ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ ФИКСИРОВАННЫЕ ВЫСУШЕННЫЕ ТРОМБОЦИТЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/14 A01N1/02 

Настоящая заявка является продолжением одновременно рассматриваемой патентной заявки 07/891227, поданной 29 мая 1992 года, описание которой включено в целом в настоящую заявку путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фиксированно высушенным тромбоцитам, приемлемым для ввода в организм человека, и способам обработки раневой ткани путем локального применения фиксированно высушенных тромбоцитов.

Предпосылки создания изобретения
В течение последних тридцати лет в медицине в операциях переливания крови стало широко практиковаться использование концентратов тромбоцитов. Однако быстрая потеря функции тромбоцитов в ходе их хранения и риск бактериального заражения значительно усложнили операции эффективного учета концентратов тромбоцитов в запасах консервированной крови. Во многих местах хранения ограниченный срок службы концентратов тромбоцитов значительно снизил их употребление.

В работе E. Klein и др., J.Pediatrics 49, 517-522 (1956), описывается приготовление и ввод лиофилизированного тромбоцитного вещества в организм детей с острой лейкемией и гипопластической анемией. Отмечаются болевые ощущения и венозные спазмы в месте вливания. В таблице 2 показана лимитированная эффективность этих продуктов. По прошествии более 30 лет эти продукты не обеспечивают полезного терапевтического эффекта.

Для того чтобы в отношении запасов консервированной крови операции переливания тромбоцитов были более управляемыми, проявлялся значительный интерес к разработке средств для снижения или замедления потери функции тромбоцитов в ходе их хранения. Одно из решений такой проблемы заключалось в разработке свободной от кровяной плазмы среды. См., например, патент США 4695460. Другое решение проблемы заключалось в использовании биохимических способов стабилизации тромбоцитов. См. , например, работу A. Bode и др., патент США 4994367. Хотя эти способы дают возможность продлить полезный срок годности, они не обеспечивают продление этого срока на продолжительные периоды времени. И наконец в патенте США 5185160, F.Chao описывается приготовление микровезикул оболочек тромбоцитов из устаревших тромбоцитов, наряду с другими материалами.

Фиксированно высушенные тромбоциты, используемые для диагностического анализа, описываются в патенте США N 4287087 Brinkhous и др. Хотя фиксированно высушенные тромбоцитные препараты могут храниться в течение продолжительных периодов времени для диагностических целей, до настоящего времени их не приготавливали в форме, пригодной для фармацевтического использования для человека. В связи с этим продолжает оставаться потребность в новых средствах получения тромбоцитных препаратов, имеющих продолжительный срок годности, которые пригодны для ввода в организм людей.

Краткое изложение сущности изобретения
Первым предметом настоящего изобретения являются фиксированно высушенные человеческие тромбоциты, которые при их переработке (а) прилипают к тромбогенным поверхностям; (б) не прилипают к нетромбогенным поверхностям; (в) претерпевают изменение формы (расширение) при прилипании к тромбогенной поверхности; (г) прилипают друг к другу, образуя гемостатическую пробку при прилипании к тромбогенной поверхности; и (д) высвобождают их гранулярное содержимое, а именно после стимулирования и/или расширения (например, после физиологической стимуляции, которая обычно приводит к тому, что метаболически активный живой или свежий тромбоцит выделяет его гранулярное содержимое, например, контактирующую пораненную ткань).

Вторым предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, состоящая из фиксированно высушенного тромбоцитного препарата. Фиксированно высушенный тромбоцитный препарат заключает в себе фиксированно высушенные человеческие тромбоциты, имеющие указанные выше характеристики.

Третьим предметом настоящего изобретения является способ фиксации тромбоцитов для получения фиксированно высушенных тромбоцитов, имеющих указанные выше характеристики, и получаемые таким способом тромбоциты. Данный способ включает контактирование тромбоцитов с фиксатором, таким как формальдегид, параформальдегид, глутаровый альдегид или перманганат (например, путем перемешивания тромбоцитов с их раствором) в течение времени, достаточного для фиксации или стабилизации тромбоцитов, но недостаточного для того, чтобы вызвать потерю перечисленных выше характеристик. Затем данные тромбоциты высушиваются, в результате чего получаются фиксированно высушенные тромбоциты, имеющие указанные выше характеристики.

Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано образование тромбина тромбоцитами по настоящему изобретению в сравнении с фиксированно высушенными тромбоцитами, известными ранее, и неактивированными контрольными тромбоцитами.

Подробное описание изобретения
Фиксированно высушенные тромбоциты по настоящему изобретению могут быть фиксированы соединением, выбранным из группы соединений, включающей формальдегид, параформальдегид и глутаровый альдегид. Фиксация этими агентами требует тщательной модификации способа, описанного в патенте США N 4287087 для избежания потери жизнеспособности тромбоцитов. Обычно промытые тромбоциты фиксируются путем их выдерживания в термостате, обычно при комнатной температуре до 60 минут в растворе параформальдегида концентрацией вплоть до 1,8%. Как будет описано более подробно ниже, следует соблюдать осторожность для получения требуемой фиксации тромбоцитов, или же может иметь место чрезмерный лизис в ходе их сушки.

Другой возможный вариант данного способа заключается в фиксации тромбоцитов путем выдержки в термостате тромбоцитов в растворе перманганата (например, в растворе перманганата натрия или перманганата калия). Обычно промытые тромбоциты могут быть приготовлены данным способом путем выдержки их в термостате в течение от 5 до 20 минут в растворе KMnO₄ или NaMnO₄ концентрацией от 0,001 до 1 г/дл, более предпочтительно - путем выдержки их в термостате в течение от 5 до 15 минут в растворе KMnO₄ или NaMnO₄ концентрацией от 0,005 до 0,5 г/дл, и наиболее предпочтительно путем выдержки их в термостате в течение от 8 до 12 минут в растворе KMnO₄ или NaMnO₄ концентрацией от 0,005 до 0,05 г/дл.

Тромбоцитные препараты, используемые для приготовления фармацевтических композиций, должны быть свободны от посторонних веществ, особенно лизированных тромбоцитов, являющихся свободными тромбогенными агентами для пациентов, в организм которых вводится препарат. Следовательно, необходимо принять меры для осуществления требуемой фиксации тромбоцитов (без нарушения их жизнеспособности, определяемой по указанным выше характеристикам) до их сушки, поскольку в противном случае в этапе сушки будет происходить чрезмерный лизис. Так, например, тромбоцитные препараты, пригодные для фармацевтических композиций, предназначенных для людей, при переработке 10⁹ тромбоцитов в 1 миллилитре раствора имеют концентрацию предпочтительно менее чем 10•10⁶ микрочастиц (фрагментарные остатки лизированных тромбоцитов) на миллиметр, и предпочтительно менее чем 150 Международных единиц (IU) на литр дегидрогеназы лактата во всплывшей фазе после повторного суспендирования и таблетирования (где 2200 IU на литр соответствует общему лизису 10⁹ клеток в 1 миллилитре).

Сушка тромбоцитов после фиксации может осуществляется любым подходящим способом, но предпочтительно она осуществляется путем лиофилизации. Следует соблюдать осторожность, чтобы стабилизировать тромбоцитный препарат до сушки, поскольку в противном случае может наблюдаться недопустимая степень лизиса тромбоцитов. Стабилизация может осуществляться путем суспендирования тромбоцитов в растворе, содержащим подходящую водовытесняющую молекулу (или "стабилизатор"), например альбумин или трегалозу, и последующей сушки раствора. Согласно одному из вариантов выполнения данного изобретения используется от 0,1 до 20 вес.% альбумина, более предпочтительно от 1 до 10 вес. % альбумина, и наиболее предпочтительно от 5 да 10 вес.% альбумина. Для ввода в организм альбумин, используемый в препарате, должен иметь ту же природу, что и альбумин организма, в который вводится препарат (например, человеческий альбумин). Как другой возможный вариант, препарат может быть высушен с альбумином, имеющим другую природу, этот альбумин отделяется от тромбоцитов при их переработке, и альбумин той же природы снова вводится в переработанный препарат для последующего ввода в организм, но следует следить за тем, чтобы был удален весь альбумин, имеющий другую природу, поскольку он может проявлять антигенность в организме пациента, подвергаемого лечению.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут заключать в себе высушенные (предпочтительно лиофилизированные) тромбоциты, являющиеся стерильными и не содержащими пирогенов, в стерильной асептической упаковке. Альбумин может быть включен в эти композиции, как указано выше. Фармацевтические композиции могут заключать в себе также тромбоцитный препарат по данному изобретению, переработанный в фармацевтически пригодном носителе. Могут использоваться любые водные носители, которые повторно гидрируют тромбоциты, так что они обладают указанными выше характеристиками и пригодны для внутривенной инъекции (например, стерильный свободный от пирогенов физиологический солевой раствор). В переработанную композицию могут быть введены другие дополнительные агенты, такие как, буферные смеси, предохраняющие средства и другие терапевтически активные агенты. См., например, патент США 4994367 (описание его включено в заявку путем ссылки).

Переработанные фармацевтические композиции по данному изобретению обычно вводятся в организм человека путем внутривенной инъекции. Люди, нуждающиеся в таком лечении, включают пациентов, страдающих тромбоцитопенией (в том числе вымывающей тромбоцитопенией), пациентов с геморрагической дисфункцией тромбоцитов и с травмами, вызывающими сильное кровотечение. Количество фармацевтической композиции, вводимой в организм, будет различным в зависимости от веса и состояния пациента, но обычно оно находится в пределах от 20 до 360 мл по объему с концентрацией от 1•10⁹ до 3•10⁹ тромбоцитов на миллилитр (и более предпочтительно в пределах от 2•10⁹ до 3•10⁹ тромбоцитов на миллилитр). Фармацевтические композиции могут быть упакованы в стерильную, свободную от пирогенных продуктов емкость, так чтобы их объемы и дозы были единичными дозами.

Дается также описание способа, способствующего залечиванию ран у пациентов, нуждающихся в таком лечении. Данный способ заключается в локальном вводе фиксированных высушенных тромбоцитов на место раны в количестве, обеспечивающим эффективное залечивание раны, где указанные тромбоциты проявляют воздействие на вызванный ими ростовой фактор (PDGF) на их поверхности. Подвергаемым лечению организмом может быть организм человека или организм животного (в ветеринарии, например, организм собак, кошек, лошадей, коров и т. д. ). Тромбоциты могут быть любого подходящего вида (например, тромбоцитами человека, коровы, свиней и т.д.), но предпочтительно они того же происхождения, что и тромбоциты организма, подвергаемого лечению. Тромбоциты могут быть приготовлены любыми подходящими средствами, поскольку они выражают PDGF, но предпочтительно их приготавливают способами, описанными в данной заявке, так, чтобы они выделяли образованный от них ростовой фактор после стимуляции и/или расширения (например, после физиологической стимуляции, которая обычно приводит к тому, что способствует выделению метаболически активным живым или свежеприготовленным тромбоцитом его гранулярного содержимого, такого как контактирующая пораненная ткань). Данным способом могут быть обработаны любые типы ран, включая царапины, порезы, проколы, рваные раны, ожоги и т.д. Рана может быть на кожной ткани или на какой-либо другой ткани или на другом органе, например, порезы могут быть на внутренних органах, таких как кишечник, селезенка, печень и т.д., которые могут быть нанесены в ходе хирургической операции. Тромбоциты могут вводиться в рану любыми подходящими способами, например, путем обрызгивания или распыления тромбоцитов на рану, или могут быть введены хирургически, как описывается ниже. В случае, когда тромбоциты наносятся путем разбрызгивания непосредственно на рану, далее на эту рану при желании может распыляться чистый полимерный адгезив, или затем на эту рану может быть наложена какая-либо другая подходящая повязка или перевязочный материал. Доза тромбоцитов должна составлять не менее чем от 0,5 до 1•10⁹ тромбоцитов на квадратный сантиметр площади поверхности хирургического воздействия или площади поверхности раны. Верхний предел дозы не является критически важным, но обычно он составляет от 5 до 10•10⁹ тромбоцитов на один квадратный сантиметр площади поверхности хирургического воздействия или площади поверхности раны. Фиксированные высушенные тромбоциты могут вводиться в рану путем хирургического воздействия, посредством, например, повязки или перевязочного материала, бинта, шовного материала, марли, протезирующего устройства и т.д. Все эти вспомогательные средства наряду с твердыми материалами включают твердый физиологически пригодный материал субстрата и фиксированные высушенные тромбоциты (которые либо наносятся как покрытие, либо впитываются), которые несет материал субстрата, где тромбоциты выражают производимый от них ростовой фактор на их поверхности. Обычно такие хирургические средства поставляются в стерильной упаковке, находящейся в стерильной емкости. Субстрат, как хирургическое средство, может быть покрыт тромбоцитами до упаковки (например, путем обрызгивания субстрата высушенными тромбоцитами или путем сушки (например, леофилизации) субстрата в водном препарате фиксированных тромбоцитов или с водным препаратом фиксированных тромбоцитов, которые несет данный субстрат, так чтобы часть тромбоцитов склеивалась субстратом), или упакован вместе с тромбоцитами, так чтобы часть тромбоцитов склеивалась с субстратом в упаковке, адгезионно связывалась с субстратом посредством адгезива или просто наносились путем обрызгивания на хирургическое средство до его использования на субъекте.

Субстрат как хирургическое средство может иметь любую форму или может быть любым твердым материалом, гидрофобным или гидрофильным, который физиологически приемлем. Так, например, шовный материал может представлять собой монофиламент или переплетенные нити, может быть биологически разлагаемым или биологически неразлагаемым, и может быть изготовлен из таких материалов, как найлон, шелк, полиэфир, хлопок, струнный материал, гомополимеры и сополимеры гликолида и лактида и т. д. Протезирующие устройства включают, например, тканые или экструдированные трубчатые конструкции, находящие применение в восстановлении артерий, вен, протоков; тканые или трикотажные полотна, способные к драпировке или прилаживанию и находящие хирургическое применение при вправке грыжи и при поддерживании пораженных печени, почек и других внутренних органов; штифты, винты и усиливающие пластины; сердечные клапаны (например, фиксированные свиные сердечные клапаны), искусственные сухожилия или хрящевой материал и т.д. Полимерные материалы, используемые как шовные материалы, могут также быть отлиты в виде тонкой пленки, стерилизованы и упакованы для использования в качестве перевязочного материала для ран. Повязки (или бинты) могут быть изготовлены из любого подходящего материала субстрата, например, из тканого или нетканого хлопка или других текстильных материалов, пригодных для нанесения или прикрепления к ране, они могут включать при желании материал основы и могут включать при желании на их поверхности один или несколько адгезионных участков для прикрепления повязки к ране.

Настоящее изобретение более подробно разъясняется на нижеследующих примерах. Эти примеры даются лишь с целью иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничение изобретения.

Пример 1
Приготовление лиофилизированных человеческих тромбоцитов
(ПРОТОКОЛ 1)
Человеческие тромбоциты приготавливались из крови, вводимой в антикоагулянт лимонная кислота-цитрат-декстроза (ACD) (0,085 Мол. тринатрийцитрата, 0,0702 Мол. лимонной кислоты, 0,111 Мол. декстрозы, pH 4,5), из расчета одна часть антикоагулянта на 5,66 частей крови. Тромбоциты извлекались путем дифференциального центрифугирования и трехкратно промывались солевым раствором лимонной кислоты (0,00544 Мол. тринатрийцитрата, 0,154 М NaCI, с доведением величины pH до 6,5 посредством 0,1 нормальной HCl).

После промывки тромбоциты фиксировались путем выдержки в термостате промытых тромбоцитов из 100 мл крови в 5,0 мл 1,8% раствора параформальдегида (приготовленного в виде 9 мл 4% раствора параформальдегида плюс 1,0 мл ACD плюс 10,0 мл 0,135 Мол. NaH₂PO₄) в течений 45 минут при комнатной температуре (продолжительность фиксации может быть продлена до 60 минут). Согласно другому возможному способу осуществляли выдержку в термостате промытых тромбоцитов из 100 мл крови в 1,0% растворе параформальдегида в течение 45 минут при комнатной температуре (продолжительность фиксации может быть продлена до 60 минут).

Для удаления параформальдегида после выдержки параформальдегида в термостате в каждую пробирку вводили равный объем имидазолового буферного солевого раствора (0,084 Мол. имидазола; 0,146 Мол. NaCl, с величиной pH, доведенной до 6,8 посредством 1,0 нормальной HCl), и тромбоциты подвергали осаждению путем центрифугирования с ускорением 1500 g в течение 8 минут при комнатной температуре. Всплывшая фаза декантировалась и тромбоциты промывались путем повторного суспендирания тромбоцитных осадков в 5-10 мл имидазольного буферного раствора, pH 7,35. Промывка повторялась еще 2 раза для удаления параформальдегида. После третьей промывки тромбоциты снова суспендировались в 5% растворе сывороточного альбумина (5 г альбумина на 100 мл солевого раствора цитрата, 0,0054 Мол. цитрата натрия, 0,154 Мол. NaCl, pH 6,5). Подсчет тромбоцитов осуществлялся посредством фазово-контрастного микроскопа и американского оптического гемоцитометра с подсветкой. Концентрация тромбоцитов доводилась до 800000 на куб.мм (cmm). Аликвоты (10 мл) тромбоцитов отрегулированной концентрации в растворе сывороточного альбумина вводились в 20-миллилитровые стеклянные ампулы и замораживались при -70^oC. Затем тромбоциты лиофилизировались в течение 12 часов или до тех пор, пока не обнаруживался крекированный белый порошок. Тромбоцитный продукт может также быть подвергнут заморозке в трубчатом холодильнике в больших количествах от 100 до 500 мл и леофилизирован при температуре -40^oC в течении четырех часов, после чего температура должна повышаться до -25^oC в течение времени сушки. Лиофилизированный продукт можно хранить при температуре от -20 до -70^oC до его использования.

Лиофилизированные тромбоциты подвергались повторной гидратации (регидратации) 0,084 Мол. имидазольной буферной смеси (без добавки соли) с доведением величины pH до 7,35 посредством 1,0 М NaOH. После добавления имидазольной буферной смеси раствор отстаивался, выдерживался в покое в течение нескольких минут, затем осторожно перемешивался путем качения или вращения пробирки, в результате чего получалась однородная суспензия регидратированных одиночных тромбоцитов.

Пример 2
Приготовление лиофилизированных человеческих тромбоцитов
(ПРОТОКОЛ 2)
Всю массу крови получали от здоровых доноров, добровольно сдающих свою кровь, в виде коммерческих упаковок крови (Fenwal 4R6402, Baxter Health Care) с содержанием в них стандартного комплекта антикоагулянта (CPDA-1). Конечный объем каждой собранной кровяной упаковки с содержанием лимонной кислоты составлял 500 см³. Каждый наполненный кровью пакет центрифугировали для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), которая вытягивалась из пакета и промывалась посредством трех этапов центрифугирования/повторного суспендирания в фосфатно-буферном солевом растворе (так же, как описано в примере 1). Промытые тромбоциты затем снова центрифугировались, и полученный осадок центрифугирования обрабатывался буферным раствором, содержащим 1,8% параформальдегида (как в примере 1) в течение от 45 минут до 1 часа при комнатной температуре. Выход тромбоцитов после удаления реагента стабилизации и дальнейшей промывки тромбоцитов для удаления параформальдегида составлял 60-80% от числа тромбоцитов в суспензии до процесса стабилизации. Выход тромбоцитов снижался, когда альбумин отсутствовал в промывочном буферном растворе после стабилизации.

Состав конечной тромбоцитной вторичной суспензии до сушки замораживанием играет очень важную роль для получения требуемых выходов. Обычно требуется эффективное количество стабилизатора, такого как альбумин или трегалоза, в буферном солевом растворе для получения выхода тромбоцитов 85-100% при осуществлении этапов лиофилизация/регидратация. Содержание альбумина должно составлять от 0,1 до 50 г/дл, более предпочтительно от 1 до 25 г/дл, и наиболее предпочтительно от 5 до 10 г/дл. Содержание трегалозы должно составлять от 0,1 до 10 молей, более предпочтительно от 0,2 до 5 молей, и наиболее предпочтительно от 0,5 до 1,0 моля. Использовали несколько различных типов растворов регидратации, не получая при этом значительного различия конечных параметров: фосфатно-буферный солевой раствор, pH 7,3; трис-буферный солевой раствор, pH 7,4; имидазоло-буферный солевой раствор, или физиологический сбалансированный солевой раствор UNISOL^TM.

Типичные данные для регидратированных тромбоцитных препаратов, полученных как описано в данном примере, даются ниже в табл. 1.

Количество микрочастиц после регидратации тромооцитных препаратов, приготовленных как описано в данной заявке, составляло от 4,5 до 5•10⁶/мл. Реакция при испытании на гипотонический шок тромбоцитов, приготовленных как описано в данном примере, составляла 0,030 - 0,036 OD/мин (0,100-0,150 для свежеприготовленных тромбоцитов). Количество выделенной дегидрогеназы лактата (LDH), количество LDH во всплывшей фазе после повторного суспендирования 10⁹ тромбоцитов в 1 мл раствора составляло от 50 до 200 IU/л (> 150 или 250 показывает значительное истечение цитоплазмы).

Пример 3
Приготовление лиофилизированных человеческих тромбоцитов со стабилизацией перманганатом
Всю массу крови получали от здоровых доноров, добровольно сдающих свою кровь, в виде коммерческих упаковок крови (Fenwal 4R6402, Baxter Health Care) с содержанием в них стандартного комплекта антикоагулянта (CPDA-1). Конечный объем каждой собранной кровяной упаковки с содержанием лимонной кислоты составлял 500 см³. Каждый наполненный кровью пакет центрифугировали для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), которая вытягивалась из пакета и промывалась посредством трех этапов центрифугирования/повторного суспендирания в фосфатно-буферном солевом растворе, как описано выше в примере 1. Промытые тромбоциты повторно суспендировались в 1/10 объема буферного солевого раствора и добавлялись по каплям в раствор перманганата, состоящий из фосфатно-буферного солевого раствора, содержащего KMnO₄ или NaMnO₄ с конечной концентрацией 0,01 г/дл. Суспензию тромбоцитов выдерживали в термостате в растворе перманганата в течение 10 минут при комнатной температуре, и затем двукратно промывали, как описано выше, 0,1-5,0 г/дл альбумина в буферном растворе с целью удаления перманганата. Потеря тромбоцитов в ходе перманганатной обработки и последующей промывки составляла лишь 10-20%.

Для сохранения выхода 70-100% после лиофилизации/регидратации в конечный раствор повторного суспендирования до лиофилизации необходимо вводить стабилизатор, такой как трегалоза или альбумин, предпочтительно в указанных выше пределах. Состав раствора регидратации не является критически важным, но он должен быть изотоническим и должен быть буферным с величиной pH 7,3-7,4 (как и для фиксированных параформальдегидом тромбоцитов). Типичные данные анализа регидратированных фиксированных перманганатом тромбоцитов представлены ниже, в таблице 2.

Количество микрочастиц после регидратации тромбоцитных препаратов, фиксированных перманганатным процессом, как описано в данном примере, составляло 2,6-4,0•10⁶/мл. Реакция (при испытании на гипотонический шок) тромбоцитов, приготовленных указанным способом, составляла 0 - 0,030 OD/мин (0,100-0,150 для свежеприготовленных тромбоцитов). Количество выделенной LDH составляло 50 - 200 IU/л.

Пример 4 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР А)
Использование активационных маркеров для определения характеристик стабилизированных параформальдегидом тромбоцитов
Цель данного примера состоит в том, чтобы продемонстрировать, что тромбоциты, фиксированные параформальдегидом по данному изобретению, выделяют их гранулярное содержимое после контактирования с тромбогенной поверхностью, в то время как тромбоциты, известные ранее, их не выделяют. Исследуемые тромбоцитные препараты стабилизировались 1,0% формальдегидом в течение 60 минут (параформальдегид 1) и 1,8% параформальдегидом в течение 60 минут (параформальдегид 2); эти препараты сравнивались с тромбоцитами, приготовленными как описано в патенте Brinkhous и др., то есть они фиксировались 2% параформальдегидом в течение 120 минут (Brinkhous).

Маркеры, используемые в данных испытаниях, приведенные в таблице 3, CD62 и GP53, представляли собой коммерчески доступные антитела, покупаемые у фирмы Becton-Dickinson, Inc., и они служили для того, чтобы обнаружить на поверхности тромбоцита антигенов, выделяемых из тромбоцитных гранул. Присутствие выделенных гранулами антигенов на поверхности тромбоцита является доказательством активизации тромбоцита. Антитела к этим антигенам рассматриваются как активационные маркеры. Антитела к вызванному тромбоцитом ростовому фактору (PDGF) использовались для выявления связывания PDGF с оболочкой тромбоцитов. Антитело PDGF было приобретено у фирмы Genzyme (Кембридж, МА). Сосуды, используемые в тестах на адгезивность Baumgartner, были взяты у обычных собак.

Эксперименты осуществлялись для того, чтобы продемонстрировать активационную способность отдельных лиофилизированных тромбоцитных препаратов путем ввода их в свежеприготовленную цельную кровяную массу, свободную от естественных тромбоцитов, путем дифференциального центрифугирования для сравнения со свежеприготовленной цельной кровью, предназначенной для использования в кольцевидных перфузионных камерах. Кровь собирали в цитратный антикоагулянт (CPDA-1) от обычных доноров. Две полосы (1 см) артериального сосуда собаки помещались на конический стержень и вставлялись в рециркуляционную петлю, приводимую в движение перистальтическим насосом со скоростью 130 мл/мин. Осуществляли перфузию этой петли сначала буферным раствором, затем кровью (либо со свежеприготовленными, либо с лиофилизированными тромбоцитами) в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем осуществляли в течение 2 минут перфузию 2% параформальдегидом для устойчивой фиксации клейких тромбоцитов с сосудом. Тромбоциты на поверхности сосуда обнаруживались путем ввода флюоресцентного моноклонального антитела в GPIIbllla. Слипаемость была количественно определена посредством эпи-флюоресцентной микроскопии по измерению процента поверхности сосуда, покрытой флюоресцирующими клетками. Кроме того, брали образцы остальной части крови (с неприлипшими тромбоцитами) для приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). PRP далее фиксировалась посредством 2% параформальдегида в течение 1-2 часов при комнатной температуре до выдержки в термостате с флюоресцентно мечеными моноклональными антителами к CD62 и PG53 или PDGF. Присутствие этих маркеров на поверхности тромбоцитов в образце обнаруживалось методом стандартной цитометрии в потоке в цитометре FACSCAN^TM. Результаты были выражены количественно как процент тромбоцитов с флюоресценцией, превышающей фон, зарегистрированный неспецифическим контрольным антителом (неиммунная мышь IgG2_a). Полученные данные сравнивались с образцами крови, взятыми до или сразу же после инициирования перфузии полос сосуда. Результаты данного сопоставления приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 ясно, что указанные концентрация и время стабилизации приводят в результате к получению тромбоцитов с различными в значительной степени свойствами. Тромбоциты параформ. 1 и параформ.2 показывают увеличенное число активационных маркеров, присутствующих на тромбоцитах в крови, циркулирующей через субэндотелиальную поверхность стенки сосуда. Параформ.2 показывает удвоение активационных маркеров после экспонирования активационной поверхности. В отличие от этого препарат BrinKhous практически не обнаруживает активации после циркуляции с маркером CD62 и показывает минимальное изменение PDGF.

Пример 5 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР Б)
Использование активационных маркеров для определения характеристик тромбоцитов, приготовленных с перманганатом калия
Цель этого примера состоит в том, чтобы продемонстрировать, что тромбоциты, фиксированные посредством перманганата по данному изобретению, выделяют их гранулярное содержимое после контактирования с тромбогенной поверхностью, в то время как известные ранее тромбоциты их не выделяют. Данный пример осуществляли таким же образом, как и пример 4, описанный выше, с той разницей, что тромбоциты фиксировались посредством перманганата, как описано выше в примере 3. Использовались три различных фиксированных посредством перманганата тромбоцитных препарата: тромбоциты, стабилизированные 0,02 Мол. перманганата и лиофилизированные в присутствии Трегалозы (Перм.1); тромбоциты, стабилизированные 0,02 Мол. перманганата и лиофилизированные в присутствии человеческого сывороточного альбумина (Перм.2); и тромбоциты, стабилизированные 0,01 Мол. перманганата и лиофилизированные в присутствии человеческого сывороточного альбумина (Перм.3). Для сравнительных целей тромбоциты фиксировались также 2% формальдегида в течение 120 минут и высушивались в присутствии бычьего сывороточного альбумина. Данные представлены в таблице 4.

Из таблицы 4 ясно, что в противоположность фиксированным перманганатом тромбоцитам по настоящему изобретению, тромбоцитный препарат BrinKhous практически не обнаруживал активации после экспонирования тромбогенного сосуда.

Пример 6 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР В)
Адгезионное прилипание регидратированных тромбоцитов к субэндотелию сосуда
Способность свежеприготовленных и регидратированных тромбоцитов приклеиваться к стенкам экспонированных субэндотелиальных сосудов была проверена в кольцевой камере перфузии. Сравнивались тромбоцитные препараты BrinKhous и тромбоциты, приготовленные, как описано выше в примерах 4 и 5. Тромбоциты удалялись из антикоагулированной ACD цельной крови и заменялись различными препаратами высушенных и регидратированных тромбоцитов. Затем цельную кровь и кровь, содержащую повторно гидратированные тромбоциты, нагнетали через камеры, содержащие несколько помещенных в них сосудов. Скорости потока и смещения были неизменными для всех препаратов. Результаты приведены ниже в таблице 5.

Хотя различие результатов между циклами испытания было значительным, очевидно, что тромбоциты BrinKhous были "более клейкими", чем другие препараты. Все препараты приклеивались к субэндотелию сосудов, но тромбоцитами, приготовленными согласно настоящему изобретению, покрывалась меньшая площадь поверхности экспонированной стенки сосуда. Безусловно, адгезионное прилипание известных ранее тромбоцитов, которые являются метаболически "мертвыми", является пассивным прилипанием, за которым не следует необходимая метаболическая реакция.

Пример 7 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР C)
Тест на восстановление гипотонического шока
Тест на восстановление гипотонического шока осуществляли для определения способности тромбоцитов удалять воду и освобождаться от разбухания, вызванного повышенным поглощением воды тромбоцитами. Для измерения степени восстановления от разбухания тромбоцитные суспензии концентрацией 3•10⁸/мл в содержащей лимонную кислоту плазме обрабатывались 1/2-ным объемом деионизированной воды в аггрегометре Chronolog при температуре 37^oC. Сигнал светопропускания (%T) увеличивался сразу же с поглощением воды тромбоцитами в результате гипотонического шока (%T_макс), с последующим возвратом %Т к значению, близкому к основному (%T_тсн, откорректированному на разбавление), поскольку вода активно вытесняется не подвергнутыми воздействию тромбоцитами. Степень восстановления по прошествии 10 минут определяли количественно по следующей формуле:

Степень возврата от гипотонического шока была измерена отдельно, и это измерение осуществлялось так же, как описано выше, с той разницей, что оно осуществлялось при температуре 22^oC в аггрегометре Payton без перемешивания. Степень восстановления рассчитывалась как степень изменения %Т от 1 минуты до 3 минут после добавления деионизированной воды. Результаты, приведенные в таблице 6, выражены как процент степени изменения %Т, полученного в случае контрольных свежеприготовленных тромбоцитов. Скорость и степень восстановления тромбоцитов в тесте на гипотонический шок зависели в значительной мере от целостности оболочки тромбоцита и от остаточной метаболической активности. Тромбоцитные препараты BrinKhous не показали реакции, в то время как тромбоцитные препараты по данному изобретению обнаруживали восстановление на 40-100%.

Пример 8 (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР D)
Образование тромбина в тромбогенных препаратах
Цель данного примера заключается в том, чтобы проиллюстрировать, что небольшие изменения концентрации фиксаторов и времени фиксации приводят в результате к различным реакциям тромбоцитов на стимуляцию.

Тесту подвергались четыре тромбоцитных препарата на образование тромбина (который зависит от концентрации тромбоцита) и основу протромбиназного комплекса на поверхности тромбоцитов. Результаты показаны на чертеже. Количество тромбоцитов х 1000 дается на горизонтальной оси. Образование тромбина в единицах дается на вертикальной оси. Использовались следующие препараты: (i) тромбоциты параформ.1 (треугольники на чертеже); (ii) тромбоциты параформ. 2 (квадраты); (iii) тромбоциты BrinKhous (ромбы); и (iv) свежеприготовленные промытые тромбоциты как контрольные препараты (кружочки). Тромбоциты параформ. 2 показывали максимальную скорость образования тромбина, за ними следовали тромбоциты параформ. 1 и затем тромбоциты BrinKhous. Контрольные тромбоциты показывали наименьшую скорость образования тромбина.

Пример 9
Экспрессия образованного тромбоцитом ростового фактора (PDGF) на поверхности фиксированно высушенных тромбоцитов
Цель данного примера заключалась в исследовании тромбоцитов, фиксированных и высушенных различными средствами для экспрессии PDGF на их поверхности. Антитела и тромбоцитные препараты описываются в изложенных выше примерах 5 и 6. Данные приводятся в нижеследующей таблице 7.

Эти данные показывают, что как тромбоциты BrinKhous, так и тромбоциты по настоящему изобретению выражают PDGF на их поверхности, и что тромбоциты Перм. 2 и Параформ. 2 выражают в большей степени PDGF на поверхности, чем тромбоциты BrinKhous до или после стимуляции.

Пример 10
Локальный ввод фиксированно высушенных тромбоцитов, которые выражают PDGF для ускорения заживления ран у свиней
В данном примере описывается использование тромбоцитов, которые выражают PDGF на их поверхности для ускорения заживления ран у свиней.

Свиные тромбоциты, используемые в данном эксперименте, приготавливались в основном таким же образом, как описано в примере 1, и они модифицировались, как описано ниже. Для удаления параформальдегида добавляли равный объем имидазольного буферного солевого раствора (IBS), pH 7,35. Эти тромбоциты осаждались путем центрифугирования в течение 8 минут при комнатной температуре при ускорении центрифуги 1500•g. Всплывшая фаза удалялась, и осадок повторно суспендировался в 5-10 мл IBS, pH 6,8. Промывка повторялась двукратно. Затем процедура осуществлялась таким же образом, как и в примере 1, с той разницей, что концентрация свиных тромбоцитов составляла 8•10⁴/мкл. В качестве стабилизатора для сушки вводили свиной альбумин в том же количестве, что и в примере 2.

Тромбоцитный перевязочный материал приготавливали, используя хирургическую перевязку BIOBRANEII^TM на секциях 1 кв.см (Don В.Holland, Inc., Sugarland, Техас) в чашках Петри диаметром 10 см. Перевязочный материал площадью 1 см² насыщали 3,2•10⁹ свиными тромбоцитами с помощью пипетки на 1 мл с раствором, содержащим указанное количество тромбоцитов, наносимым на перевязочный материал, после чего осторожно переносили перевязочный материал с тромбоцитами в камеру лиофилизации, и этот материал высушивали при температуре -40^oC до обнаружения крекированного белого порошка.

Исследования проводили на двух взрослых свиньях. Их анестезировали и получали на них ранения проколом регулированных размеров с использованием дерматологического 3-миллиметрового (мм) устройства для пункции. На 0 день образовывались раны глубиной 3 мм х шириной 3 мм на обритой стерилизованной поверхности вдоль спины анестезированных свиней. Рана проникала в эпидермический слой, дермический слой и жировую ткань. Образовывалось по три ряда из шести ран. Ряд 1 обрабатывали сухими тромбоцитами. Ряд 2 обрабатывали сеткой, пропитанной сухими тромбоцитами. Ряд 3 оставляли необработанным. На первый день рану 1 каждого ряда удаляли. На второй день рану 2 каждого ряда удаляли. На каждый из последующих четырех дней последующие раны каждого ряда удаляли для проведения исследования. Удаленная ткань фиксировалась посредством параформальдегида и обрабатывалась стандартными гистологическими приемами, окрашивалась и исследовалась с помощью микроскопа на заживление ран. Каждую секцию исследовали на присутствие тромбоцитов, фибробластовой пролиферации по краям и в основании раны, на возобновление эпитатиального роста и на воспалительную реакцию. Количество тромбоцитов, скапливающихся в каждой точке, точно не было определено. Раны в ряду 1 наполнялись высушенными тромбоцитами. Каждую рану от прокола наполняли до возможной полноты высушенными тромбоцитами. Раны в ряду 2 обрабатывали наполнением сеткой (1 см²), содержащей высушенные тромбоциты, каждой раны. Качественная оценка показала, что все обработанные секции успешно заживлялись по сравнению с необработанными ранами.

Пример 11
Внутривенный ввод фиксированно высушенных тромбоцитов в организм здоровых собак и собак с заболеванием Willebrand
Для измерения гемостатической эффективности регидратированных тромбоцитов в условиях ин виво, в организм здоровых собак и одной собаки с дефицитом фактора Willebrand (заболевание Willebrand, vWD) вливали регидратированные фиксированно высушенные собачьи тромбоциты. Эти собачьи тромбоциты фиксировались, высушивались и подвергались структурной переработке таким же образом, как и человеческие тромбоциты в описанных выше примерах 1 и 2 с той разницей, что эти тромбоциты фиксировались в 0,67% параформальдегидном растворе в течение одного часа. В таблице 8 приведены физические данные вливания и характеристик собак.

После вливания тромбоцитов в организм собак собирали образцы крови в ходе данного эксперимента в течение примерно четырех часов нижеследующим образом. В организм анестезированных собак вливали регидратированные тромбоциты. Оголяли сонную артерию. В бедренную артерию вставляли канулю для измерения кровяного давления и вторую канулю вставляли в бедренную вену для отбора образцов и ввода жидкостей. Одну сонную артерию травмировали проколом с вводом стеноза согласно общепринятым приемам (см. Nichols и др.. Circulation Research 59, 15-26, 1988). У собак измеряли изменение кровяного давления, частоты сердечного биения, дыхания и т.д. для выявления нежелательной реакции на вливание фиксированно высушенных тромбоцитов. Регидратированные тромбоциты метились флюоресцентным красителем, вливались, и отбирали образцы крови для исследования их на присутствие меченых регидратированных тромбоцитов в периферической циркуляции в 5 образующемся тромбе на участках разорванных стенок сосудов (субэндотелий) и на приклеивание к нормальным стенкам сосудов. Делались вырезы на маргинальных участках ушей собак и эти секции препарировались для микроскопического исследования на приклеивание регидратированных тромбоцитов. В таблице 9 показаны результаты этих исследований.

Изложенные выше примеры являются иллюстрацией настоящего изобретения и не являются его ограничением. Настоящее изобретение определяется нижеследующей формулой изобретения.

Изобретение относится к фиксированно высушенным человеческим тромбоцитам, к способу их приготовления и фармацевтическим композициям на их основе. Тромбоциты после их переработки прилипают к тромбогенным поверхностям, не прилипают к нетромбогенным поверхностям, претерпевают изменение формы (расширение) при прилипании к тромбогенной поверхности, прилипают друг к другу, образуя гемостатическую пробку при прилипании к тромбогенной поверхности, и высвобождают их гранулярное содержимое. Тромбоциты фиксируются предпочтительно посредством фиксатора, такого как формальдегид, параформальдегид или глутаровый альдегид, или фиксируются посредством перманганатного фиксата. Эти тромбоциты высушиваются предпочтительно путем лиофилизации. Изобретение обеспечивает повышение функциональных свойств фиксированно высушенных тромбоцитов крови человека. 6 с. и 17 з.п. ф-лы, 9 табл., 1 ил.

1. Фиксированно высушенные человеческие тромбоциты, которые при переработке: прилипают к тромбогенным поверхностям, не прилипают к нетромбогенным поверхностям, претерпевают изменение формы (расширение) при прилипании к тромбогенной поверхности, прилипают друг к другу, образуя гемостатическую пробку при прилипании к тромбогенной поверхности, и высвобождают их гранулярное содержимое. 2. Тромбоциты по п.1, отличающиеся тем, что они лиофилизируются. 3. Тромбоциты по п.1, отличающиеся тем, что они фиксируются соединением, выбранным из группы, включающей формальдегид, параформальдегид и глутаровый альдегид. 4. Тромбоциты по п.1, отличающиеся тем, что они получены в результате фиксации перманганатом. 5. Тромбоциты по п.1, отличающиеся тем, что они стабилизируются альбумином. 6. Тромбоциты по п.1, отличающиеся тем, что они стабилизируются трегалозой. 7. Фармацевтическая композиция, содержащая активное начало, отличающаяся тем, что в качестве активного начала она содержит фиксированно высушенные тромбоциты по пп.1 - 6 в эффективном количестве. 8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что также содержит альбумин. 9. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что также содержит человеческий альбумин. 10. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что тромбоциты лиофилизированы. 11. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что переработана в водном физиологически пригодном носителе. 12. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что тромбоциты фиксируются соединением, выбранным из группы, включающей формальдегид, параформальдегид и глутаровый альдегид. 13. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что тромбоциты фиксируются перманганатом. 14. Способ приготовления фиксированно высушенных человеческих тромбоцитов по пп.1 - 6, предусматривающий фиксацию человеческих тромбоцитов посредством их инкубации до 60 мин в растворе, содержащем до 1,8% вещества, выбранного из группы, включающей параформальдегид, формальдегид и глутаральдегид или посредством их инкубации до 20 мин в растворе, содержащем до 1 г/дл раствора перманганта, стабилизацию тромбоцитов после фиксации посредством их суспендирования в растворе, содержащем от 0,1 до 20 мас.% соединений, выбранных из группы, включающей альбумин и трегалозу, и последующую сушку этих тромбоцитов с получением фиксированно высушенных тромбоцитов. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что фиксацию осуществляют путем перемешивания указанных тромбоцитов с раствором, содержащим фиксатор. 16. Способ, ускоряющий свертываемость крови в организме пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение тромбоцитарного препарата в организм пациента, отличающийся тем, что в качестве тромбоцитарного препарата используют фиксированно высушенные тромбоциты по пп.1 - 6, которые предварительно переработаны в водном фармацевтически пригодном носителе в количестве, эффективном для ускорения свертываемости крови. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что пациент поражен тромбоцитопенией. 18. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная переработанная тромбоцитарная композиция вводится внутривенно. 19. Способ, ускоряющий заживление раны субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий локальное внесение активного начала на рану, отличающийся тем, что в качестве активного начала используют фиксированно высушенные тромбоциты по пп. 1 - 6 в количестве, эффективном для ускорения заживления раны, причем указанные тромбоциты выделяют образуемый на их поверхности ростовой фактор. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что фиксированно высушенные тромбоциты выделяют после стимуляции образуемый на их поверхности ростовой фактор. 21. Хирургическое средство, содержащее активное начало и физиологически пригодный субстрат, отличающееся тем, что в качестве активного начала оно содержит фиксированные высушенные тромбоциты по пп.1 - 6, причем указанные тромбоциты выделяют образуемый на их поверхности ростовой фактор. 22. Средство по п. 21, отличающееся тем, что субстрат выбирается из группы субстратов, включающей перевязочный материал для ран, шовный материал, марлевую ткань и протезирующие устройства. 23. Средство по п.21, отличающееся тем, что оно является стерильным и тем, что оно упаковано в стерильную емкость.