СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК Российский патент 1999 года по МПК C12N5/00 C12N5/08 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения культур клеток из органов и тканей человека и животных.

В биотехнологии широко используется способ получения культур клеток, в котором для дезагрегации и отделения клеток монослоя от субстрата используют препараты трипсина или химотрипсина, выделенные из поджелудочной железы свиньи или крупного рогатого скота [1]. Однако известно, что препараты трипсина и химотрипсина не обладают коллагенолитической активностью и практически не способны гидролизовать интерстициальный коллаген, что делает их применение неэффективным.

Известен способ получения культур клеток путем обработки органов ферментным препаратом коллагеназы, полученным из патогенного микроорганизма Clostridium histolyticum [2]. Основным недостатком данного способа является то, что препарат клостридиальной коллагеназы, полученный из вышеуказанного микроорганизма, содержит значительное количество патогенных и пирогенных примесей, которые практически невозможно исключить при очистке любым известным способом, что отрицательно сказывается на проценте выхода живых клеток. Кроме того, клостридиальная коллагеназа не способна гидролизовать неколлагеновые белки, что необходимо для более полной дезагрегации тканей и органов и как следствие увеличения выхода живых клеток. Данная коллагеназа проявляет максимальную активность при температуре 37^oC. При более низких температурах, оптимальных для получения культур клеток, ее активность недостаточна для эффективного применения.

Таким образом существует противоречие: трипсиноподобные ферменты не способны интенсивно гидролизовать интерстициальный коллаген, а коллагеназа - остальные неколлагеновые белки, гидролиз которых также необходим для полной дезагрегации тканей.

Указанное противоречие частично устраняется способом [3], в котором для культивирования клеток эукариотов используется ферментативный гидролизат мышечной ткани гидробионтов - ластоногих. Данный гидролизат содержит как коллагеназы (тканевые), так и общие протеиназы, присутствие которых обеспечивает более глубокую дезагрегацию тканей. Однако известно, что тканевые коллагеназы являются белками с высоким молекулярным весом и нестабильны в смеси с другими протеолитическими ферментами. Это свойство снижает эффективность применения тканевого гидролизата мышечной ткани при получении культур клеток.

Более эффективным для получения культур клеток является применение природных ферментных комплексов, обладающих как общей протеолитической, так и коллагенолитической активностями.

В качестве прототипа выбран способ получения культур клеток [4], в котором обработку тканей и органов осуществляют ферментным препаратом коллазы в растворе версена. Препарат коллазы представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью и выделен из гепатопанкреаса Камчатского краба. Прототип позволяет увеличить выход живых клеток по сравнению со способом [1] в 2-2,5 раза и обладает незначительным повреждающим действием на клетки в процессе дезинтеграции тканей.

Авторами установлено, что способ [4] позволяет получать культуры фибробластов и кератиноцитов с высокой степенью дезинтеграции и высоким выходом живых клеток. Но следует отметить, что гепатоциты из печени взрослого человека наиболее чувствительны к токсическому воздействию на клетки и это свойство делает их незаменимыми при проверке различных веществ на токсичность. Исследования показали, что при использовании раствора с оптимальной концентрацией комплекса ферментов из краба, позволяющей эффективно дезагрегировать ткань печени, проявляется повреждающее действие компонентов ферментного препарата из краба на клетки, что снижает выход жизнеспособных гепатоцитов. С другой стороны, снижение концентрации комплекса в растворе снижает эффективность способа из-за уменьшения степени дезагрегации тканей печени. Аналогично влияние температуры: ее повышение приводит к повышению выхода клеток, но снижает их жизнеспособность, а снижение делает способ неэффективным. Кроме того, известно, что процесс получения культур клеток из печени человека предъявляет особые требования к степени чистоты используемых препаратов, а препарат комплекса протеиназ из краба содержит не менее 0,5% примесей, необходимых для стабилизации комплекса протеиназ, но токсичных для гепатоцитов.

Вышеуказанные недостатки делают прототип недостаточно эффективным и ограничивают область его применения.

В основу изобретения поставлена задача расширения области применения способа получения культур клеток при увеличении выхода жизнеспособных клеток за счет повышения степени дезагрегации тканей и сокращения повреждающего действия на клетки.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения культур клеток, включающем обработку тканей и органов раствором комплекса коллагенолитических ферментов, полученного из пищеварительных органов гидробионтов, согласно изобретению в качестве указанного комплекса используют комплекс, полученный из пищеварительных органов головоногих моллюсков при концентрации комплекса по белку 0,01-0,4 мг/мл при температуре 0-18^oC.

Наилучший результат достигается при применении в качестве растворителя физиологического раствора или раствора глюкозы.

Авторами установлено, что комплекс коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов головоногих проявляет высокую активность в широком диапазоне температур и высокую стабильность. Это позволяет при выделении ферментного комплекса из кальмаров достичь высокой степени очистки (до 99,9%), недостижимой для препарата из крабов, в случае которого примеси играют стабилизирующую роль. Последнее обстоятельство препятствует применению препарата из крабов для эффективного получения культур клеток, наиболее чувствительных к токсичным примесям (например, гепатоцитов).

Ниже приведены примеры реализации заявляемого способа при использовании ферментного комплекса из кальмаров. Аналогичные нижеприведенным результаты были получены авторами при использовании ферментных комплексов из каракатиц и осьминогов.

Результаты, полученные в приведенных ниже примерах, сведены в таблице.

Пример 1. Получение культуры гепатоцитов из печени.

Печень взрослого человека промыли физиологическим раствором путем сосудистой перфузии под давлением до светло-желтого цвета. Затем через воротную вену ввели 1,3 л физиологического раствора, содержащего 0,01% препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов кальмара (до вздутия печени). После этого печень на 35 мин целиком погрузили в 5 л обогащенного кислородом физиологического раствора, содержащего 0,3 мг/мл препарата коллагенолитического комплекса. Все процедуры проводили при температуре 2^oC. Печень освободили от капсулы, ткань механически измельчили, полученную массу проинкубировали в термостате при температуре 10^oC в течение 30 мин, а затем профильтровали через фильтр с диаметром пор 40 мкм. К полученному фильтрату добавили физиологический раствор в соотношении 1:1 и полученную взвесь осаждали на центрифуге К-70 при 1000 об/мин в течение 5 мин.

Полученный осадок собрали и ресуспендировали в 1%-ном альбуминовом гидролизате. Для подсчета живых клеток отобрали 1 мл клеточной взвеси, содержание интактных клеток определяли по окрашиванию 0,2%-ным раствором трипанового синего с последующим микроскопированием. При окрашивании живые клетки оставались светлыми, а погибшие окрашивались в темно-синий цвет. Процент живых клеток составлял 72%.

Культуру клеток из взвеси получали по стандартной методике. Клеточную взвесь с концентрацией клеток 1 млн/мл засеяли в матрацы из расчета 100 тыс. клеток/см² рабочей поверхности и 200 тыс. клеток/мл среды - альбуминового гидролизата и сыворотки крови крупного рогатого скота. Культивирование производили в течение 3 сут при постоянном наблюдении путем микроскопирования (при 80 - кратном увеличении) на протяжении всего срока культивирования.

Пример 2. Получение культуры первичных фибробластов куриных эмбрионов.

Десятидневные куриные эмбрионы с удаленными глазами и кишечником механически измельчили (размер фрагментов 2х2х2 мм), промыли от крови раствором Хенкса и залили физиологическим раствором, содержащим коллагенолитический комплекс из пищеварительных органов кальмара при концентрации 0,02 мг/мл. Дезагрегацию ткани проводили в 4 цикла: в течение 15 мин суспензию перемешивали, надосадочную жидкость фильтровали (диаметр пор фильтра 60 мкм), для оставшихся фрагментов ткани процедуру повторяли. Все операции осуществляли при 18^oC.

Собранный фильтрат осаждали на центрифуге К-27 при 1000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендировали, клетки подсчитывали и культивировали как описано в примере 1.

Аналогичным образом получали культуры гепатоцитов, кератоцитов, фибробластов из различных источников. При этом в качестве растворителя использовали физиологический раствор, 5% раствор глюкозы и различные буферные растворы (Tris, HEPES, PIPES, фосфатный буферный раствор и др.). Были получены следующие результаты: выход интактных клеток составил 65-78%, при этом степень дезагрегации ткани была высокой. При сравнительных испытаниях заявляемого способа и способа-прототипа было установлено, что применение комплекса коллагенолитических протеиназ из кальмара для получения культуры первичных фибробластов из куриных эмбрионов выход интактных клеток увеличивается в 1,4 раза. Испытания также показали, что степень дезагрегации тканей мало зависит от применяемого растворителя, однако выход живых клеток максимален при использовании физиологического раствора и 5%-ного раствора глюкозы и составляет 72-78% (для сравнения: при использовании других указанных растворов выход живых клеток составляет 65-73%).

Для сравнения ниже приведен пример (аналогичный примеру 1) получения культуры гепатоцитов из печени взрослого человека с использованием протеолитического комплекса из краба.

Пример 3. Получение культуры гепатоцитов из печени.

Печень взрослого человека промыли 0,02% раствором версена. Затем ввели раствор версена, содержащий 0,01% препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов краба. После этого печень погрузили в указанный буферный раствор, содержащий 0,3 мг/мл препарата коллагенолитического комплекса. Все процедуры проводили при температуре 4^oC. Печень освободили от капсулы, ткань механически измельчили, полученную массу проинкубировали в термостате, а затем профильтровали. К полученному фильтрату добавили буферный раствор в соотношении 1:1 и полученную взвесь осадили на центрифуге.

Полученный осадок ресуспендировали. Содержание интактных клеток определяли по окрашиванию раствором трипанового синего. Процент живых клеток составлял 72%, однако выход клеток на единицу массы ткани уменьшился в 2,1 раза, поэтому количество живых клеток на единицу массы ткани было существенно ниже, чем при использовании препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из кальмара.

Пример 4. Получение культуры гепатоцитов из печени.

Аналогично предыдущему примеру 3 получали культуру гепатоцитов с применением комплекса протеаз из краба при температуре 18^oC, оптимальной для способа, описанного в [4], при этом выход клеток на единицу массы ткани увеличился в 1,5 раза и составил 66% от выхода по заявляемому способу, однако несколько уменьшилось содержание живых клеток.

Из вышеизложенного следует, что применение коллагенолитического комплекса из головоногих при получении культур клеток эффективно для различных органов и тканей человека и животных и позволяет увеличить как степень дезагрегации тканей, так и выход интактных клеток, применимых в том числе и для размножения вирусов. Снижение нижней границы рабочей температуры и концентрации коллагенолитического комплекса также способствует увеличению количества живых клеток, сохраняющих пролиферативную активность при пересевах.

Источники информации.

1. Р.Адамс. Методы получения культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983 г. стр.52-59.

2. Заявка ФРГ N 3413960, МКИ C 12 N 5/00.

3. Патент РФ N 2074249, МКИ C 12 N 1/00.

4. Патент РФ N 2067995, МКИ C 12 N 5/00 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии, предназначено для получения культур клеток из органов и тканей человека и животных. Способ получения культур клеток включает обработку тканей и органов раствором комплекса коллагенолитических ферментов, полученного из пищеварительных органов головоногих моллюсков. Концентрация комплекса по белку в растворе составляет 0,01-0,4 мг/мл, рабочая температура 0-18^oС. Наилучшие результаты достигаются при использовании в качестве растворителя физиологического раствора или раствора глюкозы. Способ позволяет увеличить как степень дезагрегации тканей, так и выход интактных клеток, применимых и для размножения вирусов. Снижение нижней границы рабочей температуры и концентрации коллагенолитического комплекса также способствует увеличению количества живых клеток, сохраняющих пролиферативную активность при пересевах. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения культур клеток, включающий обработку тканей и органов раствором комплекса коллагенолитических ферментов, полученного из пищеварительных органов гидробионтов, отличающийся тем, что в качестве указанного комплекса используют комплекс, полученный их пищеварительных органов головоногих моллюсков при концентрации комплекса по белку 0,01 - 0,4 мг/мл при температуре 0 - 18^oС. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют физиологический раствор или раствор глюкозы.