддерживаемого развития" отдает предпочтение продукции, основанной на внутренних ресурсах, вместо использования внешних ресурсов. В соответствии с этим предпочтительно обеспечение предоставления азота растениям путем использования возможностей, заключенных в биологической азотфиксации, вместо применения удобрений [Plant and Soil 141, 1-12 /1992/]. Однако только некоторые прокариоты /диазотрофы/ способны фиксировать атмосферный газообразный азот.

Так называемые аэробные азотфиксирующие бактерии, члены родов Azomonas, Asotobacter, Beijerinckia и Derxia, принадлежащих к семейству Azotobacteraceae [Bergey's Manual of Determinative Bacterology, 8th ed., Williams and Wilkius, Baltimore, page 253 /1974/], которые способны к эффективной азотфиксации даже при атмосферных уровнях кислорода, в природе не способны включаться во внутренние пространства тканей растений [Azotobacteraceae: the Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria, Academic Press, New York /1979/] и распространяться в межклеточных пространствах, хотя можно показать, что при оседании на корнях или на наружных поверхностях листьев эти виды способны обеспечивать потребность в азоте некоторых растений до значительной степени или полностью [J. Gen. Microbiol. 71, 103-116 /1972/; J. Gen. Appl. Microbiol. 25, 261-271 /1979/; Car. J. Bot 69, 2296-2298 /1991/. Только так называемые микроаэрофильные диазотрофы, фиксирующие азот при низких уровнях кислорода, способны образовать внутриклеточные эндосимбиозы [Nitrogen-fixing Bacteria in Nonleguminous Crop Plants, Sci. Tech. Publishers/Springer-Verlag, Madison, WI, pp. 84-88 /1987/], которые однако могут фиксировать газообразный азот только в корнях, т.е. далеко от места фотосинтеза.

До настоящего времени только два исследования были проведены для совместного культивирования видов Azotobacter с клетками растений в условиях in vitro.

В первом эксперименте [Nature 252, 393-395 /1974/] аденин-ауксотрофный мутантный штамм Azotobacter vinelandii культивировали совместно с клетками моркови на содержащей сахарозу среде, которая не содержала азота или содержала азот в количестве, недостаточном для роста растений. Полученные таким образом смешанные каллусные культуры, выращиваемые в течение 18 месяцев, обнаружили азотфиксирующую активность и среди живых клеток растений можно было наблюдать бактерии. Однако этот способ имеет несколько недостатков: в нем применяли ауксотрофный мутантный штамм вида Azotobacter, который трудно выделить вследствие высокого числа "хромосом" [J. Bacteriol., 138, 871-877 /1979/] ; культуры растут медленно; система нестабильна в присутствии азота; растения не могли быть регенерированы; способ применим только для небольшого числа интенсивно исследуемых видов вследствие малого числа ауксотрофных штаммов.

В другом эксперименте [Z. Pflanzenphysiol 95, 141-147 /1979/] бактерии подавляли ткань растений и разрушали ее. Поэтому было невозможно культивирование в течение длительного периода и развитие азотфиксирующего растения.

Целью данного изобретения является преодоление недостатков известных в этой области способов и разработка способа, при помощи которого можно легко получить в условиях in vitro растение, листья которого способны также к азотфиксации и которое содержит бактерии, принадлежащие к семейству Azotobacteraceae, в его внутренних пространствах.

Данное изобретение основано на обнаружении факта, что в условиях in vitro можно включать прототрофные быстро растущие бактерии семейства Azotobacteraceae, способные к азотфиксации даже при атмосферных уровнях кислорода, во внутренние пространства растения и заселять ими внутренние пространства при добавлении источников питания, обеспечивающих менее благоприятное снабжение питательными элементами, вместо оптимального снабжения, применяемого в практике для клеток растений. В частности, было обнаружено, что при использовании такого снабжения питательными веществами растительные и бактериальные клетки могут расти равномерно и сбалансированно, тогда как на обычных средах, применяемых для культивирования растительных материалов in vitro, бактерии опережают в росте ткани высшего растения и разрушают их вследствие того, что скорость их роста на порядок выше скорости роста клеток растений.

Кроме того, данное изобретение основано на обнаружении того, что хорошо сбалансированный рост обоих партнеров может поддерживаться во время культивирования in vitro путем применения основного источника /источников/ углерода, который /которые/ может (могут метаболизироваться только растением, т.е. который метаболизируется клетками растения, и только продукты метаболизма растения могут использоваться для бактериального роста до степени, требуемой для одновременного развития. Обнаружение этого факта является неожиданным, т. к. при совместном культивировании рост культур обеспечивается источниками углерода, которые используются клетками растения только в низкой степени и обычно применяются только для исследований метаболизма и лишь в редких случаях для культур растений in vitro.

Данное изобретение основано также на обнаружении факта, что обеспечение оптимального источника азота в питательной среде также необходимо для растительных материалов, культивируемых совместно с азотфиксирующими бактериями, для развития из культур целого растения с высокой вероятностью и высоким выходом. Это означает, что симбиотические отношение in vitro не являются необходимыми для образования симбиотических отношений in vivo и, следовательно, вышеупомянутая цель может быть достигнута также при помощи несимбиотического совместного культивирования. Обнаружение этого факта является удивительным, поскольку до настоящего времени преобладало мнение, что в случае такого совместного культивирования растительные культуры должны культивироваться на не содержащей азота среде или на средах с низким содержанием азота для того, чтобы сделать рост тканей растения зависимым от фиксации азота бактериями.

Наконец, данное изобретение основано на обнаружении того, что для получения нового типа азотфиксирующих растений предпочтительно могут быть использованы члены родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia. Этот факт является неожиданным, поскольку согласно нашим знаниям до настоящего времени, эти так называемые свободно живущие бактерии не заселяют внутренние пространства растений в условиях in vivo и не обнаруживают тенденции к образованию таких тесных ассоциаций в природных условиях [Azotobacteraceae: The Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria; Academic Press, New York /1979/. Таким образом, распространение азотфиксирующих симбиозов на новые виды растений может быть достигнуто не только дальнейшим развитием известных природных симбиозов и тесных эндофитных ассоциаций [Plant and Soil 141, 13-39 /1992/].

На основе рассмотренного выше, данное изобретение касается способа получения растений нового типа, способных к азотфиксации также в их листьях. Согласно данному изобретению протопласты, клетки, ткани, зародыши или органы растений, выросшие и/или/ обработанные в условиях in vitro инокулируют бактериями, принадлежащими к семейству Azotobacteraceae, затем полученную таким образом культуру Co-культивируют при температуре 15-35^oC и, если желательно, размножают и/или/ регенерируют целое растение при той же температуре в условиях in vitro на или в культуральной среде, содержащей азот и основной источник /источники/ углерода, утилизируемые только клетками растений, а также иногда другие добавки.

В качестве гетеротрофных бактерий, способных к азотфиксации при атмосферных уровнях кислорода, предпочтительно применяют виды родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia, принадлежащие к семейству Azotobacteraceae.

Для инокуляции предпочтительно применяют вегетативные клетки, цисты и формы бактерий, частично или полностью лишенные клеточной стенки.

В качестве основного источника /источников/ углерода, утилизируемых только клетками растений, предпочтительно применяют лактозу, мальтозу, галактозу, целлобиозу, крахмал, раффинозу и/или сорбит. Основной источник /источники/ углерода добавляют в концентрации не менее 10 г/л, предпочтительно 20-40 г/л, к культуральной среде. В случае применения бактерий, частично или полностью лишенных их клеточной стенки, основной источник углерода применяют в концентрации 0,35-0,75 М.

В способе данного изобретения pH культуральных сред предпочтительно доводят до величины, являющейся оптимальной для роста данной бактерии, причем эта величина равна 5,5-9,5 для родов Azotobacter, Azomonas и Derxia и 3-9,5 для рода Beijerinckia.

В способе данного изобретения дополнительная потребность в Ca²⁺, необходимая для роста некоторых видов родов Azotobacter и Azomonas, предпочтительно обеспечивается добавлением карбоната кальция и/или/ хлорида кальция к культуральной среде, предпочтительно в количестве 0,1-0,5 г/л и 0,05-0,2 г/л соответственно.

Для развития и размножения нового типа азотфиксирующих растений предпочтительно используют известные в этой области способы in vitro, обычно применяемые для обработки, культивирования или микроразмножения соответственно протопластов, клеток, каллусных тканей, эмбрионов или побегов.

В качестве добавок, утилизируемых также и бактериями, могут быть также использованы "дополнительные" источники углерода, предпочтительно сахароза или глюкоза, а также витамины, аминокислоты и усиливающие рост агенты.

Фиг. 1 представляет собой фотографию, полученную при помощи электронного микроскопа, с увеличением 16000, показывающую клетки Azomonas agilis, включенные в межклеточные пространства черешка листа растения моркови.

Фиг. 2 представляет собой фотографию, полученную при помощи электронного микроскопа, с увеличением 18000, показывающую клетки Azomonas insignis, включенные в межклеточные пространства черешка листа растения моркови.

Основные преимущества способа данного изобретения можно суммировать следующим образом:
a) азотфиксирующее растение, полученное по способу согласно данному изобретению, способно к азотфиксации также в его листьях и поэтому требует мало азотных удобрений или не требует удобрения азотом;
b) можно применять как ауксотрофные, так и прототрофные бактерии;
c) можно применять традиционные способы in vitro;
d) поддерживается хорошо сбалансированный рост как растения, так и бактерий;
e) эндосимбиозы растение/бактерии могут развиваться относительно быстро;
f) в способе можно применять любые виды растений и любые части растений;
g) полученные симбиозы можно быстро размножать с применением способов in vitro, предпочтительно микроразмножения;
h) эффективность нового азотфиксирующего растения может быть увеличена путем применения бактериального мутанта, характеризующегося сверхсинтезом фермента нитрогеназы и/или/ высвобождающего большое количество фиксированного азота.

Способ данного изобретения иллюстрирован далее следующими нелимитирующими примерами.

Пример 1. После промывания от остатков сахарозы суспензию клеток моркови инокулируют клеточной суспензией /10⁶-10⁸ клеток/мл; вегетативные клетки и цисты /Azotobacter vinelandii /DSM 87/, затем собранные клетки культивировали при 17-22^oC на отвержденной агаром образующей каллус MS культуральной среде [pH 6,2; Physiol. Plant 15, 473-494 /1962/], содержащей 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты /2,4-Д/ в качестве гормона растений и 30 г/л лактозы в качестве единственного источника углерода. Выращенную таким образом каллусную массу переносили на подобную MS-среду, не содержащую гормона 2,4-Д, и культивирование продолжали при идентичных условиях. Регенерированные таким образом растения высаживали в почву и через 2 месяца после стерилизации поверхности /0,2%-ным раствором HgCl₂ в течение 1,5 мин/ и гомогенизации определяли содержание бактерий в листьях. Листья содержали 10⁴-10⁵ бактерий на 1 г сырого веса листьев.

Тот же самый эксперимент повторяли на той же MS-среде с тем различием, что культуральная среда не содержала гормона 2,4-Д. Суспензию клеток растений инокулировали клеточной суспензией Azotobacter vinelandii /DSM 87/ и культивировали при 17-22^oC на отвержденной агаром культуральной MS-среде, не содержащей 2,4-Д. Регенерированные таким образом растения испытывали тем же путем, что и в случае растений, регенерированных из каллусной массы, росшей на содержащей гормон культуральной среде. Содержание бактерий в листьях было практически тем же самым, т.е. 10⁴-10⁵ бактерий на 1 г сырого веса листьев.

Азотфиксация листьев была доказана определением восстановления ацетилена в атмосфере, содержащей 10% /по объему/ ацетилена, без стерилизации поверхности (755 наномолей C₂H₂/г сырого веса листа/24 часа) или после стерилизации поверхности (530 наномолей C₂H₄/г сырого весла листа/24 часа) путем инкубирования тестируемых листьев в течение 14 часов света /1200 люксов/ и 10 часов темноты при 25^oC. Культуральная среда содержала 0,1 г/л карбоната кальция в качестве дополнительного источника Ca²⁺.

Пример 2. Каллусы моркови инокулировали, как описано в примере 1, клетками Azomonas agilis /DSM 375/, затем растения Co-культивировали и регенерировали при 27-32^oC на культуральной среде /pH 7,3/, содержащей 30 г/л лактозы в качестве основного источника углерода и 0,1 г/л сахарозы в качестве дополнительного источника углерода.

Регенерированные и включенные в растение бактерии считали после стерилизации поверхности /10⁵-10⁶ бактерий на 1 г сырого веса корней и 10⁶-10⁷ бактерий на 1 г сырого веса листьев и наблюдали при помощи электронного микроскопа. В электронно-микроскопической фотографии фиг. 1 можно видеть микроорганизмы 2, включенные в межклеточное пространство 1, окруженное живыми клетками растений, содержащими хлоропласты 3. После стерилизации поверхности 1 г листа восстанавливали 278 наномолей ацетилена до этилена в день, тогда как 1 г корней восстанавливали 266 наномолей ацетилена в день.

Пример 3. Суспензию моркови инокулировали клетками Azomonas insignis /ATCC-12523/, как описано в примере 1. Культуральная среда содержала 30 г/л галактозы в качестве основного источника углерода и 2,5 г/л глюкозы в качестве дополнительного источника углерода /pH 8,3, 27-33^oC, 0,1 г/л хлорида кальция/. Содержание бактерий в регенерированном растении детектировали при помощи электронного микроскопа /10⁵ бактерий/г сырого веса листа/день/. Электронно-микроскопическая фотография показана на фиг. 2, где микроорганизмы 2 включены в межклеточное пространство 1, окруженное клетками растения с хлоропластом 3.

Пример 4. Культуру ростков табака инокулировали через поверхность разреза не содержащей клеточных стенок /L-форма/ культурой Azotobacter paspali /ATCC 23833/ /индуцированной на культуральной среде, содержащей 100 млн^-1 пенициллина G, стабилизированной 0,5 М глюкозой/. Полученные таким образом культуры культивировали на культуральной среде, содержащей 0,5 М мальтозы, 100 млн^-1 пенициллина G и 0,25 г карбоната кальция /pH 7,3/ в течение 2 месяцев. В последствии культуры культивировали без пенициллина G и с последующим снижением содержания мальтозы культуральной среды идо 10 г/л. После высаживания в почву было обнаружено, что азотфиксирующая активность листьев после стерилизации поверхности была равна 800 наномолям C₂H₄ на г сырого веса листа/24 часа.

Пример 5. Суспензию клеток моркови инокулировали суспензией Beijerinckia mobilis /DSM 2326/, как описано в примере 1, и культуры Со-культивировали на культуральной среде, содержащей 40 г/л лактозы /pH 5,4, без добавления Ca²⁺/. Было обнаружено, что азотфиксирующая активность листьев регенерированного растения определенная при помощи теста восстановления ацетилена, была равна 180 наномолям C₂H₂/г сырого веса листа/24 часа.

Пример 6. После инокуляции клеток моркови суспензией Derxia gumrosa /ATCC 15994/, как описано в примере 3 /pH 7,2/, азотфиксирующая активность листьев регенерированного растения могла быть обнаружена в тесте восстановления ацетилена.

Изобретение касается способа получения нового типа растений, способных фиксировать азот в листьях. Способ включает инокуляцию органа растения бактериями рода Azotobacter или Azomonas или Beijerinckia или Derxiz в условиях in vitro. Обработанное таким образом растение культивируют на или в культуральной среде, содержащей источник азота и источник углерода, утилизируемый только клетками растения и не утилизируемый бактериями в количестве не менее 10 г/л, предпочтительно 20 - 40 г/л. Целесообразно бактерии использовать в виде вегетативных клеток или цист, или форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок. При использовании форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок, в среду основной источник углерода вводят в концентрации 0,35 -- 0,75 М. При обработке растений бактериями рода Azotobacter или Azomonas в среду дополнительно вносят не более 0,5 г/л карбоната кальция и/или не более 0,2 г/л хлорида кальция. 3 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений, включающий инокуляцию органа растения бактериями семейства Azotobacteraceae в условиях in vitro и сокультивирование обработанного таким образом органа растения на или в культуральной среде, содержащей источники углерода и азота, отличающийся тем, что источником углерода является источник, утилизируемый только клетками растения и не утилизируемый бактериями, добавляемый в количестве не менее 10 г/л, предпочтительно - 20 - 40 г/л, а бактерии семейства Azotobacteraceae представляют виды Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерии используют в виде вегетативных клеток или цист, или форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при использовании форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок, в культуральную среду добавляют основной источник (источники) углерода в концентрации 0,35 - 0,75 М. 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что при обработке растений бактериями рода Azotobacter или Azomonas в среду дополнительно вносят не более 0,5 г/л карбоната кальция, и/или не более 0,2 г/л хлорида кальция.