Штамм дрожжей JaRRoWIa LIроLYтIса-продуцент липазы и питательная среда для его культивирования Советский патент 1989 года по МПК C12N9/20 C12N9/20 C12R1/645 

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ антибир- тиков под № ЗОАА.

Штамм дрожжей Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А отличается следующими морфологическими и физиологическими признаками.

Морфология. На среде Чапека рост умеренный. На вторые сутки клетки округлые, овальные и удлиненные размером (2,5-5) X (3-15) мкм. Размножение почкованием. Иногда наблюдается образование псевдомицелия. Колонии бесцветные или желтоватые до коричневатых. Образование спор не наблюдается.

Культуральные признаки. На жидком сусле на вторые сутки роста наблюдается помутнение среды, образование небольшого осадка и пристенного кольца, утончающегося к центру.

На сусло-агаре на вторые сутки рост культуры обильный, складчатый. Образуется хорощо развитый истинный мицелий с бластоспорами, обычно опущенный по краям. Колонии имеют S-форму. При. длительном хранении культуры без пересевов в популяции накапливаются клетки,, образующие колонии R-формы.

Физиологические признаки. Культура использует следующие источники углерода: глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, этанол, глицерин, лактат, сукцинат, цитрат. В качестве источника азота используют соли алюминия.

Нитраты не усваивает. Желатину не разжижает. Молоко пептонизирует. Оптимальный рост в диапазоне температуры 26-37 С, рН 7,5-8,0.

Культура поддерживается на сусло агаре без снижения активности в течение 2 мес. Пересев I раз в 2 мес.

Для выявления оптимального источника углерода культуру выращивают н среде Ридер, содержащей 0,5% глюкозы. Заменяя глюкозу другими источниками углерода, установлено, что .эко номически выгодно в качестве источника углерода использовать этанол более дешевый и недефицитный источник углерода. Концентрация этанола, оптимальная для образования липазы, составляет 3-6,5 мл/л среды. Максимальное накопление липазы наблюдается при концентрации этанола 5 мл/л

4852

среды. Влияние концентрации этанола в среде на образование липазы представлено на фиг. 1.

При изучении влияния некоторых растительных масел, жиров, синтетических триглицеридов и олеиновой кислоты, взятых в различных концентрациях, на образование липазы куль10 ,турой Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А при выращивании ее на среде с 5 мл/л этанола установлено, что в присутствии кукурузного масла в питательной среде в количестве 0,2%

15 интенсивность накопления липазы возрастает на 37% (таблица и фиг. 2).

35

Таким образом, питательная среда для культивирования штамма дрожжей 0 Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А - продуцента липазы имеет следующий состав: этанол в качестве источника углерода, минеральные соли (аммоний сернокислый, магний сернокислый, Ь натрий хлористый, кальций углекислый, калий углекислый, калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый двузамещенный), дрожжевой экстракт и кукурузное масло в качестве 0 стимулятора роста и активатора накопления липазы при следующем соот- нощении компонентов среды, мас.%: Этанол0,29-0,62

Кукурузное масло 0,1 -0,5 Аммоний сернокислый0,25-0,4 Магний сернокислый 0,05-0,09 Натрий хлористый 0,02-0,06 Кальций углекислый 0,08-0,5 . Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-1,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,01-0,15 Дрожжевой экстракт 0,01-0,02 Вода водопроводная Остальное Примеры использования культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А и питательной среды для ее культивирования.

Пример 1. Посевной материал культуры дрожжей Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А выращивают на среде следующего состава, мас.%:

Этанол0,38

Аммоний сернокислый0.3 Магний сернокислый . 0,07 Натрий хлористый 0,05 Кальций углекислый 0,1

40

45

50

55

Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 ,0 Калий фосфорнокис-

лый двуэамещенный 0,1

Дрожжевой автолизат 0,1 Вода водопроводная 97,9 Среду, кроме этанола, разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют при 1,0 атм в течение 30 мин. После ох- лаждения среды к ней в стерильных условиях добавляют по 0,38 г (0,5 мл 96%-ного) этанола в каждую колбу.

Для засева посевных колб используют двухсуточную культуру, выращен- ную на косяк:ах сусло-агара или агара Ридер. Культуру смывают с косяков стерильной водой и в каждую колбу вносят по 5 мл суспензии. Посевной материал выращивают в течение 24 ч при 240-250 об/мин и 26-30 С.

В основную ферментацию вносят посевной материал в количестве 5% от объема среды.

Для, основной ферментации готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Этанол0,38

Кукурузное масло 0,2 Аммоний сернокислый 0,3 Магний сернокислый 0,07 Натрий хлористый 0,05 Кальций углекислый О,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный . Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,1 Дрожжевой экстракт 0,01 Вода водопроводная 97,79

Приготовленную среду, кроме этанола, стерилизуют при 1,2 атм в течние 60 мин. После охлаждения к сред в стерильных условиях добавляют эта .нол..

Ферментацию с целью получения ли политического фермента проводят в опытно-промьщшенном ферментаторе емкостью 100 л при коэффициенте заполнения 0,7. Температура ферментации 26-28 С, рН 7,5-8,0 pCj на уровне 40-45% от максимального насьщения. За 18 ч процесса в культуральиой жидкости накапливается липолитичес- кий фермент 8000 ЛЕ/мл (за ЛЕ прини мают такое количество фермента, которое в стандартных условиях в течение 1 ч освобождает 1 мкмоль жирных кислот).

Биомассу от культуралыюй жидкости отделяют центрифугированием. Отделенную биомассу используют для пС- лучения дрожжевого автолизата и возвращают в среду для выращиваний п о- севного материала. Осветленную кость высушивают в распылительной сушилке при температуре входящего „, теплоносителя 180 с, выходящего-70 t Получают препарат с липолитической активностью 235 ЛЕ/мг, выход по активности 93%. Препарат может быть использован в меховой, в легкой про- мьппленности и в животноводстве.

Пример 2, Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1. Для основной ферментации готовят питательную среду следу ющего состава, мас.%:

Этанол0,42

Кукурузное масло 0,1 Аммоний сернокислый 0,4 Магний сернокислый 0,09 Натрий хлористый 0,04 Кальций углекислый 0,2 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,01 Дрожжевой экстракт 0,01 . Вода водопроводная 98,63

Условия культивирования аналогичны примеру 1 при отличии, что проце проводят при дифференцированном режиме аэрации: в течение первых 6 ч ферментации поддерживают pOg на уроне 60-65% от максимального насьш1ени от 6 до 12 ч на уровне 40-45%, от 12 ч до конца ферментации на уровне 20-25% от максимального насьпцения.

В течение 18 ч ферментации в кул туральной жидкости накапливается ли политический фермент 7700 ЛЕ/мл.

Последующая обработка и использование аналогичны примеру 1.

Пример 3. Выращивание посеного материала проводят аналогично примеру 1. Для основной ферментации готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Этанол0,31

Кукурузное масло 0,2 Аммоний сернокислый 0,25 Магний сернокислый 0,05 Натрий хлористый 0,06 Кальций углекислый 0,3 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5

ческий фермент 7500 ЛЕ/мл. Последуго- , щая обработка и использование анало- гичны примеру 1.

g Субстратную специфичность липаз- ных препаратов культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА ЗОЛА проверяют следующим образом.

Готовят реакционную смесь: к

Калий фосфорнокислый / двузамещенный 0,05 Дрожжевой экстракт 0,02 Вода водопроводная 98,26 ; Условия ферментации аналогичны

Примеру 1.

За 18 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается липолити -

ческий фермент 7500 ЛЕ/мл. Последу -. Ю 2,5 мл А0%-ной эмульсии исследуемого щая обработка и использование анало- субстрата (различные масла, жиры,

глицериды) в 2%-ном поливиниловом спирте добавляют 0,5 мл раствора фермента, 2,5 мл фосфатного буфера 15 (рП 7,8) и выдерживают в течение 1 ч при , Реакцию прекращают добавлением 10 мл смеси этанол:ацетон (.1:1), титруют 0,05 н. гидроокисью натрия. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое при в течение 1 ч освобождает 1 мкмоль жирной кислоты. Относительную активность определяют по отношению.к расщеплению оливкового масла.

Липаза культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А отличается расширенным спектром действия, расщепляет субстраты, содержащие глицериды с 30 длиной молекулы жирных кислот в 16- 18 атомов углерода. Это является важной предпосылкой для использования липазы в меховой промышленности.

Ниже приведена субстратная специ- 35 фичность липазных препаратов культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А:

0,62

0,5

0,4

0,09

0,06

0,5

1,0

0,15

0,02

96,66

гичны примеру 1.

Пример 4, Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1.

Дпя основной ферментации готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Этанол

Кукурузное масло

Аммоний сернокислый

Магний сернокислый

Натрий хлористый

Кальций углекислый

Калий фосфорнокислый

однозамещенный

Калий фосфорнокислый

двузамещенный

Дрожжевой экстракт

Вода водопроводная

Условия ферментации аналогичны примеру 2.

За 18 ч ферментации в культураль- ной жидкости накапливается липолити- ческий фермент 7600 ЛЕ/мл. Последующая обработка и использование аналогичны примеру 1.

Пример 5. Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1.

Для основной ферментации готовят питательною среду следующего состава,

мас.%:

Этанол0,29

Кукурузное масло0,3

Аммоний сернокислый0,25

Магний сернокислый0,06

Натрий хлористый0,02

Кальций углекислый -0,08 Калий фосфорнокислый

однозамещенныйItO Кадмий фосфорнокислый

двузамещенный0,10

Дрожжевой экстракт0,01

Вода водопроводная97,89 Условия ферментации аналогичны

примеру 1.

За 18 ч ферментации в культураль- ной жидкости накапливается липолити20

25

Субстрат

40

45

50

55

Оливковое масло

Подсолнечное масло

Кукурузное масло

Горчичное масло

Соевое масло

Касторовое масло

Хлопковое масло

Рыбий жир

Свиной жир

Трибутирин

Область стабильности препарата находится в пределах рН реакционной смеси 4-9,5 (фиг. 3), температуры реакционной смеси 28-45 С (фиг. 4).

Эффективность использования штамма Jarrowia lipolytica ВШИЛ 304А и питательной среды для его культивирования обеспечивается высокой липо- литической активностью препарата

Липазная активность, % к оливковому маслу

100,0 117,6 126,9 48,5 48,1 52,3 65,3 74,0 79,0 72,7

I45A8528

ческий фермент 7500 ЛЕ/мл. Последуго- , щая обработка и использование анало- гичны примеру 1.

g Субстратную специфичность липаз- ных препаратов культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА ЗОЛА проверяют следующим образом.

Готовят реакционную смесь: к

-

-. Ю 2,5 мл А0%-ной эмульсии исследуемого - субстрата (различные масла, жиры,

Ниже приведена субстратная специ- 5 фичность липазных препаратов культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А:

Субстрат

0

5

0

5

Оливковое масло

Подсолнечное масло

Кукурузное масло

Горчичное масло

Соевое масло

Касторовое масло

Хлопковое масло

Рыбий жир

Свиной жир

Трибутирин

Область стабильности препарата находится в пределах рН реакционной смеси 4-9,5 (фиг. 3), температуры реакционной смеси 28-45 С (фиг. 4).

Эффективность использования штамма Jarrowia lipolytica ВШИЛ 304А и питательной среды для его культивирования обеспечивается высокой липо- литической активностью препарата

Липазная активность, % к оливковому маслу

100,0 117,6 126,9 48,5 48,1 52,3 65,3 74,0 79,0 72,7

. 9IA5485210

(7500-8000 ЛЕ/мл), расширением его углерода этанол и кукурузное масло, субстратной специфичности к различным в качестве стимулятора роста - дрож- маслам, стабильностью активности в жевой экстракт, а также дополнитель- широких пределах рН (4-9,5) и темпе- но содержит сернокислый магний, хло- ратуры (28-45 С). ристый натрий, углекислый кальций

и фосфорнокислый однозамещенный каФормула изобретения лий при следующем соотношении компонентов, мас.%:

1,Штамм дрожжей Jarrowia lipoly- ю

tica ВНИйА 304А - продуцент липазы. Этанол0,29-0,62

2.Питательная среда для культи- Кукурузное масло 0,1 -0,5 зирования штамма дрожжей Jarrowia Сернокислый аммо- lipolytica ВНИИА 304А - продуцеита ний0,25-0,4 липазы, содержащая источники углеро- is Сернокислый магний 0,05-0,09 да, сернокислый аммоний, фосфорнокис- Хлористьй натрий 0,02-0,06 лый двузамещенный калий, стимулятор Углекислый кальций 0,08-0,5 роста и воду, отличающая- Фосфорнокислый одс я тем, что, с целью повышения ли- нозамещеннь калий 0,1 -1,0 политической активности продуцента 20 Фосфорнокислый дву- и расширения субстратной специфич- замещенный калий 0,01-0,15 ности синтезируемого им фермента. Дрожжевой экстракт 0,01-0,02 среда содержит в качестве источника Водопроводная вода Остальное

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в кожевенной и ме ховой промьшшенности, медицине и животноводстве, при получении синтетических моющих средств. Цель изобретения - получение штамма, обладающего Изобретение отно сится к микробио--. логической промышленности и представляет собой штамм дрожжей Jarrowia lipolytica, используемый для получения щелочной липазы, и среду для культивирования продуцента. Полученный фермент находит применение в кожевенной, меховой промышленности, также при получении синтетических моющих средств с ферментными добавками, также в медицине и животноводстве. Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента липазы, обг высокой липолитической активностью и широкой субстратной специфичностью. Изобретение заключается в том, что путем многоэтапной селекции адаптивным методом получен штамм дрожжей Jarrowia lipolytica ВНИИ. 304А - активный продуцент липазы. Высокая ли- политическая активность штамма и способность его усваивать различные субстраты обеспечивается питательной средой следующего состава, мас.%: этанол 0,29-0,62; кукурузное масло 0,1-0,5; аммоний сернокисльй 0,25-; 0,04; магний сернокислый 0,05-. 0,09; натрий хлористый 0,02-0,06; кальций углекислый 0,08-0,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1- 1,0; калий фосфорнокислый двузамещен- ный 0,01-0,15; дрожжевой экстракт 0,01-0,02, вода водопроводная остальное. На новой среде штамм обеспечивает липолитическую активность 7500- 8000 ЛЕ/мл, стабилен в пределах рП 4-9,5 и.температуры 28-45 С. 2 с.п. ф-лы, 4 ил, 1 табл. 10 ладающего при культивировании на новой среде повьш1енной липолитической .активностью с расширением субстратной специфичности синтезируемого им фермента. Цель изобретения достигается тем, что в качестве продуцента липазы используют штамм дрожжей Jarrowia lipolytica 739. Штамм получен много- этапной селекцией адаптивным методом на сусло-агаре и среде Ридер с последующим выделением активных вариантов, (О 1йь сд М ро (У1 N3

Оливковое масло1009792846444 35

Соевое масло1009776736550 35

Подсолнечное масло1009494949056 48

Касторовое масло1009190906645 24

Кукурузное масло100103131137127123

Горчичное масло1009997968647

Рыбий жир1009585826844

Кашалотный жир1009186777769

Трибутирин1008077594230

Триолеин1009788817772

.Олеиновая кислота1009385856546

7500

шо

ifSlfO

то

SOQ

0.1 о.г0.

Кук1/рузное маем о среде, h а

в8

,/ Этанол мл1к

0iii.1

Ю

WO

i 0

«I

I

I ад I

I 20 1

rtzj j ч

С

I ш

гоо

Ю20J57W

, ФиеМ

SSI фигЗ

в 3 ЮрН

50 f