ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO VULGARIS ЭГАСТ-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается нового штамма бактерий - продуцентов сульфида, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий.

Известно об использовании сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. В процессе биохимической очистки происходит связывание ионов тяжелых металлов биогенным сероводородом в нерастворимые сульфиды, а также восстановление некоторых металлов и осаждение в виде гидроксидов. Для повышения эффективности способов биохимической очистки с использованием СВБ необходим высокий уровень активности роста бактерий.

Для создания необходимой концентрации микроорганизмов в процессе очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов используются различные приемы или добавляют легко усвояемое органическое питание для СВБ [1] или используют специально подобранные биоценозы микроорганизмов [2].

Однако применяемые микроорганизмы не обеспечивают специальной активности роста СВБ в промышленных сточных водах, характеризующихся различной степенью загрязнения и различным составом загрязняющих компонентов. За прототип принят штамм бактерий Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1970 Д (УФ-3), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Этот штамм является высокоактивным штаммом сульфатвосстанавливающих бактерий, обеспечивающим стабильный прирост биомассы при очистке сточных вод от ионов тяжелых металлов [3].

Штамм СВБ Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1970 Д получен путем выделения из сточных вод гальванического цеха с повышенным содержанием растворенных металлов и последующей селекции стандартными методами на элективных средах. Основной состав среды приведен в примере.

Полученный штамм бактерий депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (BKM) под номером BKM B-1970 Д.

Определение культуры приведено по определителю Берги ("Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", v. 1, 909, Baltimore William, Wilkins, 1984).

Пример. Культурально-морфологическая характеристика штамма.

Характеристика вегетативных клеток - вибрионы, клетки размером 0,4-0,7; 1,5-4 мкм; грам-отрицательные; кислотоустойчивость - неустойчивые, споры не образуют. Тип размножения и расхождения клеток при делении - прямое равномерное деление, тип жгутикования - подвижные, полярное жгутикование; включения отсутствуют. Тип колоний - колонии шаровидные и дисковидные в толще агара, особенности роста на питательной среде - восстанавливают сульфаты с образованием сульфидов.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Условия культивирования - анаэробные, оптимальная температура - 30^oC (пределы 10-35^oC), оптимальная величина pH 7,2-7,4 (пределы 5,5-8,5), изменение pH при росте - отсутствует или слабое подщелачивание. Запах - сероводород.

Отношение к pH, температуре и кислороду указано в условиях культивирования, подавляется стрептомицином, ампициллином и другими антибиотиками, ингибирующими грам-отрицательную микрофлору. Клетки не содержат фагов, не лизогенные, выдерживают содержание солей до 20-30 г/л, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует.

Данный штамм использовался для очистки сточных вод гальванического производства.

Недостатком данного штамма является недостаточно высокая эффективность степени очистки сточных вод гальванических производств от ионов тяжелых металлов.

Задача изобретения - получение штамма бактерий Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1020 Д, используемого для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов и тем самым расширение ассортимента штаммов бактерий, используемых для очистки сточных вод. Сущность изобретения достигается применением штамма бактерий Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1020 Д для очистки сточных вод гальванического производства. Штамм бактерий выделен из смазочно-охлаждающей жидкости (СОЖ) металлобрабатывающего цеха.

Предлагаемый штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (BKM) под регистрационным номером - BKM B-2010 Д.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими свойствами.

1. Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма определены при его культивировании на стандартных средах, прописи которых взяты из каталога Всероссийской коллекции микроорганизмов 92 и 109 и приведены ниже по изданию "Всероссийская коллекция микроорганизмов. Каталог", Пущино-Москва, ВНИТИ, 1992, 362 стр. Культивирование проводили в анаэробных условиях при 30^oC в течение 2 суток.

Культуральные признаки: при росте штамма жидкая среда опалесцирует, на дне сосуда культивирования накапливается черный осадок сульфида железа; присутствует запах сероводорода.

Морфологические признаки: при микроскопии клетки представлены одиночными вибрионами размером 0,5-0,7 x 1,5-3 мкм; клетки подвижные, при электронной микроскопии выявлен один полярный жгутик (монотрихи); размножение делением с равномерным расхождением клеток. По строению стенки - грациликутные, что подтверждается отрицательной окраской по Граму. Не кислотоустойчивые. Спор не образуют. Внутриклеточные включения при культивировании на указанных средах отсутствуют.

Особенности роста: восстановление сульфата до сульфида (сероводорода) с отмеченным выше накоплением в стандартной среде черного сульфида железа, а также (по исчерпании железа) сероводорода.

2. Физиолого-биохимические признаки патентуемого штамма
Строгий анаэроб. Способен к сульфатному дыханию: в качестве акцептора электронов использует сульфат или серные соединения промежуточной окисленности (сульфит, тиосульфат), в качестве доноров водорода при этом использует: водород, лактат, пируват, формиат, этанол. Соответственно в качестве источников углерода способен использовать выше поименованные лактат, пируват, формиат, этанол. Кроме того, способен использовать в качестве источника углерода (ростового субстрата) производственные СОЖ. В качестве источников азота способен использовать аммоний и аминокислоты дрожжевого экстракта. Желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. В стимуляторах роста не нуждается. Диапазон pH от 6-9 с оптимумом при 7,2-7,4. При росте наблюдается слабое подщелачивание среды, коррелирующее с замещением сульфата сульфидом. Диапазон температур для роста штамма 0-41^oC с оптимумом при 3^oC. Клетки содержат цитохром C и десульфовиридин. Рост штамма подавляется стрептомицином, ампициллином и другими антибиотиками, ингибирующими Грам-отрицательную микрофлору.

3. Прописи сред из каталога Всероссийской коллекции микроорганизмов.

N 92. Среда с лактатом для DESULFOVIBRIO
Раствор 1, г:
K₂HPO₄ - 0.5
NH₄Cl - 1.0
CaCl₂•6H₂O - 0.1
MgSO₄•7H₂O - 2.0
Na₂SO₄ - 1.0
Лактат Na - 5.0
Дрожжевой экстракт - 1.0
Резазурин - 0.001
Цистеин - 0.5
Дистиллированная вода, мл - 950,0
Раствор 2.

NaHCO₃, г - 4
Дистиллированная вода, мл - 40
Раствор 3.

Na₂S•9H₂O, г - 0.3
Дистиллированная вода - 6,0
Раствор 4.

FeSO₄•7H₂O, г - 0.4
Дистиллированная вода, мл - 10.0
Приготовление: раствор 1 довести до кипения с одновременным продуванием сквозь раствор свободной от кислорода смеси газов, состоящей из 97% N₂ и 3% H₂. Стерилизовать в атмосфере этих газов. Раствор 3 стерилизовать в атмосфере N₂. После стерилизации растворы соединить. pH среды после смешения устанавливают 6,8.

N 109. Среда для DESULFOVIBRIO.

Раствор 1, г:
K₂HPO₄ - 0.5
NH₄Cl - 1.0
Na₂SO₄ - 1.0
CaCl₂•6H₂O - 0.1
MgSO₄•7H₂O - 2.0
Лактат Na - 2.0
Дрожжевой экстракт - 1.0
Резазурин - 1.0
Дистиллированная вода, мл - 980.0
Раствор 2.

FeSO₄•7H₂O, г - 0.5
Дистиллированная вода, мл - 10.0
Раствор 3.

Тиогликолат Na, г - 0.1
Аскорбиновая кислота, г - 0.1
Дистиллированная вода, мл - 10.0
Раствор 4 (раствор микроэлементов SL-10), мг:
HCl(25%, 7.7 М), мл - 10.0
FeCl₂•4H₂O, г - 1.5
ZnCl₂ - 70.0
MnCl₂•4H₂O - 100.0
H₃BO₃ - 6.0
CoCl₂•6H₂O - 190.0
CuCl₂•2H₂O - 2.0
NiCl₂•6H₂O - 24.0
Na₂MoO₄•2H₂O - 36.0
Дистиллированная вода, мл - 990.0
Приготовление: все растворы стерилизуют порознь автоклавированием при 121^oC в течение 15 мин в атмосфере азота. Раствор 1 непосредственно перед автоклавированием кипятят, продувая азотом. Для приготовления среды смешивают растворы 1, 2 и 3, а из раствора 4 добавляют 1 мл, pH среды после смешения устанавливают 7,2-7,4.

Пример 1. Получение штамма Desulfovibrio Vulgaris BKM B-2010 Д
Депонируемый штамм был получен путем отбора проб производственных стоков и выделением из них накопительной культуры бактерий путем выращивания в анаэробных условиях при 30^oC на средах, прописи которых приведены в тексте, с тем изменением сред, что в качестве единственного источника углерода для роста используют производственную СОЖ. Затем селекцию штамма продолжают при возрастающих концентрациях тяжелых металлов в среде культивирования. Итоговое выделение чистой культуры патентуемого штамма производят методом серийных разведений с последующим высевом в агаризованный вариант питательной среды и пересевом единичных колоний.

Пример использования штамма бактерий Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1020 Д для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.

Процесс осуществляют в биотенке с загрузкой из пемзы с восходящим потоком жидкости. Посевным материалом служат выращенные в жидкой среде в колбах штаммы микроорганизмов. Засевают биотенки штаммами микроорганизмов Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1020 Д, которые закрепляются на пемзе. Температуру культивирования в биотенке поддерживают 28-30^oC. Через биотенк пропускают сточную воду гальванического производства. В результате жизнедеятельности СВБ выделяется сероводород, который соединяется с ионами тяжелых металлов, образуя сульфиды металлов, которые выпадают в осадок.

Эффективность работы биотенка приведена в таблице.

Из таблицы видно, что эффективность очистки сточных вод гальванического производства при использовании предлагаемого штамма составляет 99,9%.

Таким образом, сточные воды гальванических производств могут быть эффективно очищены от ионов тяжелых металлов с помощью штамма - Desulfovibrio Vulgaris BKM B-1020 Д (ЭГАСТ-1).

ЛИТЕРАТУРА
1. Авторское свидетельство СССР 857013, кл. C 02 F 3/28, 1979 г.

2. Авторское свидетельство СССР 941319, кл. C 02 F 3/34, 1980 г.

3. Патент РФ N 2055817, кл. C 02 F 3/34, 1996 г.

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается биотехнологии очистки промышленных сточных вод. Новый штамм бактерий Desulfovibrio Vulgaris ЭГАСТ-1 предлагается для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Штамм является высокоустойчивым при росте в средах, загрязненных ионами металлов, обеспечивает стабильный прирост биомассы. Технический результат изобретения - эффективная очистка сточных вод за счет связывания и удаления ионов тяжелых металлов. 1 табл.

Штамм бактерий Desulfovibrio Vulgaris ВКМВ-2010 D, используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.