Биопрепарат на основе штамма азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii для стимуляции роста сельскохозяйственных культур, повышения урожайности и активации микробиологических процессов в ризосфере Российский патент 2024 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно оптимизации азотного питания растений, стимуляции их роста, коррекции полезной микробиоты в ризосфере путем обработки семян перед посевом. Применение биопрепарата обеспечивает повышение урожайности сельскохозяйственных культур.

Современные технологии выращивания сельскохозяйственных культур характеризуются широким применением биопрепаратов на основе активных микроорганизмов с положительными для растений свойствами. Микробиота является неотъемлемым компонентом биоценозов и участвует в геохимических циклах биогенных элементов (Глазовская М.А., Добровольская Н.Г. Геохимические функции микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1984. - 152 с). Так, например, благодаря функционированию микроорганизмов-азотфиксаторов, не только удовлетворяются потребности растения в азоте, но и происходит его резервирование в почве в качестве азотсодержащих соединений (Hofman G., Cleemput O.V. Soil and plant nitrogen. Paris: IFA, 2004. - 49 p.; Bothe H., Ferguson S.J., Newton W.E. Biology of the nitrogen cycle. - Elsevier, 2007. - 453 p.; Биологическая фиксация азота / Монография в 4-х т./ Т. 1. / С.Я. Коць, В.В. Моргун, В.Ф. Патыка и др. К.: Логос, 2010).

Способность фиксировать молекулярный азот атмосферы свойственна почвенным микроорганизмам разных таксономических групп, среди которых особое место занимают бактерии рода Azotobacter. Бактерии встречаются в различных почвенно-климатических условиях. С агрономической точки зрения, азотобактер имеет многообразие функций: увеличивает содержание общего азота как в растениях, так и в почве; продуцирует физиологически активные вещества (витамины, ауксины и др.); повышает численность микроорганизмов и активность некоторых микробиологических процессов в почве и ризосфере, что обеспечивает его широкое применение в технологиях выращивания сельскохозяйственных культур (Патенты RU 2074158 С1, опубл. 27.02.1997; RU 2177466 С2, опубл. 27.12.2001; RU 2224791 С1, опубл. 27.02.2004; RU 2390518 С1, опубл. 27.05.2010; RU 2414509 С1, опубл. 20.03.2011; RU 2464308 С2, опубл. 20.10.2012; KZ 27897, опубл. 25.12.2013; SU 1359272 А1, опубл. 15.12.1987; SU 1703634 А1, опубл. 07.01.1992). К недостаткам указанных разработок относятся: ограниченная функциональность штаммов, их узкая специфичность к сельскохозяйственным растениям, а также сложность сложность в изготовлении микробных препаратов. Так, например, штамм Azotobacter vmekmdii ИБ 4 (RU 2245918 С1, опубл. 10.02.2005) с нитрогсназной и фунгицидной активностью, положительно влияет на продуктивность растений, усиливает биозащиту, но нет сведений о его поведении в ризосфере и биологической активности. Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 (RU 2289620 С1, опубл. 20.12.2006), обладает высокой фунгицидной активностью, стимулирующими свойствами, но неизвестно об азотфиксирующей активности штамма. Также в указанных патентах недостаточно сведений о влиянии биопрепаратов на микробиологические процессы в ризосфере и почве.

В основу предложенного изобретения поставлена задача разработки биопрепарата для предпосевной обработки семян на основе эффективного технологичного штамма Azotobacter vinelandii, способствующего оптимизации азотного питания растений, стимуляции их роста, повышения урожайности и коррекции полезной микробиоты в ризосфере.

Поставленная задача решена путем создания биопрепарата для стимуляции роста сельскохозяйственных культур, повышения урожайности и активации микробиологических процессов в ризосфере на основе штамма азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii 10702, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05208, с титром не менее 2,3 млрд. клеток в 1 мл.

Заявляемый биопрепарат получают на основе штамма Azotobacter vinelandii 10702. Эффективный штамм выделен из почвы тепличного комбината. Бактерии имеют форму овальных палочек, сцепленных но две. Аэроб. В качестве источника энергетики использует различные углеводы: сахаразу, глюкозу, манит, галактозу, сорбит, рамнозу. Способен фиксировать азот атмосферы (азотфиксирующая активность - 486,3±6,7 нмоль C₂H₄/мл среды за один час). Интенсивный рост отмечен на средах без азота, с минеральным азотом и гороховом агаре. Колонии крупные (2-3 мм) с ровным краем, гладкой поверхностью, слизистые, блестящие. На средах, не содержащих азот, образует зеленый пигмент. При добавлении в среду бензойнокислого натрия рост замедляется, образуется коричниватый пигмент. На МПА не растет. Оптимальная температура 28°С, pi 1 7,0-7,3. Штамм бактерий продуцирует фитогормоны. По морфологическим и культуралыю-биохимическим свойствам по определителю Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, П. Крига, П. Спита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М: Мир, 1997. - 432 с.) штамм идентифицирован как Azotobacter vinelandii. Генетическая идентификация проведена секвенированием части гена 16S рРНК в ФГБНУ ВНИИСХМ. На основании проведенного анализа штамм идентифицирован как Azotobacter vinelandii и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения под регистрационным номером RCAM05208.

Для культивирования диазотрофных бактерий в биотехнологии используют среды Эшби, Виноградского, Федорова с низким содержанием азота. Среды отличаются по минеральному составу, количеству углерода и микроэлементам (Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.Л. Егорова, JI.M. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.). Для разработки биопрепарата исследовали динамику роста штамма A. vinelandii 10702 в указанных питательных средах (С.Д. Перт. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 332 с.). Установлено, что экспоненциальная фаза роста, период наиболее активного роста клеток, в условиях глубинного периодического культивирования наступала через 24 часа. Максимальное количество клеток A. vinelandii 10702 отмечалось через 48 часов в среде Виноградского и через 60 часов - в средах Эшби и Федорова, что подтверждается кинетикой роста (таблица 1). Агаризованная среда Виноградского рекомендуется для хранения культуры бактерий с пересевом раз в 4-6 месяцев.

Продуктивность технологического процесса зависит не только от титра бактерий и скорости роста, по и от сохранения функциональных особенностей штамма. В среде Федорова отмечена наивысшая активность азотфиксации заявляемого штамма (таблица 2). Корреляции между титром бактерий и азотфиксирующей активностью не установлено.

Для разработки биопрепарата на основе A. vinelandii 10702 была взята за основу среда Федорова (стандарт) следующего состава (г/л): сахароза - 20, K₂HPO₄ - 0,3, MgSO₄ - 0,3, CaHPO₄ - 0,2, K₂SO₄ - 0,2, NaCl - 0,5, FeCl₃ - 0,1, СаСо₃ - 5,0, микроэлементы по Федорову - 1,0; рН - 7,0. В серии экспериментов по подбору добавок, стимулирующих рост бактерий (таблица 3), было установлено, что наиболее эффективной является среда с дрожжевым экстрактом (1 г/л) и смесью мелассы и сахарозы (1:1), титр бактерий составляет 2323 млн. (2,3 млрд.) в 1 мл (513 млн клеток в контрольной среде).

Таким образом, для глубинного периодического культивирования рекомендуется модифицированная среда Федорова следующего состава (г/л): сахароза 10; меласса - 10; K₂HPO₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,1; СаСо₃ - 5,0; дрожжевой экстракт - 1,0; микроэлементы но Федорову - 1,0; рН - 7,0.

Биопрепарат готовят следующим образом.

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках, на скошенной агаризованной питательной среде Федорова. После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 28°С на 3-5 суток. После обильного нарастания бактериальной массы готовят водную суспензию культуры, которую вносят в жидкую питательную модифицированную среду Федорова указанного выше состава. Колбы ставят на качалку и культивируют при 180 об/мин 48 часов (первая расплодка или маточная культура). Полученную в колбах маточную культуру в количестве 5% от объема среды вносят в банки со стерильной средой также указанного выше состава и культивируют на технологической качалке при 220 об/мин, температуре 27-28°С в течение 72 часов.

Готовый биопрепарат - жидкость от светло-коричневого до бурого цвета с титром не менее 2,3 млрд в 1 мл. Хранят препарат при температуре 8-15°С в течение 2-3 месяцев.

Полученный биопрепарат применяют путем нанесения на семена водной суспензии перед посевом. Расход препарата - 0,1 л на гектарную норму семян, количество воды для приготовления водной суспензии берут из расчета 2,3% к массе семян.

Краткое описание графических изображений.

На фиг. 1 показано влияние предпосевной инокуляции семян на рост побега различных сельскохозяйственных культур (лабораторный опыт), на фиг. 2 влияние инокуляции на развитие растений пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Станичная (вегетационный опыт, чернозем южный), на фиг. 3 влияние микробных препаратов на фитотоксические свойства ризосферы пшеницы (полевой опыт, чернозем южный, отбор почвы в фазу созревания зерна), на фиг. 4 - влияние инокуляции на развитие растений сорго зернового (Sorghum bicolor (L.) Moench.) сорта Днепровский 39 (вегетационный опыт, чернозем южный карбонатный слабогумусный на лессовидных глинах).

В лабораторных опытах установлена антагонистическая активность штамма A. vinelandii 10702 - основы биопрепарата к фитопатогенному микромицету Fusarium роае (Peck) Wollenw, который является доминирующим патогеном зерновых культур (таблица 4). Микромицеты рода Fusarium вызывают заболевания у большинства сельскохозяйственных культур, что приводит к снижению не только урожая, но и качества продукции. Используемыми в исследованиях методами не установлено явного антагонизма между A. vinelandii 10702 и F. graminearum Schwabe, F. oxysporum (Schlecht) Snyd. Hans. Однако, несмотря на отсутствие стерильной зоны отмечалась остановка роста микромицетов при их контакте с бактериями, что может свидетельствовать о пассивной конкуренции между A. vinelandii 10702 и исследуемыми фузариумами.

На проростках семян зерновых Hordeum vulgare L. (ячменя) и овощных (капусты (Brassica oleracea L.), огурца (Cucumis sativus I..)) культур установлено стимулирующее действие биопрепарата: длина побегов в 1,7-7 раз превышает контроли (фиг. 1).

Эффективность заявляемого биопрепарата установлена в серии вегетационных и полевых опытов на сортах озимой пшеницы, районированных в зонах рискованного земледелия. Для инокуляции семян готовили баковую смесь в количестве, которое составляет 2,3% от массы семян (150-220 кг/га) для чего 0,1 л препарата разводили в воде. Контрольные семена обрабатывали водой. Биопрепарат обеспечивает повышение урожая зерна озимой пшеницы разных сортов и активирует микробиологические процессы в ризосфере.

В условиях вегетационного опыта на субстрате чернозем южный показано стимулирующее действие биопрепарата на развитие растений озимой пшеницы: высота растений увеличилась на 4,3%, корня на 25,8%, воздушно-сухая масса на 15,4% (фиг. 2). Установлен высокий уровень корреляции (r 0,763) между длиной корня и воздушно-сухой массой растений.

На черноземе южном карбонатном слабогумусном на лессовидных глинах, инокуляция обеспечила существенную прибавку урожая у всех изучаемых сортов от 0,18 до 0,41 т/га (на 3-7%) (таблица 5). У всех изучаемых сортов при применении бактеризации семян отмечалась тенденция к повышению массы 1000 зерен в сравнении с контролем.

11редпосевная инокуляция семян заявляемым биопрепаратом способствует повышению биологической активности в ризосфере озимой пшеницы. Результаты исследований (таблица 6) свидетельствую!, что в зависимости от фазы развития растений в ризосфере пшеницы сорта Васса, инокулированного заявляемым биопрепаратом, увеличилась численность микроорганизмов, участвующих в трансформации азота и фосфора.

Применение биопрепарата положительно влияет на фотосинтетические процессы в растении. 'Гак, в фазу цветения в листьях растений пшеницы сортов Краснодарская 99, Борвий, Васса, Станичная сумма хлорофиллов увеличилась соответственно на 15,8; 23,8; 14,5 и 36,7% относительно контроля (таблица 7).

Применение биопрепарата способствует снижению фитотоксичности почвы (фиг. 3) в ризосфере исследуемых сортов пшеницы. Это является положительным фактом, учитывая высокий удельный вес зерновых культур в севообороте, в почве накапливаются токсические вещества, что снижает продуктивность растений.

В условиях сухой степи на черноземе обыкновенном малогумусном, тяжелосуглинистом, после черного пара обработка перед посевом семян пшеницы сорта Подолянка обеспечила увеличение урожайности зерна на 4-14%, в зависимости от агрофона (таблица 8). Следует отметить, что наибольший эффект проявляется на фоне стартовых доз фосфорно-калийных удобрений. Увеличение дозы удобрений до 60 к/га д.в. является нецелесообразным. Результаты опыта показывают возможность экономии минеральных удобрений.

В ризосфере инокулированных растений озимой пшеницы сорта Подолянка отмечено увеличение численности микроорганизмов, использующих азот органических соединений (аммонификаторов), в 1,6 раз в сравнении с контролем, олиготрофов - в 3,1 раза (таблица 9). Численность азотфикеатов не превышала контроль, однако активность потенциальной азотфиксации высокая, что подтверждается результатами, приведенными в таблице 10.

В ризосфере инокулированных растений в фазу цветения повышалась активность микробиологических процессов. Так, содержание подвижного фосфора в ризосфере (на агрофоне Р₃₀К₃₀) увеличилось на 7,5% в сравнении с контролем, а потенциальная азотфиксирующая активность на 81% (таблица 10).

В условиях дефицита продуктивной влаги перспективной сельскохозяйственной культурой является сорго зерновое. Обработка семян предлагаемым биопрепаратом на основе штамма Azotobacter vinelandii 10702 стимулировала рост растений сорго зернового, длина корня и высота надземной части которых соответственно превышала контроль в 2 и 1,8 раз (фиг. 4). Воздушно-сухая масса сорго в вариантах с инокуляцией семян превышала контроль в 3,3 раза и коррелировала с высотой (r=0,96) и длиной корня растений (г 0.94).

Таким образом, разработан биопрепарат на основе активного азотфиксирующего штамма Azotobacter vinelandii 10702, продуцирующего фитогормоны ауксиновой природы. Биопрепарат представляет собой жидкую культуру с содержанием клеток не менее 2,3 млрд. в 1 мл. Биопрепарат стимулирует рост растений и развитие проростков, проявляет антагонистическую активность к F. oxysporum (Schlecht) Snyd. Hans, активирует микробиологические процессы в ризосфере, снижает фитотоксичность почвы, что приводит к повышению урожайности сельскохозяйственных культур.

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается биопрепарат на основе штамма азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii 10702, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05208, с титром не менее 2,3 млрд клеток в 1 мл. Биопрепарат используется для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур для стимуляции роста, повышения урожайности и активации микробиологических процессов в ризосфере. 4 ил., 10 табл.

Биопрепарат для стимуляции роста сельскохозяйственных культур, повышения урожайности и активации микробиологических процессов в ризосфере на основе штамма азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii 10702, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05208, получаемый путем глубинного периодического культивирования указанного штамма в модифицированной среде Федорова с частичной заменой сахарозы мелассой в равных количествах, добавлением дрожжевого экстракта 1 г/л и поэтапным увеличением времени культивирования и скорости перемешивания, при этом на первом этапе культивирование проводят в течение 48 ч при 180 об/мин с получением маточной культуры, которую на втором этапе переносят в стерильную среду того же состава в количестве 5% от объема среды и культивируют в течение 72 ч при 220 об/мин с получением биопрепарата с титром не менее 2,3 млрд клеток в 1 мл.