АЦИДОФИЛЬНЫЙ ШТАММ DESULFOSPOROSINUS SP. ДЛЯ ОЧИСТКИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ С ЭКСТРЕМАЛЬНО КИСЛЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к биотехнологии и к биологическим способам обработки загрязненных промышленных сточных вод с экстремально кислыми значениями рН (<3) и представляет собой новый штамм ацидофильной сульфатредуцирующией бактерии (СРБ) Desulfosporosinus sp. OL ВКМ В-3021 D. Штамм может быть использован в биотехнологических схемах очистки экстремально кислых сточных вод предприятий горной, машиностроительной, приборостроительной промышленности, гальванических производств, а также для очистки шахтных, карьерных, дренажных вод, имеющих экстремально кислые значения рН от сульфатов и ионов тяжелых металлов.

Известен штамм бактерий Streptomyces chromogenes s.g. 0832, используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов (RU 2312073). Предложенный способ очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов позволяет наиболее полно удалить из сточных вод предприятий пищевой промышленности ионы тяжелых металлов, обеспечив высокую степень извлечения за короткий промежуток времени. Недостатком предложенного способа является невозможность его осуществления в экстремально кислой среде.

Наиболее перспективными для очистки загрязненных экосистем являются сульфатредуцирующие бактерии. Биотехнологии очистки загрязненных экосистем основываются на способности сульфатредуцирующих бактерий продуцировать в процессе своей жизнедеятельности сероводород, который связывает ионы тяжелых металлов в нерастворимые сульфиды.

Известен штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д (RU 2355756), способный к очистке сточных вод от ионов тяжелых металлов при повышенных концентрациях сульфатов. Недостатком данного штамма является его способность к работе при суммарной концентрации тяжелых металлов до 190 мг/л, тогда как известно, что в сточных водах промышленных предприятий суммарная концентрация ионов тяжелых металлов чаще всего более 200 мг/л.

Известен штамм бактерий Desulfovibrio sp. СВБ-2 (RU 2269571). Штамм предназначен для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов при суммарной концентрации тяжелых металлов в используемых очистных водах 197,9 мг/л, а меди - 8,9 мг/л. К недостаткам штамма СВБ-2 относится недостаточно высокая устойчивость к ионам тяжелых металлов, в частности ионам меди, и его неспособность к росту в экстремально кислых значениях рН - штамм растет при рН 6,5…8,5.

Известен штамм бактерии Desulfovibrio sp. для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов (RU 2542402). Штамм бактерий Desulfovibrio sp. А 4/1 выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к повышенным концентрациям ионов меди (до 600 мг/л), ионов никеля (до 250 мг/л), ионов кобальта (до 400 мг/л), ионов кадмия (до 75 мг/л). Недостатком штамма Desulfovibrio sp. является его неспособность к росту при экстремально кислых значениях рН, оптимальный рН среды для штамма А 4/1 равен 7,2.

Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является штамм бактерий Desulfotomaculum halophilum RETECH-SRB-II (CN 101434919), депонированный в китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) (университет Ухани) с номером депозита М207061, для очистки кислых шахтных дренажных вод. Штамм способен осаждать сульфиды тяжелых металлов в различных концентрациях (Cu²⁺ - 0,04-0,6 г/л; Zn²⁺ - 0,5-1,0 г/л; As³⁺ - 0,07-0,6 г/л; Fe²⁺ - 1,0-2,0 г/л; Fe³⁺ - 0,5 г/л) при кислых значениях рН (2,0-4,5). Недостатком штамма является необходимость его использования совместно со сброженной рисовой соломой (время брожения 10-30 дней), что удлиняет продолжительность биотехнологического процесса.

Задача изобретения - получение устойчивого к металлам, высокоактивного ацидотолерантного штамма сульфатредуцирующих бактерий, используемого для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.

Технический результат - выделение ацидофильного штамма бактерий Desulfosporosinus sp. OL ВКМ ВКМ В-3021 D, устойчивого к низким значениям рН и высоким концентрациям металлов и предназначенного для очистки загрязненных экосистем с экстремально кислыми значениями рН и его депонирование во Всероссийской коллекцией микроорганизмов.

Штамм Desulfovibrio sp. OL депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-3021 D.

Предлагаемый штамм Desulfosporosinus sp. OL не известен в науке и технике, поэтому свойства, которые он проявляет, являются новыми, а следовательно, заявленное решение обладает изобретательским уровнем.

Происхождение штамм был выделен из обрастания со дна ветланда, хвостохранилище «Комсомольский», сайт КУ-2, Кемеровская обл. Россия.

Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма OL показал, что предлагаемый штамм является новым штаммом и принадлежит к роду Desulfosporosinus.

Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма были определены определяют при его культивировании на стандартной пресноводной среде Видделя [Widdel F. and. Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. N.y.: Springer. 1992].

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Температура культивирования штамма составляет +28°С.

Родовое и видовое название штамма - штамм бактерий Desulfosporosinus sp. OL.

Морфологическая характеристика - форма клеток - палочки.

Спорообразование - спорообразующие.

Реакция по Граму - положительная.

Подвижность клеток - подвижные.

Физиологическая характеристика - отношение к кислороду - анаэроб.

В качестве субстрата для роста используют используют спирты (этанол, глицерол), сахара (фруктоза, глюкоза, сахароза) и органические кислоты (лактат, пропионат, ацетат), а также пептон и триптон.

Устойчивость к тяжелым металлам. Штамм устойчив к ионам меди (до 450 мг/л), кобальта (до 200 мг/л), никеля (до 700 мг/л), кадмия (до 20 мг/л). При культивировании штамма с ионами Fe²⁺ образуют черный осадок сульфидов железа.

Оптимальный рН среды 4,0.

Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется, - устойчивость к повышенным концентрациям ионов тяжелых металлов, ацидотолератные свойства.

Условия культивирования - пресноводная среда Видделя.

Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или лиофилизированным.

Способность штамма к снижению содержания основных загрязняющих ионов тяжелых металлов, присутствующих в сточной воде, изучали в лабораторных опытах. Результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Исследование способности штамма бактерий Desulfosporosinus sp. OL к осаждению ионов меди.

Чистую культуру СРБ Desulfosporosinus sp. OL культивировали на синтетической среде, содержащей ионы меди в концентрации 450 мг/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном боксе. Для удаления растворенного кислорода в среде перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор H₂SO₄ (при внесении рН доводится до 3,0), H₂S (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор меди (CuSO₄·5H₂O (10 г на 50 мл дистиллированной воды)) в количестве 4,5 мл на 1 литр синтетической среды.

Во флаконы на 10 мл вносили около 5 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 1 мл инокулята. Анаэробные условия создавали, доливая флаконы средой доверху. Для исключения проникновения кислорода воздуха во флакон к краям флаконов притирали с помощью стерильной иглы резиновые пробки. Флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28°С.

На среде с ионами меди в концентрации 450 мг/л за 10-15 суток медь осаждается в виде сульфида.

Пример 2. Исследование способности штамма бактерий Desulfosporosinus sp. OL к осаждению ионов никеля.

Чистую культуру СРБ Desulfosporosinus sp. OL культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный никель в концентрации 700 мг/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном боксе. Для удаления растворенного кислорода в среде перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор H₂SO₄ (при внесении рН доводится до 3,0), H₂S (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор никеля (NiCl₂ (2,2 г на 100 мл дистиллированной воды)) в количестве 70 мл на 1 литр синтетической среды.

Во флаконы на 10 мл вносили около 5 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 1 мл инокулята. Анаэробные условия создавали, доливая флаконы средой доверху. Для исключения проникновения кислорода воздуха во флакон к краям флаконов притирали с помощью стерильной иглы резиновые пробки. Флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28°С.

Сульфид никеля осаждается в виде осадка на стенках и дне флакона.

Пример 3. Исследование способности штамма бактерий Desulfosporosinus sp. OL к осаждению ионов кобальта.

Чистую культуру СРБ Desulfosporosinus sp. OL культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кобальт в концентрации 200 мг/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном боксе. Для удаления растворенного кислорода в среде перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор H2SO4 (при внесении рН доводится до 3,0), H2S (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор никеля (СоCl₂×6Н₂О (2 г на 50 мл дистиллированной воды)) в количестве 20 мл на 1 литр синтетической среды.

Во флаконы на 10 мл вносили около 5 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 1 мл инокулята. Анаэробные условия создавали, доливая флаконы средой доверху. Для исключения проникновения кислорода воздуха во флакон к краям флаконов притирали с помощью стерильной иглы резиновые пробки. Флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28°С.

Начало образования сульфида кобальта происходит в течение 10-12 суток.

Пример 4. Исследование способности штамма бактерий Desulfosporosinus sp. OL к осаждению ионов кадмия.

Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. А 4/1 ВКМ B-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кадмий в концентрации 20 мг/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном боксе. Для удаления растворенного кислорода в среде перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор H₂SO₄ (при внесении рН доводится до 3,0), H₂S (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор никеля (CdCl₂×2.5H₂O (1 г на 50 мл дистиллированной воды)) в количестве 2 мл на 1 литр синтетической среды.

Во флаконы на 10 мл вносили около 5 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 1 мл инокулята. Анаэробные условия создавали, доливая флаконы средой доверху. Для исключения проникновения кислорода воздуха во флакон к краям флаконов притирали с помощью стерильной иглы резиновые пробки. Флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28°С.

Сульфид кадмия осаждается на стенках и дне флакона.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки промышленных сточных вод предприятий горной, машиностроительной, приборостроительной промышленности, гальванических производств, а также для очистки шахтных, карьерных, дренажных вод от ионов тяжелых металлов. Штамм бактерий Desulfosporosinus sp., обладающий устойчивостью к высоким концентрациям ионов тяжелых металлов, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-3021 D. Изобретение позволяет повысить степень очистки сточных вод, имеющих экстремально кислые значения рН(<3). 2 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Desulfosporosinus sp., депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-3021 D, предназначенный для очистки загрязненных экосистем с экстремально кислыми значениями рН от ионов тяжелых металлов.