СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК Российский патент 1996 года по МПК C12N5/00 C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения культур клеток из органов и тканей человека и животного.

Известен способ получения культур клеток, когда для дезагрегации ткани и отделения клеток монослоя от субстрата используют препараты трипсина или химопсина, выделенные из поджелудочной железы свиньи или крупного рогатого скота [1] Недостатком известного способа является то, что сырье для получения трипсина и химопсина нестандартизовано и недостаточно контролируется, что приводит к возможности нахождения в нем патогенных примесей. Кроме того, раствор препарата химопсина при хранении быстро теряет свою активность [2]
Известен способ получения культур клеток почек свиньи путем обработки почек ферментным препаратом коллагеназой из Clostridium histoliticum в концентрации 0,1^oC0,15 мг/мл в фосфатном буфере рН 7,0^oC7,5 в течение 12^oC24 часов при температуре 16^oC22 ^o C [3] Одним из недостатков данного способа является то, что коллагеназу выделяют из патогенного штамма, требующего специальных условий для работы с ним. Кроме того, существенным ограничением известного способа является температурный режим действия фермента (16^oC22 ^o С), поскольку при получении первичных клеток из органов животных желательно проводить все операции при более низких температурах.

Известен способ получения эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска, где отдельные клетки получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы (производство ТИВОХ ДВО РАН) на искусственной морской воде без ионов Сa²⁺ и Mg²⁺ при температуре 6^oC10 ^o С [4] Этот способ приемлем для узкого круга клеток морских беспозвоночных животных. Недостатком его является высокая концентрация коллагеназы 1 мг/мл, что может быть объяснено использованием грубоочищенного фермента. Это, по-видимому, является одной из причин снижения доли жизнеспособных клеток к концу культивирования (до 60%).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения клеток при использовании смеси трипсин-версен [1] которому также присущи недостатки и ограничения, связанные с применением трипсина, приведенные выше. Кроме того, недостатком известных способов является низкий выход жизнеспособных клеток.

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности способа получения клеток из органов и тканей за счет повышения выхода жизнеспособных клеток, достигаемому снижением их гибели при обработке и улучшением диспергирования тканей.

Поставленная цель достигается тем, что обработку клеток органов и тканей проводят смесью версена и препарата коллаза, полученного из гепатопанкреаса краба, причем концентрация коллазы по белку в версене составляет 0,04^oC0,4 мг/мл, а обработку проводят при температуре 4^oC37 ^o C.

Новым в заявленном способе по сравнению с известным является использование препарата коллаза [5] в версене для дезагрегации ткани. Препарат коллаза представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью, выделенный из гепатопанкреаса Камчатского краба методами гель-фильтрации, сульфатаммонийного осаждения и колоночной хроматографии. По своей коллагенолитической активности коллаза не уступает высокоочищенным препаратам коллагеназы фирмы Sigma и одновременно имеет высокую протеолитическую активность. Предложенный способ получения культур клеток позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток в 2-2,5 раза по сравнению с использованием трипсина, обладает минимальным повреждающим действием на клетки, при этом клетки сохраняют пролиферативную активность, морфологию, продуктивность (СНОрЕ) и чувствительность к вирусам. Смесь версена и коллазы свободна от микоплазм. Кроме того, источником коллазы являются морские организмы, живущие в отдельной от человека экологической нише, и их рассматривают как относительно безопасный источник биопрепаратов по сравнению с трипсином, получаемым из поджелудочной железы животных.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения первичных фибробластов куриных эмбрионов. Готовят смесь 0,02%-ного версена с концентрацией коллазы 1 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,04 мг/мл и контроль стандартного препарата трипсина в концентрации 0,1 мг/мл. Используют 9-10 дневные куриные эмбрионы. Эмбрионы размельчают на кусочки 1,5-2,0 мм и промывают от крови 5-6 раз раствором Хенкса, содержащим по 100 единиц пенициллина и по 100 мкг стрептомицина на 1 мл. Полученную ткань помещают в колбы и заливают приготовленной смесью, нагретой до 37±1^o С в соотношении 1:1,3. Диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в течение 3-5 мин, проводя 5-6 циклов (повторяя 5-6 раз).

При каждом диспергировании надосадочную жидкость фильтруют через двойной слой марли и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования фермент сливают, а осадок ресуспендируют в 50,0 мл 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина.

Для подсчета клеток отбирают 1,0 мл клеточной взвеси, добавляют 1,0 мл 0,025%-ного раствора кристаллического фиолетового. Подсчет клеток проводят в камере Горяева, учитывая клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму. Расчет ведется по формуле:

где В объем клеточной суспензии в мл;
Х количество клеток в мл;
а среднее количество клеток в одной сетке камеры;
Г кратность разведения взвеси;
(20•1000)/18 коэффициент пересчета.

Клеточную взвесь при посевной дозе 100^oC120 тыс. кл/см² рабочей поверхности плоскостного флакона засевают в матрацы в концентрации 1 млн/мл и 200-250 тыс. кл/мл среды с гидролизатом лактальбумина с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота и инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 37± 1^oС. Наблюдение проводят на протяжении всего срока культивирования путем микроскопирования клеток (увеличение 70-80 х). С помощью коллазы в смеси с версеном из 1 г ткани получают примерно в 2 раза большее количество клеток по сравнению с использованием трипсина (см. таблицу 1).

Пример 2. Способ получения первичных фибробластов куриных эмбрионов при температуре +4^o C в течение 19 часов. Готовят смесь 0,02%-ного версена с концентрацией коллазы 1 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,1 мг/мл, и 0,04 мг/мл, контролем служит смесь версена с трипсином, концентрация последнего 0,1 мг/мл. Используют 9-10 дневные куриные эмбрионы с удаленными глазами и кишечником, которые помещают в колбу, заливают выше указанной смесью и оставляют при температуре +4^oC на 18 часов. По истечении этого срока раствор фермента сливают, в колбу с эмбрионами заливают раствор гидролизата лактальбумина, энергично встряхивают несколько раз до полного диспергирования ткани и фильтруют через двойной слой марли. Подсчет клеток и культивирование осуществляют как в примере 1.

При холодовом способе диспергирования тканей куриных эмбрионов при использовании коллазы в 0,02% -ном версене в диапазоне концентрации 0,1^oC1,0 мг/мл получают в 2 раза большее количество клеток по сравнению с трипсином (см. таблицу 2).

Пример 3. Способ получения первичных фибробластов японских перепелов при помощи коллазы. Сравнивают способность диспергировать ткани эмбрионов японских перепелов стандартного препарата кристаллического трипсина при концентрации 0,1 мг/мл и раствора коллазы в концентрации 0,4, 0,1 и 0,04 мг/мл. Получение и культивирование клеток проводят по способу, описанному в примере 1. Результаты приведены в таблице 3.

С помощью коллазы из 1 г ткани получают, примерно, в 2,0-2,5 раза большее количество клеток, используя в 4-10 раз меньшие концентрации фермента, чем в случае трипсина.

Пример 4. Способ получения первичных фибробластов японских перепелов при использовании смеси версена и коллазы, инкубирование в течение 18 часов при температуре +4^oС. Сравнение проводят с использованием смеси трипсина и версена в аналогичных условиях. Результаты представлены в таблице 4. При сопоставимых концентрациях трипсина и коллазы из 1 г ткани получают равное количество клеток.

Пример 5. Использование коллазы при пересеве перевиваемых культур клеток.

Сравнивают способность препаратов коллаза в концентрации 0,1; 0,03; 0,005 и 0,001 мг/мл в 0,02% -ном растворе версена отслаивать клетки от стекла, а также его влияние на пролиферативную активность перевиваемых клеток CV-1, МДСК, СНОрЕ, 4647 и диплоидных Л-68 в сравнении со стандартным препаратом кристаллического трипсина в концентрации 0,03 мг/мл.

При пересеве в культуральный сосуд с монослоем клеток вводят раствор трипсина или коллазы в количестве 1/50 объема матраса, споласкивают поверхность монослоя клеток, оставляя в сосуде небольшое количество раствора фермента. С помощью секундомера отмечают время с момента окончания обработки ферментом до момента процесса отделения клеток от стекла. Результаты обработки представлены в таблице 5.

Когда клетки начинают отделяться от стекла, вносят небольшое количество ростовой среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла и проводят подсчет клеток. Затем в суспензию добавляют необходимое количество ростовой среды и переносят в свежие культуральные сосуды. Культуры клеток инкубируют при температуре 37^oС в течение 3-4 суток до формирования плотного монослоя. Для проверки пролиферативной активности проводят до 5 пассажей. Данные приведены в таблице 6.

При пересеве в течение 5 пассажей при использовании коллазы клетки сохраняют пролиферативную активность. Причем концентрация коллазы может быть значительно ниже концентрации трипсина.

Пример 6. Изучение биологической активности вируса кори на клетках диплоидного штамма Л-68, обработанного препаратами коллазы и трипсина.

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека культивируют в течение 5 пассажей, используя для контроля при пересеве трипсина. Оба фермента используют в концентрации 0,1 мг/мл. На 6-ом пассаже клетки Л-68 были заражены вирусом кори штамм Л-16. Сливы проводят ежедневно с момента появления ЦПД. Определяют биологическую активность вируса в ТЦД 50/01 мл.

Результаты представлены в таблице 7.

Применение коллазы не оказывает отрицательного влияния на биологическую активность вируса кори, не приводит к изменению продуктивности культур клеток по сравнению с трипсином.

Таким образом, применение препаратов коллаза для получения культур клеток из органов и тканей человека и животных позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток. Кроме того такие культуры клеток могут успешно использоваться для размножения вирусов.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки.

1. Р. Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. М. Мир, 1983, стр. 52-59.

2. Инструкция по применению химопсина. Утверждена Фармакологическим Комитетом МЗ СССР 28 сентября 1963 г.

3. Заявка N 3413960, ФРГ, опубл. 17.10.85, кл. С 12 N 5/00. Способ получения культур клеток.

4. АС N 1745767 А1, опубл. 07.07.92, кл. С 12 N 5/00. Способ получения эмбриональных клеток двустворчатого моллюска Mizuchopecten yessoensis.

5. Технические условия. Препарат ферментный коллаза. ТУ-ОП. Госконцерн 00001927 18-92. ТТТ1 ТТТ2

Использование: относится к биотехнологии, а именно к способам получения культур клеток из органов и тканей человека и животных. Сущность изобретения: способ получения культур клеток заключается в обработке органов и ткани протеолитическим ферментом в растворе версена, при этом в качестве фермента используют коллазу в концентрации 0,04-0,4 мг/мл по белку, а обработку проводят при температуре 4-37^oC. 7 табл.

Способ получения культур клеток, включающий обработку органов и ткани протеолитическим ферментом в растворе версена, отличающийся тем, что обработку осуществляют ферментным препаратом коллазы, полученным из гепатопанкреаса краба, в концентрации по белку 0,04 0,4 мг/мл при температуре 4 37°С.