ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO SP. ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2015 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 C12R1/01 

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к повышенным концентрациям ионов меди (до 600 мг/л) и других двухвалентных катионов металлов.

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.

Известно об использовании сульфатредуцирующих бактерий для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Биогенный сероводород в процессе биохимической очистки связывает ионы тяжелых металлов в нерастворимые сульфиды.

Известен штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus BKM В-2465 Д (RU 2355756), характеризующийся высокой степенью очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов при повышенных концентрациях сульфатов. Данный штамм обладает способностью очищать сточные воды от хрома (YI). Недостатком данного штамма является его способность к работе при суммарной концентрации тяжелых металлов до 190 мг/л.

Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является штамм бактерий Desulfovibrio sp. СВБ-2 (RU 2269571), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Предлагаемый штамм выделен из промышленного стока гальванических производств, содержащих ионы тяжелых металлов. Однако указанная в патенте суммарная концентрация тяжелых металлов в используемых очистных водах составляет 197,9 мг/л, а меди - 8,9 мг/л. В сточных водах металлургических предприятий концентрация ионов меди может достигать 300 мг/л.

Недостатком штамма СВБ-2 является недостаточно высокая устойчивость к ионам тяжелых металлов, в частности ионам меди, что существенно ограничивает его использование в биотехнологиях.

Задача изобретения - получение устойчивого к металлам, высокоактивного штамма сульфатредуцирующих бактерий, используемого для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.

Технический результат - получение штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D, способного очищать сточные воды от ионов тяжелых металлов.

Штамм Desulfovibrio sp. A 4/1 депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-2820D. Предлагаемый штамм Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D не известен в науке и технике, поэтому свойства, которые он проявляет, являются новыми. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма ВКМ В-2820D показал, что предлагаемый штамм является новым штаммом и принадлежит к роду Desulfovibrio.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма определяют при его культивировании на стандартной пресноводной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992). Температура культивирования штамма составляла +28 ºС. Выращивание проводят в течение 3-4 суток без ионов меди, 7-8 суток с добавлением ионов меди в концентрации 200 мг/л и более.

Родовое и видовое название штамма - штамм бактерий Desulfovibrio sp.

Происхождение - выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Морфологическая характеристика - форма клеток - вибрион, размером 0,5-1,0×3,0×5,0 мкм.

Спорообразование - нет.

Реакция по Граму - отрицательная.

Подвижность клеток - подвижные.

Физиологическая характеристика - отношение к кислороду - анаэроб.

В качестве субстрата для роста используют лактат, этанол, глицерин, малат, цитрат, оксалацетат, фумарат, формиат, сукцинат, простые сахара. Лактат метаболизирует по пути неполного окисления с образованием ацетата. Наибольшую скорость роста и наименьшее время удвоения демонстрирует на среде с лактатом. Наибольшая продукция белка и сероводорода зафиксирована на среде с этанолом. Штамм устойчив к ионам меди (до 600 мг/л), кобальта (до 450 мг/л), никеля (до 225 мг/л), кадмия (до 225 мг/л), хрома (до 25 мг/л). При культивировании штамма с ионами Fe²⁺образуют черный осадок сульфидов железа. Оптимальный рН среды 7,2.

Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется, - осаждение ионов тяжелых металлов в концентрации, превышающей 200 мг/л, сероводородом.

Условия культивирования - пресноводная среда Видделя.

Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или лиофилизированным.

Пример 1. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов меди.

Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей ионы меди в концентрации 350 мг/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), NaHCO₃ (при внесении рН доводится до 7,2-7,4), H₂S (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор меди в количестве 4 мл на 1 литр синтетической среды.

Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.

На среде с ионами меди в концентрации 350 мг/л за 15 суток в среде медь осаждается в виде сульфида. Концентрация ионов меди в жидкой фазе остается 0,26 мг/л.

Пример 2. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов никеля.

Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный никель в концентрации 250 мгNi/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO₃ (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор никеля добавляли в количестве 25 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация никеля в среде 250 мг/л).

Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.

Начало образования кристаллического сульфида никеля происходит в течение 7 суток, а стабильная кристаллическая фаза сульфида образуется в течении 20 суток.

Пример 3. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов кобальта.

Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кобальт в концентрации 400 мгСо(II)/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO₃ (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор кобальта добавляли в количестве 40 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кобальта в среде 400 мг/л).

Во флаконы вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.

Начало образования кристаллического сульфида кобальта происходит в течение 12 суток, а стабильная кристаллическая фаза сульфида образуется в течении 25 суток.

Пример 4. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов кадмия.

Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кадмий в концентрации 75 мгCd(II)/л.

Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO₃ (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор кадмия добавляли в количестве 7,5 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кадмия в среде 75 мг/л).

Во флаконы объемом 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.

Кристаллизация сульфида кадмия начинается после 10 суток культивирования, при культивировании 18 суток сульфид кадмия кристаллизуется полностью.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов. Штамм бактерий Desulfovibrio sp. A 4/1 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) под регистрационным номером ВКМ В-2820D и обладает устойчивостью к ионам тяжелых металлов. Изобретение позволяет повысить степень очистки сточных вод. 2 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов, депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-2820D.