Изобретение относится к способу и набору лекарственных средств для достижения пероральной контрацепции у гонадных самок млекопитающих и регулирования менструации и/или уменьшения внезапного кровотечения у самок в пре-, пара и постменопаузе с помощью эстрогена или эстроген-прогестина в комбинации с антипрогестином.
Хотя торможение овуляции в форме пероральных противозачаточных средств на основе эстроген/прогестиновой комбинации является наиболее эффективной стратегией для достижения обратимого фармакологического регулирования рождаемости у женщин, однако вследствие известных неблагоприятных побочных действий, связанных с долгосрочной контрацепцией этим способом, особенно у курящих женщин в возрастной группе от 40 до 44 лет, в течение ряда лет возник интерес к достижению контрацепции меньшими дозами эстрогена.
Так, в течение более 30-летней истории комбинированной пероральной контрацепции с помощью эстроген/прогестиновой комбинации наблюдается неуклонное уменьшение ежедневной дозы эстрогена как для целей пероральной контрацепции у самок в пременопаузе, так и для заместительной эстрагентерапии самок в постменопаузе. См., например, EP-A-O 253 607, которая раскрывает, в качестве предпочтительного варианта, введение самкам в пременопаузе ежедневно по таблетке, содержащей 1 мг 17 - эстрадиола и 0,075 мг левоноргестреля в течение 23 или 24 (23-26) дней с последующими 5 или 4 (2-5) "беспилюльными" или пустопилюльными днями, всего в течение 28 дней на цикл, и указанные в нем литературные источники, содержание которых включено в настоящую заявку в виде ссылки на них.
Одновременно, хотя и прогестиновый компонент несколько снижен, однако уменьшенная андрогенность остается неизменным приоритетом. Совместно, эти адаптации состава представлены в разнообразных режимах, как однофазных, так и многофазных. В результате сегодняшние пероральные противозачаточные средства гораздо безопаснее с точки зрения распространения и серьезности обусловленных эстрогеном расстройств свертывания крови, а также кумулятивного действия более "липидно-дружественных" прогестинов, поддерживающих в циркуляции уровни высокоплотного липопротеинового холестерина. См. Spellacy, WN et al., "Am J Obstet Gynecol" 1980; 137; 109; Scott, JZ et al., "Fertil Steril" 1978; 30; 141; Mishell, DR Jr et al., " J Reprod Med." 1990; 35 (Suppl. 4) : 447 - 481; Speroff L., "Contemp Obstet Gynecol" 1991; 36-65; Meilis GB et al. , "Contraception" 1991; 43; 23; and Stampefer MJ, Willett WC et al., "Am J. Obstet Gynecol" 1990; 163; 285.
Эта эволюция пероральных противозачаточных препаратов наиболее быстро происходила в Европе и неуклонно проявляется также в Америке. И действительно, накопление данных, основанных на пероральных противозачаточных пилюлях, содержащих лишь 20 - 25 мкг эстрогена в день, побудило Консультативный Комитет по лекарствам для охраны материнского здоровья Управления пищевых продуктов и лекарственных средств указать низкодозные пероральные контрацептивы для здоровых некурящих женщин во время перименопаузы (годы, например, от 35 до 50 лет), [см. Mishell (1990) and Speroff (1991)], cм. выше; U.S. Food and Drug Administration, Advisory Committee on Maternal and Reproductive Health, 1989, Rockville, Maryland; and Rosenberg, L. et al JAMA 1985; 253:2965.
В Японии пероральные противозачаточные средства в настоящее время впервые проходят оценку по критериям безопасность и эффективность и ожидается, что они будут полностью доступны для врачей и пациентов приблизительно через один год.
При рассмотрении вопроса дальнейшего снижения ежедневной дозы эстроген-прогестиновых лекарств в пероральных контрацептивах необходимо учитывать два главных момента, а именно: (1) сохранение противозачаточной эффективности и (2) предупреждение дальнейшей эрозии в регуляции эндометриального кровотечения. В то время как доступные сегодня противозачаточные средства, предназначенные для перорального применения даже в самых малых дозах, демонстрируют устойчивую противозачаточную эффективность, в целом распространение проблем регуляции кровотечения, проявляющихся как во внезапных кровотечениях (несвоевременное кровотечение или выделения) или в обусловленной отменой приема лекарств аменореи во время "беспилюльной" недели (ожидаемая менструация) возросли с уменьшением доз эстроген/прогестина. См. Gray, RH. в "Endometrial Bleeding and Steroidal Contraception"; Diezfalusy E, Fraser RS, Webb FTE (Eds). Bathe, England: Pittman Press; 1990:14-19, and Collbey G. et al., "Contraception" 1982; 26-229.
Целью настоящего изобретения является решение проблемы регуляции кровотечения, связанной с уменьшением ежедневной дозы эстрогена и/или прогестина, когда оба принимаются одновременно, в пероральных противозачаточных средствах, в заместительной гормонотерапии.
Другая цель состоит в том, чтобы предложить способ достижения контрацепции у гонадной самки млекопитающего при ультранизких пероральных дозах эстрогена и/или прогестина.
Другой целью является предложение такого способа, который обеспечивает нормальную менструацию и который регулирует ее начало.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предложить такой способ, в котором лекарство вводится без контроля врача.
Дальнейшей целью является предложение способа, не имеющего побочных эффектов, связанных с обычной или низкодозной пероральной эстроген/прогестиновой контрацепцией или заместительной гормонотерапией.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предложить набор лекарственных средств для осуществления способа согласно настоящему изобретению.
Еще одна цель состоит в предложении фармацевтической композиции, эффективной для того, чтобы вызывать менструацию и/или уменьшать несвоевременное кровотечение (внезапное кровотечение, пачканье) у саки, находящейся на эстроген/прогестиновой пероральной контрацепции или заместительной эстроген и/или прогестинтерапии.
Прочие цели будут очевидны для специалиста в той области, к которой относится настоящее изобретение.
Настоящее изобретение относится к способу избежать проблемы кровотечения, связанные с введением самке млекопитающего дозированных количеств эстрогена, одного или в комбинации с прогестином, достаточно низких, чтобы создавать случаи внезапного кровотечения или аменореи, обусловленной отменой приема лекарства, который состоит в том, что самке периодически дают количество антипрогестина, эффективное для того, чтобы уменьшить или устранить внезапное кровотечение и, при желании, также вызвать отторжение скопившейся эндометриальной ткани, благодаря чему индуцируется менструация.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, пригодной для перорального приема и для вызывания менструации у самки, находящейся на пероральной эстроген-прогестиновой контрацепции или эстроген- или эстроген-прогестиновом заместительном гормональном лечении, содержащей вызывающее менструацию количество антипрогестина, в смеси с количествами эстрогена и прогестина, эффективными для достижения пероральной контрацепции, когда такие количества приняты внутрь гонадной самкой ежедневно без перерыва в течение по меньшей мере 20 дней подряд.
Настоящее изобретение относится к набору лекарственных средств, содержащему расположенные в обычном порядке, например, наподобие "Левиен 21" Лабораторией Берлекс, по меньшей мере 20 пероральных единиц доз, каждая содержащая эстроген и прогестин в количествах, в которых они коллективно эффективны, когда одна единица дозы из набора принимается внутрь ежедневно в течение 20 или более дней, для достижения пероральной котрацепции у женщин, но которые способствуют случаям внезапного кровотечения и/или аменореи, обусловленной отменой приема лекарства.
В первом варианте набора согласно настоящему изобретению предусмотрена дополнительная единица пероральных доз, содержащая лишь вызывающее менструацию количество антипрогестина, расположенная так, чтобы быть принятой внутрь после приема внутрь 20 или более эстроген/прогестиновых пероральных единиц доз. В одной разновидности этого варианта выполнения набора лекарственных средств количество пероральных единиц доз на основе комбинации эстроген/прогестин, которое предшествует антипрогестин-содержащим пероральным единицам доз, повышено, например, до 21 или более, составляя, например, от 20 до 180 единиц. В другой разновидности, предназначенной для использования при заместительной эстрогентерапии самками в пара и постменопаузе, прогестин отсутствует в некоторых или во всех таблетках, а антипрогестин присутствует в количестве, значительно уменьшающем или устраняющем неожиданное кровотечение и/или вызывающем отторжение скопившейся эндометриальной ткани. Эти разновидности предназначены для лиц, желающих увеличить продолжительность их менструальных циклов, регулируемых лекарственными средствами, за пределы обычного 4-недельного срока.
Во втором варианте набора согласно настоящему изобретению предусмотрены расположенные для приема после 20 или более пероральных единиц доз первого варианта, описанного выше, например, наподобие "Левиен 28" Лабораторий Берлекс, 6 или более единиц оральных доз "плацебо" для поддержания режима "одна пилюля в один день" и напоминающие лицу, когда начинать новый цикл приема.
В третьем и предпочтительном варианте набора вместо 6 или более единиц пероральных доз "плацебо", описанных выше, набор содержит 28 или 30 единиц пероральных доз, каждая из которых содержит низкодозные количества эстрогена и прогестина, соответствующие первым 21 единице доз первого варианта. В этом варианте единица дозы, расположенная для приема на 22 день, также содержит вызывающее менструацию количество антипрогестина.
Настоящее изобретение основано на открытии, что случаи неожиданного кровотечения и аменореи, обусловленной отменой приема лекарства, частота которых возрастает, когда пероральная контрацепция достигается при более низких, чем обычно, дозах эстрогена и прогестина, могут быть сведены к минимуму или исключены полностью путем вызывания менструации антипрогестином, либо во время "безлекарственной", т.е. свободной от эстрогена и прогестина, недели месячного цикла ежедневного перорального приема эстрогена и прогестина в течение приблизительно 21 дня, либо предпочтительно в любое время, когда менструация желательна, во время непрерывного ежедневного приема эстрогена и/или прогестина.
Нормальная менструация может быть также достигнута антипрогестином без прерывания одновременно продолжающегося непрерывного режима контрацепции с помощью малых пероральных доз эстроген/прогестина. Непрерывный режим пероральной контрацепции с помощью ультрамалых эстроген/прогестиновых доз в комбинации с периодическим введением, например через интервалы в 30, 60 или 90 дней, антипрогестина, например RU 486, обеспечивает предсказуемую менструальную регуляцию.
Физиологический мотив для такого подхода состоит в том, чтобы поддержать меньшую степень фармакологического ингибирования гипофизно-яичниково-маточной оси, но с помощью непрерываемого режима избежать "фолликулярного истечения". При сегодняшних пероральных контрацептивах пониженной дозы энергичный рост яичникового фолликула может возобновиться быстрее во время "безпилюльного" интервала, чем когда использовались пилюли более высокой дозы в прошлые десятилетия.
В свою очередь, усиленная эндогенная секреция эстрадиола с быстрой эндометриальной пролиферацией, которая, как известно, ускоряется во время "беспилюльного" 7-дневного периода, имеет своим результатом меньшее межменструальное неожиданное кровотечение и также меньшую аменорею, обусловленную отменой приема лекарства. Прерывистая дача прогестеронового антагониста расписана так, чтобы обеспечить отторжение скопившейся эндометриальной ткани через каждые четырехнедельные или большие интервалы, например через 60, 90, 120, 150, 180 или более дней, без безпилюльного перерыва режима пероральной контрацепции.
Прерывистое, т. е. ежемесячное или с большим интервалом, например двух- или трехмесячное ежеквартальное или полугодовое введение антипрогестина для стимулирования менструации в соответствии с настоящим изобретением, позволяет избежать проблем ненормального кровотечения, например внезапного кровотечения и аменореи, обусловленной отменой приема лекарства, путем поддержания фолликулярно-фазного уровня эндогенного сывороточного эстрадиола на более высоком значении, чем то, которое связано с обычной пероральной контрацепцией с низкими дозами эстроген/прогестина.
В нормальном менструальном цикле прогестерон производится из желтого тела, возникающего после овуляции. В способе контрацепции согласно настоящему изобретению прогестин вводится вместе с эстрогеном по меньшей мере к концу каждого регулируемого цикла, например во время приблизительно последних двух недель каждого цикла, чтобы превратить разросшийся эндометрий в секреторную фазу, тем самым снижая риск эндометриальных карцином, связанных с беспрепятственным действием эстрогена.
Однако менструация достигается и одним антипрогестином, безотносительно к тому, прерывается или нет введение эстрогена и/или прогестина во время менструационной недели менструального цикла, когда вводится антипрогестин.
Ежедневные пероральные дозы эстрогена и прогестина, которые вводятся, являются, вообще говоря, самыми низкими, которые обеспечат надежную контрацепцию или заместительную гормонотерапию женщин, а именно дозами, контрацептивно эквивалентными приблизительно 5 - 35 мкг этинилэстрадиола и приблизительно 0,5 - 1,5 мг норэтиндронацетата. Ежедневные дозы могут быть теми же самыми в течение всего месяца или могут изменяться из недели в неделю, как в случае "Три-Левиен" Лабораторией Берлекс, например, когда желательна менструация раз в месяц, в этом случае дозы обоих или одного из них могут быть снижены или исключены во время менструальной недели цикла. Однако, если введение их исключается или снижается во время менструальной недели, их дозы во время других недель цикла предпочтительно увеличиваются соответственно, например во время второй и особенно во время третьей недели для того, чтобы обеспечить непоявление внезапного кровотечения раньше менструации.
Подобно этому, когда менструация раз в месяц нежелательна, например в случае пост-менопаузы, дозировка эстрогена и/или прогестина может быть периодически увеличена на короткое время, например в заранее определенный период после последней менструации, выше исходной долгосрочной дозы для подавления изолированных случаев внезапного кровотечения как результат низких уровней дачи эстрогена и/или прогестина в течение продолжительного периода времени.
Примеры прогестинов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают прогестерон (15 - 50 мг/день), норэтиндрон и его сложные эфиры, например ацетат (0,1 - 0,75 мг/день); норэтинодрел (0,3 - 0,6 мг/день); этинодиолдиацетат (0,3 - 0,75 мг/день), норгестрел (0,05 - 0,2 мг) и лево-норгестрел (0,03 - 0,15 мг/день), хлормацинонацетат, ципротерон, ципротеронацетат, норэтиндрон, дезогестрел, норгестимат, дигидроспиренон, спиренон, левр-норгестрел и гестоден (Шеринг А.Г, Берлин; пат. США 4081537) (эквивалентно 0,03 - 0,15 мг левоноргестрила).
Перечень соединений, см. статью из книги B. Runnebaum et al., "Female Contraception: Update and Trends", Springer-Verlag, Berlin, 1988, pp. 64 - 90, 109 - 121, 122 - 128, and 129 - 140, описывающую активные соединения, способствующие наступлению и сохранению беременности. См. например, стр. 65 и стр. 68 - 70, которые перечисляют различные прогестины; стр. 110 и 111 (фигуру 1 и таблицу 1), которые перечисляют синтетические прогестогены; стр. 122, фигуру 1, которые перечисляют гестагены, и стр. 129 - 133 (фигуры 1 - 10) и стр. 137, таблицу 2, которые перечисляют прогестогены или долгодействующие сложные эфиры эстриола, описанные в пат. США 4681875 и 4738957.
Примеры эстрогенов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают: этинилэстрадиол и эстрадиол и их сложные эфиры, например ацетат, валерат, бензоат и ундецилат (5 - 15 мкг/день), местранол (20 - 25 мкг/день) и сопряженные эстрагены (5 - 15 мкг/день).
Прогестин и эстроген могут быть введены в организм обычным способом любым путем, при котором выбранный прогестин и эстроген активен, например перорально, путем внутримышечной инъекции, трансдермально или через вагинальное кольцо. Большинство эстрогенов и синтетических прогестинов перорально активны и поэтому вводятся в организм этим путем, например в форме таблетки, драже, капсулы или пилюли. Если прогестин и/или эстроген вводятся в форме таблетки или драже, последняя может при желании содержать фармацевтически приемлемый носитель, например связующее, такое как трагакант, кукурузный крахмал или желатин; дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, и смазывающее вещество, такое как стеарат магния. Эстроген и/или прогестин могут быть также введены трансдермально или с помощью вагинального кольца.
Эстроген и/или прогестин предпочтительно вводятся без перерыва, так как антипрогестин один эффективно вызывает менструацию, или введение их может прерываться во время или перед менструацией, например начиная с дня 1 введения антипрогестина и в течение приблизительно 6 дней после этого. Таким образом, эстроген и прогестин могут вводиться без перерыва меньшими, чем обычно, дозами в течение до 6 месяцев или дольше, в течение какового времени менструация может быть вызвана с желательной и заранее выбранной частотой, например каждые 20, 30, 60, 90, 120, 150 или 180 дней, путем введения вызывающего менструацию количества антипрогестина за 1, 2 и/или 3 дня до желательного дня начала менструации.
Примеры антипрогестинов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают: RU 486 ("Мифепристон", Руссел Уклаф, Париж); и "Онапристон" (Шеринг А.Г., Берлин; пат. США 4780461) и стероиды, описанные в следующих патентах и патентных заявках: пат. США 4609651, особенно соединение лилопристон (11 β - (4- диметиламино-фенил- 17 β - гидрокси- 17 α- (3- гидрокси-проп-1- (z)- ензил - 4,9 (10) эстрадиен-3-он); заявка на пат. США пор. N 06/827050, особенно соединения 11 β - 4 - ацетилфенил) - 17 β - гидрокси - 17 α - (1 - пропинил) - 4,9 - эстрадиен-3-он и 11 β- (4- ацетилфенил) - 17 β - гидрокси - 17 α] - (3- гидрокси - 1 (2) - пропенил) - 4,9 - эстрадиен- 3-он; заявка на пат. США пор. N 07/283632; заявка на пат. США пор. N 07/541806, соответствующая опубликованной заявке на европейский патент ER-A 04042831; и другие антигестационные вещества, например пат. США 4891368. Количество антипрогестина, вводимое в виде однократной дозы или в виде разделенной общей дозы в течение 24 - 72- часового периода, обычно равно от 50 до 500 мг. Минимальное количество, требуемое для предсказуемого вызывания менструации, может быть легко определено рутинными клиническими экспериментами.
После того как антипрогестин введен в организм, например в виде разовой дозы или разделенной общей дозы в тот же день или в последующие дни, обычно менструация наступает в течение 3 - 4 дней вслед за этим.
При желании, антипрогестин может быть введен в смеси с ежедневной дозой эстрогена и прогестина в соответствующий день или соответствующие дни цикла, например в день 20 или в любой день после, т.е. в день 30, 60, 90, 120, 150 и/или 180.
Настоящее изобретение относится к материалам, реагентам и наборам лекарственных средств для осуществления способа.
В части набора лекарственных средств настоящее изобретение направлено на во всех остальных отношениях обычное изделие кратных доз, содержащее 20 или 28 единиц доз, рассчитанных для перорального введения в организм. Все разновидности набора содержат в их первых 20 или более единицах суммарно такое количество эстрогена и прогестина, которое может эффективно, когда одна единица дозы из набора вводится самостоятельно без контроля со стороны врача, в течение 21 дня подряд, заблокировать фолликулогенез на один цикл, но которое меньше, чем то количество их, которое эффективно устраняет проблемы кровотечения. Последняя единица из разновидности, состоящей из 21 единицы, доз, и 22-я единица из разновидностей, состоящих из 22 и 28 единиц доз, содержат количество антипрогестина, которое эффективно в предотвращении проблем кровотечения и в вызывании менструации. Единицы доз от 22-й до 28-й из разновидности изделия, содержащей 28 единиц доз, содержат каждая подобно первым 21 единицам доз, низкодозные количества эстрогена и прогестина.
Предпочтительно, чтобы единичные дозы, содержащие эстроген и прогестин и/или антипрогестин, были предусмотрены для перорального применения, но альтернативно могут быть приспособлены для подъязычного, ректального, вагинального или местного (через кожу) применения. Также предпочтительно, чтобы единичные дозы рассчитанные для орального применения, были бы в форме таблеток, капсул или драже. Далее предпочтительно, чтобы антипрогестин содержался в той же единичной дозе или дозах, в которых содержится эстроген и прогестин.
Фармакологические композиции, используемые в способе по настоящему изобретению, будут содержать обычно антипрогестин совместно с обычным фармацевтически приемлемым носителем. Обычно эффективная доза антипрогестина составляет от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мг на килограмм веса тела хозяина, когда применяется орально. Эффективные дозы будут изменяться вместе с выбранным режимом введения и в зависимости от вида млекопитающего, которому они вводятся.
В части фармацевтической композиции настоящее изобретение относится к форме пероральной дозы, например пилюле, таблетке, колпачку или капсуле или жидкости, содержащей вызывающее менструацию количество антипрогестина, в смеси с количеством, которое перорально контрацептивно, когда соответствующие его количества принимаются внутрь гонадной самкой млекопитающего в течение 21 дня подряд, перорального эстрогена или перорально активного прогестина и, при желании, обычным фармацевтически приемлемым носителем, например связующим, наполнителем или разбавителем в случае твердой формы дозы, или водной или спиртовой жидкости, например, как описано выше.
Композиция предназначена для проглатывания лицом, находящимся в непрерывном или последовательном режиме контрацепции с помощью эстрогена и прогестина, например обычного ежедневного комбинированного глотания эстрогена и прогестина, когда желательна менструация.
Фармакологическая композиция согласно настоящему изобретению позволяет отпускать пероральный эстроген/прогестин, например, в бутылочках по 30, 60 или 100 таблеток или капсул или в бутылках жидкости, поскольку ежедневная доза их может оставаться неизменной в течение всего периода приема лекарства.
Без дальнейшего уточнения, считается, что специалист в данной области может, используя предшествующее описание, применить настоящее изобретение в его полном объеме. Нижеследующие предпочтительные специфические варианты воплощения изобретения, следовательно, должны пониматься исключительно как иллюстративные, не ограничивающие изобретение.
В предшествующих и последующих примерах все температуры приведены неисправленными в градусах Цельсия и, если не указано иное, все части и проценты даны по весу.
Примеры
Пример 1
Прерывистое введение антипрогестина во время непрерывной ультранизкодозной контрацепции
Приматы
Были выбраны тридцать четыре взрослые макаки (Macaca mulatta), имеющие регулярный предположительно овуляторный менструальный цикл (28,7±3,4 дня в месяц, предшествовавший началу изучения). Продолжительность спонтанной менструации у них составила 3,7±1,6 дня. Эти приматы являются ценными лабораторными суррогатами для исследований, относящихся к применению пероральных контрацептивов человека благодаря обширным сходствам с функциями гипоталамно-гипофизно-яичнико-маточной оси у женщин. См. Hodgen, GD., "Fertil Steril 1982; 38 - 281; Danforth DR. et al., "Contraception" 1989; 39 - 321; and van Uem JFHM, et al., "Contraception" 1989; 40 - 171.
Средний вес тела обезьян был 5,8±1,6 кг (X±EM). Они были помещены индивидуально в контролируемую среду (12 часов света и 23oC). Их диета состояла из пищи приматов, имеющейся в продаже (Пурина, Сейнт-Луис, МО), и без ограничения воды.
Медицинская Школа Восточной Виржинии имеет зарегистрированное оборудование для исследования животных, которое благодаря ее Комитету по уходу и использованию животных соответствует стандартным обследованиям, установленным в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных" Национального Института Здоровья, в "Принципах ухода и использования лабораторных животных", Общественной службой здоровья и Правилах Департамента сельского хозяйства США по применению поправок от 1985 года к Закону об охране животных.
Исследование проводилось в две части: Часть 1 представляла собой адаптационный интервал трех циклов перорального контрацептивного лечения, каждый из которых состоял из пероральной лекарственной терапии с введением лекарства в течение 21 дня с последующими 7 днями без введения лекарства, имитируя таким образом традиционный режим использования имеющихся в торговле пачек пероральных противозачаточных пилюль. Этот план предусматривал, что все (32 обезьяны закончили курс) особи подвергались во время начального настроечного интервала режиму лекарственной терапии, для которого прежние данные, полученные с людьми, показывали кратковременно более высокую распространенность кровотечения, чем это случается среди более длительно пользующихся контрацептивами. См. Gray (1990); Culbey et al. (1982), supra.
Влагалищные мазки (аппликаторы с хлопчатобумажным наконечником, смоченные в 0,9%-ном солевом растворе) и другие ручные процедуры проводились ежедневно между 7 и 9 часами утра для обнаружения кровотечения (записывались субъективно как пачканье, умеренный поток или явная менструация). Только в лечебном цикле 2, но включая предшествующую неделю, ежедневные пробы крови собирались из бедренной вены под легкой кетаминовой анастезией (30 - 50 мг, в Веталаре, Парк Дэвис, Морис Плейнз, Нью-Джерси). Сыворотку собирали и замораживали (-15oC) до радиоиммунологического анализа эстрадиола и прогестерона (Danforth et al. (1989); van Vem et al., (1989) supra), который заканчивался до начала части II исследования, обеспечивая таким образом, что ингибирование овуляции достигалось режимами ультрамалых доз.
В Части II, 30 из этих приматов были случайным образом распределены по пяти лечебным группам по шесть в каждой из этих групп: (1) пероральная контрацептивная терапия, применявшаяся в Части I, была продолжена (21 + 7 - дневный режим) в течение 6 месяцев, (2) непрерывная (отсутствие "беспилюльного" интервала) ежедневная эстроген-прогестиновая лекарственная терапия, с комбинированной однодневной пероральной дачей антипрогестина (RU 486) на 30-й, 60-й, 90-й, 120-й, 150-й и 180-й день исследования; (3) то же, что в группе 2, за исключением того, что прогестероновый антагонист давали только на 60-й, 120-й и 180-й день; (4) то же что и в группе 2, за исключением того, что RU 486 давали только на 90-й и 180-й день; и (5) 180 дней непрерывной ежедневной эстроген-прогестиновой терапии, но без какого либо лечения антипрогестином.
Ежедневное наблюдение с целью обнаружения вагинальной крови, как в Части 1 выше, было прекращено на 187-й день. Бедренную кровь собирали один раз в неделю в течение всего периода, чтобы идентифицировать возможную резкую овуляцию через повышение прогестерона; значение сыворотки выше 1,0 нг/мл рассматривались как показательные для лютеальной функции яичника и возможной овуляции. Подобно этому, эти же самые образцы анализировались на уровне эстрадиола, чтобы наблюдать начинающийся эндогенный биосинтез эстрогена. Две обезьяны, в группе 1 и группе 3, были исключены из ведущегося протокола, одна из-за сыпи на кожеи, а другая из-за инфекции большого пальца кисти, которая потребовала местного лечения. Ни один из этих случаев, как полагали, не был связан с гормональным лечением.
Для достижения пероральной контрацепции с ультрамалыми дозами и для приспособления покупных лекарств, используемых в исследовании, к меньшему (чем у человека) весу тела этих лабораторных приматов применяли пероральную дозу 1,2 мкг/день этиналэстрадиола и 0,06 мг/день норэтиндронацетата. Это достигалось размалыванием в порошок коммерчески доступной пилюли ("Лоестрин 1/20" в обычной 21-дневной упаковке, Парк Девис, Морис Плейнс, Нью-Джерси), содержащей 1 мг норэтиндронацетата и 20 мкг этинилэстрадиола на таблетку.
В цикле Части II давали с перерывами RU 486 ("Мифепристон", Руссел Уклаф, Париж) в качестве единственных 50-миллиграммовых таблеток в комбинации с непрерывным режимом пероральной контрацепции эстроген-прогестином, за исключением животных групп 1 и группы 5. Прежние исследования показали, что эта доза RU 486 будет достаточна для оттеснения естественного прогестерона от эндометриального, миометриального и цервикального рецепторов, тем самым вызывая быстрое (обычно в течение 48 часов) и полное отторжение как маточной донной, так и перешейковой ткани, сравнимое со спонтанной менструацией.
См. Healy DL, et al., "Fertil Steril" 1983; 40:253; Danforth DR et al., Contraception 1989; 40:199.
Так как эстрогеновый и прогестиновый компоненты были уже скомбинированы, прогестин включали даже во время интервалов дачи RU 486.
Если сравнивать с эквивалентами человеческой дозы, то ежедневная доза, получаемая обезьянами, имея в виду вес тела обезьяны, равный приблизительно 6 кг, а вес тела женщины приблизительно 60 кг, составляла приблизительно 12 мкг этинилэстрадиола и 0,6 мг норэтиндронацетата. Таким образом, эта рецептура перорального противозачаточного средства ультрамалой дозы представляет собой 40-%-ное снижение количества эстроген-прогестина, которому подвергается организм, в сравнении с одним из самых низкодозных комбинированных пероральных контрацептивов, коммерчески доступных в настоящее время в Америке или в Европе. Даже принимая во внимание, что при непрерывном режиме лечения ультрамалыми дозами, при котором будет на 92 лечебных дня в пересчете на год больше, чем при традиционном 21 + 7-дневном протоколе, такое лечение все же уменьшает годовую норму экзогенного эстроген-прогестинового воздействия более чем на 20%.
Статистическая оценка результатов
Различия между групповыми результатами исследования в Части I, подсчитанные как средние величины и стандартные ошибки, сравнивались с помощью F статистической проверки при доверительном уровне P < 0,05.
Хотя два из наблюдавшихся менструальных фактора (мощность внезапного кровотечения и продолжительность менструации, обусловленной отменой приема лекарств ("беспилюльная" менструация)) не показали каких-либо значительных различий (P>0,05), определенные тенденции наблюдались, а именно (1) мощности внезапного кровотечения были заметно ниже в циклах 2 и 3; и (2) продолжительность менструации, обусловленной отменой приема лекарств во время "беспилюльного" интервала, была несколько меньше в каждом месяце. В свою очередь частота аменореи, обусловленной отменой приема лекарства (третий наблюдавшийся менструальный фактор), в действительности возросла значительно (P<0,05) в цикле лечения 3 против 1-го. Уровни циркуляции эстрадиола и прогестерона косвенно отражали ингибирующее действие эстроген-прогестиновой терапии на секцию гонадотропина гипофизом. Хотя сывороточный эстрадиол возрос явно во время "беспилюльных" интервалов, соседствующих с днями приема лекарств в цикле 2, созревание фолликула скрывалось возобновлением лекарственной терапии, как показывают наивысшие уровни приблизительно 60 пг/мл без терапии и подавление до приблизительно 25 пг/мл на 21-й день. Так как уровни сывороточного прогестерона оставались на нижнем пределе обнаружения или вблизи его в течение всего исследования, эти данные твердо указывают на то, что, вероятно, овуляция надежно блокировалась во всех 32 обезьянах.
Данные, полученные в Части II исследования, приведены по лечебной группе с профилями эндометриального кровотечения через шесть циклов лечения до 180 дней. Сренее (+SEM) количество дней внезапного кровотечения или менструации подсчитывалось делением общего количества зарегистрированных случаев (на лечебный цикл в случае группы 1 или 30-дневные интервалы для групп 2 - 5) на количество наблюдаемых особей в группе. При табличном представлении данных менструацией (кровотечением вследствие отмены приема лекарств или вызванным в ожидаемые интервалы) считалась влагалищная кровь, обнаруженная во время "беспилюльного" интервала для группы 1 или в пределах семи дней после прерывистого введения RU 486 во время непрерывной пероральной контрацепции ультрамалыми дозами (группы 2 - 4). Аналогично, отсутствие влагалищного кровотечения во время этих периодов ожидаемой менструации, либо вследствие отмены пероральной контрацептивной терапии, или вскоре после дачи прогестеронового антагониста считалось аменореей вследствие отмены приема лекарства.
Для группы 1 частота внезапного кровотечения менялась мало от 1-го к 6-му лечебному циклу. Однако данные, полученные в целом в Части II в сравнении с данными Части I показали снижение в 2,4 раза (P<0,05) , прогрессивно, мощностей внезапного кровотечения. Статистическая достоверность (P≤0,05) достигалась также и в циклах лечения 3 и 6 Части II в сравнении с циклом лечения I Части I.
Для групп 2 - 4 в связи с прерывистыми единичными дозами RU 486, вводимыми с интервалами в 30, 60 или 90 дней, общая частота внезапного кровотечения была снижена на 57% (P<0,05), когда статистическое сравнение делалось для всех объединенных данных из группы 2 - 4 против группы 1. Однако группа 5 уникально прореагировала на пероральную контрацепцию ультрамалыми дозами.
Частота внезапного кровотечения возросла умеренно в 5-м и заметно в 6-м 30-дневном интервале в сравнении со всеми другими изучаемыми группами (P 0,05).
В отношении менструации, обусловленной отменой пилюль или вызванной введением RU 486, пероральное противозачаточное средство ультрамалой дозы, введенное по традиционному 21 + 7-дневному режиму, имело своим результатом меньше (P<0,05) дней менструального течения, чем в предшествовавшем лечению спонтаном менструальном цикле (1,7±0,05 дней в целом против 3,7±1,6 дней соответственно); менструация после дачи RU 486 была более длительная (3,1±0,8 дня; P<0,05), чем в прерывистом цикле с введением только пилюль. Заметных различий не было в профилях кровотечения среди групп, в которых давали RU 486 (P>0,05). Наконец, те приматы, которые прошли непрерывный курс пероральной контрацепции ультрамалыми дозами лекарства в течение 180 дней (группа 5), демонстрировали большую продолжительность менструации, обусловленной отменой лекарства, чем другие лечебные группы (4,9±3,5 дней, P<0,05). Однако наблюдавшиеся индивидуальные отличия не позволяли вывести статистическую закономерность (P>0,05) из данных, полученных в предшествовавшем лечению цикле.
Частота аменореи в Части II была заметно уменьшена, когда RU 486 добавляли с перерывами к непрерывному режиму пероральной контрацепции. И действительно, ни у одной обезьяны не наблюдалось отсутствия кровотечения после дачи RU 486, хотя у некоторых присутствие влагалищной крови было коротким, один или два дня. В противоположность этому, когда применялся один обычный 21±7-дневный режим или непрерывное введение одного противозачаточного средства ультрамалой дозы, распространенность аменореи была от 20 до 30% (P<0,05).
В течение всей Части II недельные уровни сывороточного прогестерона оставались ниже 1,0 нг/мл, за исключением одного случая, когда этот уровень был 1,4 нг/мл. Повторный анализ этого образца выявил концентрацию 0,26 нг/мл, что позволило предполагать, что начальное значение могло быть результатом неправильного анализа, а не указывало на возможную повышенную фолликулярную или лютеальную активность яичника. Одновременно общие концентрации сывороточного эстрадиола во время 180- дневного исследования были 37 ± 19, 23 ± 7, 22 ± 5, 25 ± 3 и 26 ± 6 пг/мл для группы 1 - 5 соответственно, иллюстрируя общие достоверно (P < 0,05) более низкие уровни эстрогена во время режимов пероральной контрацепции с помощью противозачаточного средства ультрамалой дозы, безотносительно к RU 486.
Эти данные согласуются с применяемым пероральным контрацептивом ультрамалой дозы, достаточным для блокирования овуляции, при использовании либо обычного режима лекарственной терапии в течение 21 дня плюс 7 "беспилюльных" дней, либо лечения без перерыва в течение 180 дней. Однако частота возникновения проблем кровотечения, как мгновенного кровотечения, так и аменореи, обусловленной отменой приема лекарства, во время "беспилюльного" интервала возрастала безотносительно к тому, был ли режим лечения традиционной 21 + 7- дневной схемой или растянутой непрерывной терапией, сравнительно с тем, когда RU 486 давали в сочетании с эстроген/прогестиновой терапией.
Добавление антипрогестина RU 486 с перерывами через 30-, 60- или 90-дневные интервалы сопровождалось двумя улучшениями в профилях кровотечения. Наблюдалось уменьшенное внезапное кровотечение в межменструальные интервалы и надежное вызывание менструации в ожидаемое время, устраняя таким образом аменорею, обусловленную отменой лекарства. Также, в целом, продолжительность вызванной менструации была несколько большей после RU 486. Когда непрерывное пероральное контрацептивное лечение применялось без RU 486, частота внезапного кровотечения заметно возрастала в 5-м и особенно в 6-м 30- дневном интервале. У аналогично леченых самок, которым давали однократно прогестероновый антагонист с интервалами в 30, 60 или 90 дней, мощность внезапного кровотечения всегда была самой низкой (на 57% ниже) в сравнении с данными, когда применяли традиционную схему лечения 21 + 7 день или непрерывную дозировку, но без анти-прогестина.
Частота внезапного кровотечения среди женщин, начинающих пользоваться пероральными противозачаточными средствами, как известно, выше в начальные циклы приема пилюль, чем в последующие. Полагают, что это наблюдение, о котором часто сообщают, возможно, отражает как биологический эффект гормональной настройки на лекарственную терапию, так и ненадежное соблюдение режима лечения женщинами, имеющими недостаточный опыт пользования пероральными контрацептивами. Результат вышеописанных экспериментов в этой модели с приматами отчасти согласуется с такими мнениями, а именно прогрессивное падение частоты внезапного кровотечения наблюдалось на протяжении первых 3 - 4 месяцев лечения пероральными противозачаточными средствами ультрамалой дозы, принимаемыми по обычной 21 + 7 - дневной схеме.
Хотя наблюдаемая абсолютная частота внезапного кровотечения была ниже, чем часто сообщаемая частота у женщин, это может иметь свою причину в вынужденном соблюдении режима обезьянами во время эксперимента и/или другими различиями, относящимися к дозе, режиму или к виду. Более того, стабилизация этих приматов на этой циклической схеме лечения в течение трех циклов в Части I перед разделением их на пять групп в Части II, возможно, улучшила наше понимание того действия, которое оказывает RU 486 на проблему регуляции кровотечения, связанного с применением перорального противозачаточного средства малой дозы. Не только RU 486 был всегда связан со значительно меньшим внезапным кровотечением, но и антипрогестин надежно вызывал некоторое кровотечение во всех случаях в пределах 72 часов, давали ли его с интервалом в 30, 60 или 90 дней.
Без прерывистого лечения с RU 486 частота аменореи в ожидаемое время кровотечения повышалась как при одном обычном режиме 21 + 7, так и при одном 180-дневном непрерывном лечении (группа 5).
Последние данные дают понять, что непрерывные режимы пероральной контрацепции требуют отторжения время от времени эндометриальной ткани для предотвращения кумулятивных неправильностей в кровотечении.
Исходя из предыдущих данных можно дать несколько возможных объяснений улучшенной регуляции кровотечений во время непрерывного режима пероральной контрацепции с ультрамалыми дозами плюс прерывистое введение RU 486. Например, уровни сывороточного эстрадиола почти не изменялись, оставаясь около 25 пг/мл, и в отсутствие секреторных выбросов эстрадиола, характеризующих "безпилюльный" интервал во время переходного "фолликулярного" просачивания, когда применяются традиционные режимы 21 + 7 дней, лечение посредством RU 486 может не действовать тремя путями: (1) наложение благодаря его антимутагенным свойствам ограничения на эндометрий, на модулирование быстрой эндометриальной пролиферации; (2) сведение на нет избыточной степени преобладания прогестина над эстрагеном (причем отношение норэтиндронацетата: этинилэстрадиол равно 50:1); и (3) продленные непрерывные режимы пероральной контрацепции, которые вызывают скопление эндометриальной ткани, и крайне высокие мощности внезапного кровотечения могут быть скомпенсированы отторжением время от времени ткани.
В целом, данные, полученные в этом исследовании приматов, согласуются с осуществимостью (1) дальнейших снижений ежедневной дозы эстроген-прогестиновых пероральных противозачаточных средств; (2) непрерывных режимов пероральной контрацепции ультрамалыми дозами противозачаточных средств, при которых интервал ежедневного приема пилюли продлевается до 30, 60 и 90 дней без перерыва; и (3) введение с перерывами разовой дозы антипрогестина в комбинации с непрерывными режимами пероральной контрацепции, чтобы снизить мощность межменструального внезапного кровотечения и добиться устранения аменореи, обусловленной отменной приема лекарства, каковые оба явления, как известно, связаны с сегодняшними режимами пероральной контрацепции с пониженными дозами.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает повышение надежности пероральной контрацепции, удовлетворение пользователя и соблюдение им режима и схемы лечения, не ставя под угрозу эффективность контрацепции. Более того, так как эффективность предупреждения беременности у женщин не приносится в жертву и, в действительности, может быть повышена с помощью непрерывного эстроген/прогестинового режима, который не требует запоминания пользователем дней конца и начала, как в случае пачки пилюль для 21-дневного цикла, и главная жалоба пациента на менструальные боли значительно уменьшена благодаря перемежающемуся включению антипрогестина, то пероральные эстроген/прогестиновые противозачаточные средства ультрамалой дозы становятся, таким образом, в высокой степени желательны для сексуально активных женщин от подросткового возраста вплоть до менопаузы включительно.
Кроме того, хотя некоторые женщины желают от их циклической пероральной контрацептивной терапии регулярных менструаций, обусловленных отменой приема лекарства, каждые четыре недели (13 раз в году), другие предпочитают менее частые менструации, предполагая, что существует надежный и эффективный продукт, созданный для того, чтобы обеспечивать менструации менее часто, например лишь четыре раза в год. Настоящее изобретение, которое использует комбинацию низкодозной эстрогенпрогестиновой пилюли в непрерывном режиме с антипрогестином, назначаемым только через растянутые интервалы, когда менструация желательна или медицински показана, предлагает именно такой продукт.
Также, менструация, обусловленная отменой применения лекарства, у некоторых женщин в пост-менопаузе, независимо от того, используют ли они последовательную или одновременную эстроген/прогестиновую терапию. Терапевтический режим в соответствии с настоящим изобретением может преодолеть неприязнь пациента к частотно-циклическому вагинальному кровотечению, не жертвуя надежностью и эффективностью, путем использования непрерывной заместительной эстрогентерапии, в сочетании с прогестином с перемежающимся использованием антипрогестина для того, чтобы сбросить скопившуюся эндометриальную ткань лишь несколько раз в году, побуждает пациентов в пост-менопаузе благодаря менее частым менструациям оставаться на заместительной гормонотерапии с ее очевидными выгодами для сердечно-сосудистой системы и сохранения костей.
В случае заместительной гормонотерапии главная жалоба пациента на внезапное кровотечение существенно уменьшается благодаря перемежающемуся включению антипрогестина из-за его антимиотической активности, которая может служить дополнением к ингибирующему действию самого прогестина на рост эндометрии, и его благотворного действия на сосудистое ложе эндометрия. Кровотечение, обусловленное отменной приема лекарства, следующее за дачей антипрогестина, не обязательно должно наступать - из-за отсутствия эндометриальной трансформации прогестина.
Пример II
Перемежающееся включение антипрогестина во время заместительной эстроген- и эстроген- плюс прогестинтерапии
Приматы
Двадцати обезьянам сайномольгус (Macaca fascicularis) с предварительно вырезанными яичниками вживляли на 281 день одну подкожную капсулу, содержавшую эстрадиол. Выделение эстрадиола из этой капсулы давало в результате концентрации сывороточного эстрадиола приблизительно 75 пг/мл. На 191-й день была вживлена подкожная прогестероновая капсула, которая оставалась на месте до 281-го дня. Выделение прогестерона из этой капсулы давало в результате концентрации сывороточного прогестерона приблизительно 4 нг/мл. Исследование проводилось на оборудовании, предназначенном для изучения животных, Медицинской Школы Восточной Вирджинии, описанном в примере I.
План исследований
Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить внезапное кровотечение до и после лечения онапристоном у обезьян с удаленным яичником, находящихся на заместительной эстроген- и эстроген- плюс прогестеронтерапии. Двадцать обезьян были распределены по следующим четырем группам: группа I получает носитель (солевой раствор) онапристона на 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 и 270-й день. Группа 2 получает 3 мг/кг онапристона внутримышечно на 30, 60, 120, 150, 180, 210, 240 и 270-й день. Группе 3 дают 10 мг/кг онапристона внутримышечно в те же дни. Группа 4 получает 30 мг/кг внутримышечно онапристона в те же дни. Влагалищные мазки брались ежедневно с первого по 281-й день. Первичный параметр для оценки в этом исследовании - появление влагалищного кровотечения.
Предварительные результаты продолжающихся исследований
Результатом прогрессивно продолжающегося лечения эстрадиолом является рост мощности внезапного кровотечения в группе, которой давали носитель (группа 1). Лечение онаприоном в группах 2 - 4 не вызывает кровотечения, но снижает частоту внезапного кровотечения. Стоит начать комбинированное лечение эстрадиолом и прогестином, как онапристон вызывает влагалищное кровотечение.
Пример набора лекарственных средств
Предлагается набор лекарственных средств, содержащий 28 обычных таблеток единичной дозы, предназначенных для перорального применения, каждая содержащая 12 мкг эстрогенэтинилэстрадиола и 0,6 кг прогестин-норэтиндронацетата.
(а) В одном варианте, таблетки расположены в обычной круглой или продолговатой овальной ("ипподром") конфигурации, с указателями, соответствующими дням недели, так чтобы пациент легко мог подтвердить соответствие с режимом ежедневного приема.
Пример таких продуктов, см. "Левиен-28" Лабораторий Берлекс. Таблетка, предназначенная для приема на 21-й день или более поздний день, содержит, в дополнение к этинилэстрадиолу и норэтиндронацетату, 500 мг антипрогестинового RU 486 ("Мифепристон", Руссель Уклаф).
(в) В другом варианте, 20 или более, например, 20, 23, 24, 30, 60, 90 или 120 таблеток, содержащих только эстроген и прогестин или эстроген, упакованы насыпью в емкости, например в бутылочки с плоскими гранями или в плоскую металлическую коробочку с защелкивающимся открытым верхом, таким, который обычно используется для хранения таблеток аспирина, или тому подобном контейнере. Отдельно пакуется, например, в доступной впадине в бутолочном колпачке или в пузырьковой упаковке, приклеенной к одной грани бутылочки или металлической коробочки, таблетка, содержащая антипрогестин один или в смеси с эстрогеном и прогестином. На упаковке для этой таблетки оставлено место, на котором врач (или пациент) должен написать день и месяц, когда для вызывания менструации эту таблетку следует принять вместо других таблеток (когда эта таблетка содержит как антипрогестин, так и эстроген и прогестин) или в дополнение к другим таблеткам (когда эта таблетка содержит только антипрогестин). Набор содержит количество таблеток, требующееся для обеспечения непрерывной эстроген/прогестиновой терапии в течение одного менструального цикла из 28, 30, 60, 90 или 120 дней.
(с) В другой разновидности вышеописанных наборов, во всем остальном соответствующей первым вариантам, количества эстрогена и прогестина изменяют, т.е. в первых 7 таблетках их количества составляют 35 мкг и 1,5 мг на таблетку соответственно; в следующих 7 таблетках - соответственно 30 мкг и 0,8 мг на таблетку; в следующих 7 таблетках - соответственно 20 мг и 0,6 мг на таблетку и в последних 7 таблетках - соответственно 5 мкг и 0,4 мг на таблетку.
(d) В разновидностях каждого из наборов, описанных выше, норэтиндронацетат в таблетках заменен на 25 мкг гестодена.
(e) В других разновидностях каждого из наборов, описанных выше, эстроген в нем заменен на 20 мкг местранола.
(f) В других разновидностях каждого из наборов, описанных выше, антипрогестин в нем заменен на 500 мг онапристона.
Предыдущие примеры могут быть повторены с аналогичным успехом путем замены реагентов и/или рабочих условий, использованных в них, на описанные родовыми и видовыми признаками реагенты и/или рабочие условия согласно настоящему изобретению.
Из вышеприведенного описания специалист в данной области легко может установить существенные характеристики настоящего изобретения и, не выходя за пределы и не отклоняясь от сущности настоящего изобретения, вносить различные изменения и модификации в него, чтобы приспособить его к различным целям и условиям применения.
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и имеет отношение к регулированию менструации и проведению пероральной контрацепции. Способ заключается в том, что эстроген или эстроген с прогестином вводят в дозах, блокирующих фолликулогенез, ежедневно без перерыва. При этом через интервалы в один месяц и более стимулируют менструацию введением антипрогестина в дозах, эффективных для отторжения скопившейся эндометриальной ткани. Предложены соответствующие фармацевтические композиции и наборы лекарственных средств. Изобретение позволяет устранять внезапное маточное кровотечение, обусловленное введением малых доз эстрогена. 12 с. и 36 з.п.ф-лы.
28. Набор по п.26 для контрацепции у женщин отличающийся тем, что содержит одну дозу антипрогестина, которая эффективна, чтобы вызвать месячные.
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| УСТРОЙСТВО АВТОМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ МУФТОЙ СЦЕПЛЕНИЯ МОТОЦИКЛА | 0 |
|
SU253607A1 |
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Gray R.Y | |||
| "Endometrial Bleeding and Steroidal Confaception"; Diezfalusy E., Frazer R.S., Webb F.T.E.(Eds), Bathe, England Pittman Press; 1990: 14 - 19. | |||
