Способ получения культуры клеток эпидермиса человека Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

со о:) Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способам культивирования клеток чел века и животных. Известен способ культивирования культуры клеток эпидермиса человека путем отмывки кусочков кожи, отделе ния эпидермиса, дезагрегации ткани с последующим сбором клеток, концен трированием их и культивированием в пластиковых флаконах l . Известен также получения культуры клеток эпидермиса человека путем обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим ферментом, от делением эпидермиса и культивирован ем на подложкев питательной ереде 2. Однако известные способы не обес печивают высокого выхода жизнеспосо ных клеток и продолжительного их пе реживания в питательной среде. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных клеток и увеличение их переживания в культуре. Цель достигается тем, что соглас но способу получения культуры клеток эпидермиса человека путем обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолит ческим ферментом, отделением эпидер миса и культивированием на подложке в питательной среде, обработку антибиотиками проводят в присутствии 510% бычьей сыворотки при 4-б°С в те чение 6-12 ч, дезагрегацию проводят в 0,1-0,2%-ном буферном растворе коллагенаэы или гиалуронидазы, а культивирование осуществляют в присутствии 2-5% сыворотки крови человека, 2-4 ед./мп витамина А, 12 мкг/мл витамина Е, 0,1-0,2 мкг/мл витамина Вд и 1-2 мкг/мп питательной среды витамина К. Пример 1. Взятые у донора кусочки кожи промывают два раза по 5 мин в 0,02%-ном стандартном растворе :Версена, с Naj ЭДТА и помещают для обеззараживания в раствор следующего состава; раствор Хенкса с добавлением 10% бычьей сыворотки, 10 ед/мл пенициллина, 10 ед/мп стрептбмицина, 250 ед/мл нистатина. Кусочки кожи вццерживают в этом растворе при в течение 12ч (время варьирует в зависимости от возраста донора -и состояния кожи, в данном случае вйзраст донора 60 лет) .. Затем эти кусочки 2 раза промывают в 0,02%-ном стандартном растворе Версена для освобождения от больших концентраций антибиотиков и помещают для дезогрегации в 0,2%-ный раствор коллагеназы, приго.товленный на растворе Хенкса. Кусочки кожи вьадерживают в этом растворе при комнатной температуре в течение 6 ч. Отделение эпидермиса от контролируют под бинокулярным микроскопом: последовательно наблюдают отслоение эпидермиса от дермы, рогового слоя от собственно эпидермиса и последующую дезагрегацию eroi Отслоившиеся клетки сливают, дерму и роговый слой отбрасыва:ют. Клетки эпидермиса собирают центрифугированием при 500 об/мин в течение 10 минСобранные клетки ресуспендируют в ростовой питательной среде следующего состава: среда Игла, 7% бычьей и 3% человеческой сыворотки, 2 ед/мп витамина А, 1 мкг/мл витамина Е, 1 мкг/мл витамина К (викасол), .0,2 мкг/мл витамине Клетки (концентрация 5-10 клеток/мл) засевают во флаконы Карреля на ацетатцеллюлозную пленку. Культивирование проводят в атмосфере 95% воздуха и 5% COj при и 80% влажности. I На 15-й день культивирования колонии клеток эпидермиса вырастает в сплошной слой. Выход клеток с 1 см подложки 1«10 клеток, т.е. количество клеток увеличивается вдвое. Культура представляет собой сплошной газон из 2-3 слоев шиповидных клеток. Роста фибробластов (клеток дермы) не обнаружено, как и не обнаружено керанизированных (ороговевших) клеток эпидермиса. Пример 2. Взятые у донора (возраст 40 лет) кусочки кожи дважды промывают по 5 мин в 0,02%-ном растворе Версена, освобождают от микрофлоры в растворе Хенкса, содержащем 5% бычьей сыворбтки, 10 ед/мл пенициллина, 10 ед/мл стрептомицина, 250 ед/мл нистатина при в течение 6 ч. После обработки антибиотиками кусочки кожи споласкивают 2 раза в 0,02%-ном растворе Версена и помещают для дезагрегации в 0,1%-ный раствор гиалуронидазы на растворе Хенкса, в котором они находятся при комнатной температуре в-течение 6 ч. Получают суспензию клеток эпидермиса аналогично примеру 1. Культуру клеток выращивают во флаконах Карреля на ацетатцеллюлозной пленке при засеве в концентрации 5«10 клеток/мл в питательной среде следующего состава: среда Иглы, 8% бычьей и 2% челове еской сыворотки, 4 ед/мп витамина А, 2 мкг/мп витамина Е, 2 мкг/мл витамина К, 0,1 мкг/мл витамина В,2 в условиях примера 1. Сплошной газон клеток эпидермиса образуется на 17-й день культивирования. Морфологический контроль показывает, что слой состоит из шиповидных клеток эпидермиса. Ороговевших клеток и фибробластов не обнаружено.

Выход клеток (1,2-1,5)10 с единицы пoвepkнocти обрабатываемого ку- сочка кожи, срок сохранения жизнеспособности 40-45 дней, по известному способу - 0,5-10 клеток с 1 см, при этом полученная культура клеток для пересадки неполностью освобождена от микрофлоры, что загрязняет материал.

Использование изобретения позволяет получать клетки эпидермиса в большом количестве в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени, так как получаемая культура клеток несодержит посторонней микрофлоры.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУ КЛЕТОК ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА путем Обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим фе{ ментом, отделением эпидермиса и культивированием на подложке в питательной среде, о т .л и ч а .ю. щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных клеток и увеличения времени их переживания в культуре, обработку антибиотиками проводят в присутствии 5-10% бычьей сывсфотки при 4-6°С в течение 6-12 ч, дезагрегацию проводят в 0,1-0,2%-ном буферном растворе коллагеназы или гигтуронидазы, а культивирювание осуществляют в присутствии 2-5% сыворотки крови человека, 2г4 ед./МП витамина А, 1-2 мкг/мл витамина Е, 0,1-0,2 мкг/мп витамина I и 12 мкг/мл питательной среды витамина К. (Л