СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПАТОГЕННЫХ ПСЕВДОМОНАД Российский патент 1998 года по МПК C12N9/50 C12N9/50 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению биомассы и биологически активных веществ.

Наиболее близким аналогом к предложенному объекту является способ культивирования возбудителя мелиоидоза в жидкой питательной среде в колбах на качалках (отчет НИР "Внеклеточные факторы патогенности возбудителя мелиоидоза", ВНИПЧИ, 1981, ГР 79074381, с.64).

Однако выход биомассы и экзопротеаз в указанном способе невелик. Описанный способ может быть применен лишь для аналитических целей, нетехнологичен и не позволяет масштабировать процесс получения биомассы и протеолитических ферментом патогенных псевдомонад.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа получения биомассы и экзопротеаз патогенных псевдомонад.

Поставленный технический результат достигается тем, что выращивание бульонной культуры продуцирующего микроорганизма в жидкой питательной среде осуществляют глубинным аппаратным способом при принудительной аэрации питательной среды в течение 12-15 ч при температуре 25-37^oC, pH 6,8-6,9, поддерживаемом давлением 10% раствора глюкозы в присутствии перфтордекалина в количестве 5,0-15 об.% от питательной среды следующего состава, (мас.%):
Солянокислый гидролизат казеина - 0,3-1,5
Ферментативный гидролизат гороха - 0,3-0,4
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 0,05-0,13
Магний сернокислый семиводный - 0,01-0,04
Железо сернокислое пятиводное - 0,001-0,005
Дистиллированная вода - до 100 мл
Выход биомассы псевдомонад в предлагаемом способе составляет 25-30 млрд микробных клеток (м.к.) с 1 мл среды, а минимальная протеолитическая активность определяется при разведении бульонной культуры 1:10¹⁰ - 1:10¹² при индексе протеолиза 2, 3, определяемом путем отношения диаметра зоны просветления к диаметру лунки на молочно-солевом агаре.

Предлагаемый способ позволяет автоматически контролировать и поддерживать на оптимальном уровне основные параметры выращивания, что приводит к стабильному выходу продуктов культивирования. Аппаратное выращивание позволяет получить биомассу и экзоферменты в препаративных и промышленных масштабах. В связи с этим предлагаемый способ отличается высокой продуктивностью и технологичностью.

Пример 1. Выращивание псевдомонад осуществляют в среде с оптимальной концентрацией ингредиентов следующего состава, (мас.%):
Солянокислый гидролизат казеина - 0,5
Ферментативный гидролизат гороха - 0,35
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 0,1
Магний сернокислый семиводный - 0,03
Железо сернокислое пятиводное - 0,003
Дистиллированная вода - до 100 мл
PH среды устанавливают в пределах 6,8-6,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. Перед культивированием в нее добавляют в стерильных условиях перфтордекалин из расчета 10% от объема. В культуральный сосуд заливают приготовленную среду в количестве, равном рабочему объему такого сосуда. 24-часовую культуру псевдомонад, выращенную при 37^oC в пробирках со скошенным агаром, смывают 0,15 М раствором хлорида натрия, полученную суспензию засеивают в культуральный сосуд ферментера из расчета 10⁸ м.к. на 1 мл среды. Глубинное культивирование осуществляют при 30^oC и аэрации с расходом воздуха 2000 см³ в 1 мин на 1 л среды. PH поддерживают на уровне 6,9 путем добавления 10% раствора глюкозы. Контроль за ростом культуры проводят, отбирая пробы и определяя в них концентрацию биомассы по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича, а также макрокультуральным методом на плотных питательных средах. Протеолитическую активность определяют в разведенных пробах бульонной культуры методом диффузии в молочно-солевом агаре. Результаты оценивают по максимальному разведению бульонной культуры, способной образовать зону протеолиза.

Культивирование продолжают 18 ч, после чего полученную биомассу, содержащую протеолитические ферменты, используют для получения диагностических препаратов.

Предлагаемый способ позволяет получить 25-30 млрд м.к. в 1 мл питательной среды, а активность протеаз определяется при разведении бульонной культуры до 1:10¹¹ - 1:10¹².

Пример 2 (минимальный). Культивирование псевдомонад осуществляют по технологии, описанной в примере 1 на питательной среде при следующем соотношении ингредиентов, (мас.%):
Солянокислый гидролизат казеина - 0,3
Ферментативный гидролизат гороха - 0,3
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 0,05
Магний сернокислый семиводный - 0,01
Железо сернокислое пятиводное - 0,001
Дистиллированная вода - до 100 мл
Перфтордекалин добавляют в среду из расчета 5% от объема. Выход биомассы при использовании среды с минимальной границей концентрации ингредиентов снижается на 40-67%, а протеолитическая активность выявляется при разведении бульонной культуры до 1:10⁹ - 1:10¹⁰.

Пример 3 (максимальный). Выращивание псевдомонад осуществляют по технологии, изложенной в примере 1, используя максимальную границу концентрации ингредиентов, (мас.%):
Солянокислый гидролизат казеина - 1,5
Ферментативный гидролизат гороха - 0,4
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 0,13
Магний сернокислый семиводный - 0,04
Железо сернокислое пятиводное - 0,005
Дистиллированная вода - до 100 мл
Перфтордекалин добавляют перед культивированием в среду из расчета 15% от объема.

Размножение клеток и продукция ферментов в указанных условиях происходит также интенсивно, как и в способе с оптимальной концентрацией ингредиентов, однако применение среды с максимальной границей нерентабельно и ведет к удорожанию технологии.

Пример 4. Выращивание псевдомонад при отсутствии в среде перфтордекалина замедляет рост и размножение клеток, снижая урожайность в 1,5-2,0 раза, а протеолитическую активность в 1,2 раза.

Пример 5. Культивирование псевдомонад по оптимальной технологии (по примеру 1) при отсутствии в среде гидролизата гороха приводит к снижению концентрации биомассы на 13-27%. Активность протеолитических ферментов снижается незначительно.

Пример 6. Культивирование псевдомонад по оптимальной технологии (по примеру 1) без ферментативного гидролизата черного альбумина приводит к снижению концентрации биомассы на 13-27%. Активность протеаз уменьшается в 1,2 раза.

Пример 7. При культивировании псевдомонад по примеру 1 в течение 24 ч, урожайность биомассы снижается на 17-40%, протеолитическая активность уменьшается на 50%.

Пример 8. Выращивание псевдомонад осуществляют по оптимальной технологии, изложенной в примере 1, не проводя коррекцию pH 10% раствором глюкозы. Выход биомассы при этом снижается на 60-70%, активность протеолитических ферментов уменьшается более, чем на 40%.

Пример 9. Поверхностное культивирование псевдомонад в питательной среде с оптимальным соотношением ингредиентов без принудительной аэрации и коррекции pH позволяет получать биомассу в пределах 2-3 • 10⁹ м.к. с 1 мл среды, т. е. выход биомассы снижается на 90-93%, активность протеза выявляется при разведении бульонной культуры 1:10² - 1:10³.

Сводные данные по выходу биомассы и протеолитических ферментов псевдомонад на модели мелиоидозного микроба приведены в таблице.

Таким образом, использование предлагаемого способа культивирования обеспечивают высокую урожайность и протеолитическую активность патогенных псевдомонад.

Способ может быть использован в биотехнологии. Выращивают псевдомонады глубинным аппаратным способом при принудительной аэрации питательной среды. Продолжительность процесса 12-15 ч, температура 25 - 37^oC, pH среды 6,8 - 6,9, поддерживают добавлением 10% раствора глюкозы. Культивирование ведут в присутствии перфтордекалина в количестве 5 - 15 об.% от питательной среды следующего состава, мас.%: солянокислый гидролизат казеина 0,3-1,5, ферментативный гидролизат гороха 0,3-0,4, ферментативный гидролизат черного альбумина 0,05-0,13, магний сернокислый 0,01 - 0,04, железо сернокислое пятиводное 0,001 - 0,005 и дистиллированная вода до 100 мл. Получают 2,5-3,0•10¹⁰ м. к./мл биомассы и активные протеолитические ферменты, выявляемые при разведении бульонной культуры 1:10¹⁰ - 1:10¹². Способ обеспечивает высокую урожайность и протеолитическую активность патогенных псевдомонад.

Способ получения биомассы и протеолитических ферментов патогенных псевдомонад путем выращивания бульонной культуры продуцирующего микроорганизма в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что выращивание ведут глубинным аппаратным способом при принудительной аэрации питательной среды в течение 12 - 15 ч при 25 - 37^oС, pH 6,8 - 6,9, поддерживаемом добавлением 10%-ного раствора глюкозы в присутствии перфтордекалина в количестве 5 - 15 об.% от питательной среды следующего состава, мас.%:
Солянокислый гидролизат казеина - 0,3 - 1,5
Ферментативный гидролизат гороха - 0,3 - 0,4
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 0,05 - 0,13
Магний сернокислый семиводный - 0,01 - 0,04
Железо сернокислое пятиводное - 0,001 - 0,005
Дистиллированная вода, мл - До 100и