ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO SP. "ЭГАСТ-4", ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 1999 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма бактерий - продуцентов сульфида, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий.

Известно об использовании сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. В процессе биохимической очистки происходит связывание ионов тяжелых металлов биогенным сероводородом в нерастворимые сульфиды, а также восстановление некоторых металлов и осаждение в виде гидроксидов. Для повышения эффективности способов биохимической очистки с использованием СВБ необходим высокий уровень активности роста бактерий.

Для создания необходимой концентрации микроорганизмов в процессе очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов используются различные приемы или добавляют легко усвояемое органическое питание для СВБ [1] или используют специально подобранные биоценозы микроорганизмов [2].

Однако применяемые микроорганизмы не обеспечивают специальной активности роста СВБ в промышленных сточных водах, характеризующихся различной степенью загрязнения и различным составом загрязняющих компонентов.

За прототип принят штамм бактерий Desulfovibrio Vulgaris ВКМ В-1970 Д (УФ-3), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Этот штамм является высокоактивным штаммом сульфатвосстанавливающих бактерий, обеспечивающим стабильный прирост биомассы при очистке сточных вод от ионов тяжелых металлов /3/.

Штамм СВБ Desulfovibrio Vulgaris ВКМ В-1970 Д получен путем выделения из сточных вод гальванического цеха с повышенным содержанием растворенных металлов и последующей селекции стандартными методами на элективных средах. Основной состав среды приведен в примере.

Полученный штамм бактерий депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ В-1970 Д.

Определение культуры приведено по определителю Берги ("Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", v. 1, 909, Baltimore William, Wilkins, 1984).

Пример. Культурально-морфологическая характеристика штамма.

Характеристика вегетативных клеток - вибрионы, клетки размером 0,4 - 0,7; 1,5 - 4 мкм; грам-отрицательные; кислотоустойчивость - неустойчивые, споры не образуют. Тип размножения и расхождения клеток при делении - прямое равномерное деление, тип жгутикования - подвижные, полярное жгутикование; включения отсутствуют. Тип колоний - колонии шаровидные и дисковидные в толще агара, особенности роста на питательной среде - восстанавливают сульфаты с образованием сульфидов.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Условия культивирования - анаэробные, оптимальная температура - 30^oC (пределы 10...35^oC), оптимальная величина pH 7,2...7,4 (пределы 5,5...8,5), изменение pH при росте - отсутствует или слабое подщелачивание. Запах - сероводород.

Отношение к pH, температуре и кислороду указано в условиях культивирования, подавляется стрептомицином, ампициллином и другими антибиотиками, ингибирующими Грам-отрицательную микрофлору. Клетки не содержат фагов, не лизогенные, выдерживают содержание солей до 20...30 г/л, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует.

Данный штамм использовался для очистки сточных вод гальванического производства.

Недостатком данного штамма является недостаточно высокая эффективность степени очистки сточных вод гальванических производств от ионов тяжелых металлов.

Задача изобретения - получение штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4, используемого для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов, и тем самым расширение ассортимента штаммов бактерий, используемых для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.

Сущность изобретения достигается применением штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4 дня очистки сточных вод гальванического производства.

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4 выделен из сульфатного стока производства синтетических жирных кислот.

Предлагаемый штамм бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) института биологии и физиологии микроорганизмов РАН под номером ВКМ В-2023 Д. Предлагаемый штамм является активным продуцентом сероводорода для осаждения ионов тяжелых металлов из растворов и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами.

1. Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма определяют при его культивировании на стандартных средах, прописи которых взяты из каталога Всероссийской коллекции микроорганизмов N 92 и 109 и приведены ниже по изданию "Всероссийская коллекция микроорганизмов. Каталог". Пущино - Москва, ВНИТИ, 1992 г, 362 с. Культивирование проводят в анаэробных условиях при 30^oC в течение двух суток.

2. Культуральные признаки: при росте штамма жидкая среда опалесцирует, на дне сосуда культивирования накапливается черный осадок сульфида железа, присутствует запах сероводорода.

3. Морфологические признаки и цитология клеток: при микроскопии клетки представлены одиночными вибрионами размером 0,7...0,9 х 1,5...2,0 мкм; клетки подвижные, имеют один полярный жгутик. Окраска по Граму отрицательная. Спор не образуют.

Особенности роста: восстановление сульфата до сульфида (сероводорода) с отмеченным выше накоплением в стандартной среде черного сульфида железа, а также (по исчерпании железа) сероводорода.

4. Физико-биохимическая характеристика патентуемого штамма.

Строгий анаэроб. Способен к сульфатному дыханию: в качестве акцептора электронов использует сульфат или серные соединения промежуточной окисленности (сульфит, тиосульфат). В качестве доноров водорода и источников углерода используют: лактат, пируват, формиат, этанол. В качестве источников азота способен использовать аммоний и аминокислоты дрожжевого экстракта. Желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. В стимуляторах роста не нуждается. Диапазон pH от 6,0 до 9,0 с оптимумом при 7,2...7,4, используемая среда 63DSM. При росте наблюдается слабое подщелачивание среды, коррелирующее с замещением сульфата сульфидом. Диапазон температур для роста штамма от 0 до 41^oC, оптимумом при 3^oC.

Клетки содержат цитохром C. Рост штамма подавляется стрептомицином, ампициллином и другими антибиотиками, ингибирующими Грам-отрицательную микрофлору. Условия хранения: сохраняется путем пересевов на среде культивирования. Может храниться в холодильнике при 4... 10^oC в течение 3...6 месяцев. Прописи сред из каталога ВКМ:
N 92. Среда с лактатом Desulfovibrio
Раствор 1:
K₂HPO₄ - 0,5 г
NH₄Cl - 1,0 г
CaCl₂•6H₂O - 0,1 г
MgS0₄•7H₂O - 2,0 г
Na₂SO₄ - 1,0 г
Лактат Na - 5,0 г
Дрожжевой экстракт - 0,1 г
Резазурин - 0,001 г
Цистеин - 0,5 г
Дистиллированная вода - 950,0 мл
Раствор 2:
NaHCO₃ - 4,0 г
Дистиллированная вода - 40,0 мл
Раствор 3:
Na₂S•9H₂O - 0,3 г
Дистиллированная вода - 6,0 мл
Раствор 4:
FeSO₄•7H₂O - 0,4 г
Дистиллированная вода - 10,0 мл
Приготовление: раствор 1 довести до кипения с одновременным продуванием сквозь раствор свободной от кислорода смеси газов, состоящей из 97% N₂ и 3% H₂. Стерилизовать в атмосфере этих газов. Раствор 3 стерилизовать в атмосфере N₂. После стерилизации растворы соединить. pH среды после смешения устанавливают 6,8.

N 109. Среда для Desulfovibrio
Раствор 1:
K₂HPO₄ - 0,5 г
NH₄Cl - 1,0 г
Na₂SO₄ - 1,0 г
CaCl₂•6H₂O - 0,1 г
MgSO₄•7H₂O - 2,0 г
Лактат Na - 2,0 г
Дрожжевой экстракт - 1,0 г
Резазурин - 1,0 г
Дистиллированная вода - 980,0 мл
Раствор 2:
FeSO₄•7H₂O - 0,5 г
Дистиллированная вода - 10,0 мл
Раствор 3:
Тиогликолат Na - 0,1 г
Аскорбиновая кислота - 0,1 г
Дистиллированная вода - 10,0 мл
Раствор 4 (раствор микроэлементов SL-10):
HCl (25%; 7,7 М) - 10,0 мл
FeCl₂•4H₂O - 1,5 г
ZnCl₂ - 70,0 мг
MnCl₂•4H₂O - 100,0 мг
H₃BO₃ - 6,0 мг
CoCl₂•6H₂O - 190,0 мг
CuCl₂•2H₂O - 2,0 мг
NiCl₂•6H₂O - 24,0 мг
Na₂MoO₄•2H₂O - 36,0 мг
Дистиллированная вода - 990,0 мл
Приготовление: все растворы стерилизуют порознь автоклавированием при 121^oC в течение 15 мин в атмосфере азота. Раствор 1 непосредственно перед автоклавированием кипятят, продувая азотом. Для приготовления среды смешивают растворы 1, 2 и 3, а из раствора 4 добавляют 1 мл. pH среды после смешения устанавливают 7,2...7,4.

Пример получения штамма Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4 Депонируемый штамм получают путем отбора производственных стоков и выделением из них накопительной культуры бактерий путем выращивания в анаэробных условиях при 30^oC.

В качестве единственного источника углерода для роста используют промышленные стоки, содержащие глицерин. Затем селекцию штамма продолжают при возрастающих концентрациях тяжелых металлов в среде культивирования. Итоговое выделение чистой культуры получаемого штамма производят методом серийных разведений с последующим высевом в агаризованный вариант питательной среды и пересевом единичных колоний.

Пример использования штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4 для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.

Процесс осуществляют в биотенке с загрузкой из пемзы с восходящим потоком жидкости. Посевным материалом служат выращенные в жидкой среде в колбах штаммы микроорганизмов. Засевают биотенки штаммами микроорганизмов Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4, которые закрепляются на пемзе. Температуру культивирования в биотенке поддерживают в диапазоне 28...30^oC. Через биотенк пропускают сточную воду гальванического производства. В результате жизнедеятельности СВБ выделяется сероводород, который соединяется с ионами тяжелых металлов, образуя сульфиды металлов, которые выпадают в осадок.

Эффективность работы биотенка приведена в таблице.

Из таблицы видно, что эффективность очистки сточных вод гальванического производства при использовании предлагаемого штамма составляет 99,9%.

Таким образом, сточные воды гальванических производств могут быть эффективно очищены от ионов тяжелых металлов с помощью штамма - Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д штамм ЭГАСТ-4.

Литература
1. Авторское свидетельство N 857013, кл. C 02 F 3/28, 1979 г.

2. Авторское свидетельство N 941319, кл. C 02 F 3/34, 1980 г.

3. Патент РФ N 2055817, кл. C 02 F 3/34, C 12 N 1/20, 1996 г.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Предложен новый штамм бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д ЭГАСТ-4 - активный продуцент сероводорода для осаждения ионов тяжелых металлов из растворов. Штамм выделен из сульфатного стока производства синтетических жирных кислот. Использование предлагаемого штамма бактерий позволит повысить эффективность очистки сточных вод гальванического производства от ионов тяжелых металлов до 99,9%. 1 табл.

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2023 Д, используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.