ШТАММ БАКТЕРИЙ Desulfovibrio oxamicus, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ СУЛЬФАТОВ И ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма бактерий - продуцентов сульфида, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций сульфатом (свыше 3,0 г/л) и от ионов железа, меди, хрома.

Широко распространено использование сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. СВБ растут за счет восстановления сульфатов, этот процесс приводит к образованию сероводорода. Биогенный сероводород взаимодействует с ионами тяжелых металлов, в результате чего образуются нерастворимые сульфиды или происходит восстановление некоторых растворимых токсичных металлов с их переходом в менее токсичные и менее растворимые формы. На этом принципе основано применение СВБ для биохимической очистки сточных вод (Патент RU 2135422, C02F 3/34, 1999.08.27).

Для повышения эффективности способов биохимической очистки с использованием СВБ необходим высокий уровень активности роста бактерий. С целью создания нужной концентрации СВБ в процессе очистки сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов применяют разные подходы: добавляют легко усвояемое органическое питание для СВБ (Авт. Св. № 857013, кл. C02F 3/28, 1979 г.) или используют специально подобранные консорциумы микроорганизмов (Vainshtein M., Р. Kuschk, J. Mattusch, A. Vatsourina, A. Wiessner. 2003. "Model experiments on the microbial removal of chromium from contaminated groundwater." Water Research. V.37 (6), pp.1401-1405).

Однако применяемые микроорганизмы не обеспечивают специальной активности роста СВБ в промышленных сточных водах, характеризующихся повышенной концентрацией сульфатов и различным составом загрязняющих компонентов.

Одним из наиболее близкородственных штаммов к предлагаемому объекту является штамм бактерий Desulfovibrio vulgaris ВКМ В-1970 Д (УФ-3), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Этот штамм является высокоактивным штаммом сульфатвосстанавливающих бактерий, обеспечивающим стабильный прирост биомассы при очистке сточных вод от ионов тяжелых металлов (Патент РФ № 2055817, кл. C02F 3/34, C12N 1/20, 1996 г.).

Однако штамм ВКМ В-1970 Д не применялся для очистки сточных вод при повышенных концентрациях сульфатов.

Ранее описаны штаммы бактерий UFZ В 378, UFZ В 406 и UFZ В 407, восстанавливающие сульфаты в сернокислых и металлосодержащих водах (Патент RU 2174554, C12N 1/20, 1995.07.28).

В описании не указаны таксономические положения этих штаммов бактерий. Штаммы применяют для оздоровления кислых (рН 1-2) шахтных вод и вод, заполняющих закрытые шахты, штаммы являются анаэробными метилотрофными восстановителями сульфатов. Способ бактериальной деконтаминации сернокислых и металлосодержащих вод при помощи штаммов UFZ В 378, UFZ В 406 и UFZ В 407 отличается тем, что добавляют только метанол в качестве единственного источника углерода и энергии.

Однако метанол является токсичным соединением, и его применение должно быть ограничено.

Задача изобретения - получение штамма бактерий для очистки сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого изобретения, заключается в том, что он обеспечивает очистку сточных вод от сульфатов при их повышенных концентрациях и возможность сопряженного удаления тяжелых металлов. Кроме того, расширяется ассортимент штаммов бактерий, используемых для очистки сточных вод.

Сущность изобретения достигается применением штамма бактерий Uf2v для очистки сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов.

Штамм бактерий Uf2v выделен из донных отложений реки ниже выпусков промышленных сточных вод горно-обогатительного и бумажного предприятий.

Предлагаемый штамм бактерий Uf2v, идентифицированный как Desulfovibrio oxamicus, депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биологии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под номером ВКМ В-2465 Д.

Предлагаемый штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д является активным продуцентом сероводорода для осаждения ионов тяжелых металлов из растворов и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами:

1. Культурально-морфологические признаки предлагаемого штамма определяют при его культивировании на модифицированной среде N 92М. Базовая среда N 92 взята из каталога Всероссийской коллекции микроорганизмов "Всероссийская коллекция микроорганизмов. Каталог". Пущино - Москва, ВНИТИ, 1992, 362 с. Пропись модифицированной среды N 92М приведена ниже. Культивирование проводят в анаэробных условиях при 30°С в течение двух суток.

2. Культуральные признаки: при росте штамма жидкая среда опалесцирует, на дне сосуда культивирования накапливается черный осадок сульфида железа, присутствует запах сероводорода.

3. Морфологические признаки и цитология клеток: при микроскопии клетки представлены одиночными вибрионами размером 0,5 мкм × 2-3 мкм; клетки подвижные, имеют один полярный жгутик. Клеточная стенка относится к грамотрицательному типу (по данным электронной микроскопии). Спор не образуют.

Особенности роста: восстановление сульфата до сульфида (сероводорода) с отмеченным выше накоплением в стандартной среде черного сульфида железа, а также (по исчерпании железа) сероводорода.

4. Физико-биохимическая характеристика предлагаемого штамма. Строгий анаэроб. Способен к сульфатному дыханию: в качестве акцептора электронов использует сульфат, тиосульфат. В качестве доноров водорода и источников углерода используют: лактат натрия, ацетат натрия вместе с дрожжевым экстрактом, пируват, малат. В качестве источников азота способен использовать аммоний и аминокислоты дрожжевого экстракта. В стимуляторах роста не нуждается. Диапазон рН от 6,5 до 8,0 с оптимумом при 7,2-7,4, используемая среда 63DSM. При росте наблюдается слабое подщелачивание среды, коррелирующее с замещением сульфата сульфидом. Диапазон температур для роста штамма от 25 до 35°С, оптимумом при 30°С. Клетки содержат цитохром С. Условия хранения: сохраняется путем пересевов на среде культивирования. Может храниться в холодильнике при 4-10°С в течение 3-6 месяцев.

5. Сравнительный анализ просеквенированного фрагмента гена 16S рРНК показал, что предлагаемый штамм принадлежит к виду Desulfovibrio oxamicus с 98% сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК.

На основании полученных данных в соответствии с определителем бактерий Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1: Пер. с англ. / Ред. Дж. Хоула и др. - М.: Мир, 1997) и по результатам сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с данными базы NCBI (GenBank - http://www.ncbi.nlm.nih.gov) предлагаемый штамм был идентифицирован как Desulfovibrio oxamicus.

Ранее не было известно использование штаммов бактерий вида Desulfovibrio oxamicus для очистки сточных вод.

Предлагаемый штамм осуществляет снижение концентрации сульфатов на 80% и тяжелых металлов, в частности хрома (VI), на 99%.

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение штамма Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д

Предлагаемый штамм получают путем отбора донных отложений и выделением из них накопительной культуры бактерий путем выращивания в анаэробных условиях при 30°С.

В качестве единственного источника углерода для роста используют молочную кислоту (лактат). Затем селекцию штамма продолжают при возрастающих концентрациях сульфатов в среде культивирования. Итоговое выделение чистой культуры получаемого штамма производят методом серийных разведений с последующим высевом в агаризованный вариант питательной среды и пересевом единичных колоний.

Работы по выделению и культивированию предлагаемого штамма проводят на модифицированной среде N 92М.

Пропись среды N 92М:

Раствор 1:

K₂HPO₄ - 0,2 г

NH₄Cl - 0,3 г

NaCl - 1,0

CaCl₂×2H₂O - 0,16

KCl - 0,5

MgSO₄×7H₂O - 0,4 г

Na₂SO₄ - 3,0 г

Дрожжевой экстракт - 0,1 г

Дистиллированная вода - 973,0 мл

Раствор 2:

Молочная кислота (40%) - 1 мл

Раствор 3:

NaHCO₃ - 1,0 г

Дистиллированная вода - 10,0 мл

Раствор 4:

Na₂S×9H₂O - 0,3 г

Дистиллированная вода - 6,0 мл

Раствор 5:

FeSO₄×7H₂O - 0,4 г

Дистиллированная вода - 10,0 мл

Приготовление модифицированной среды N 92М для выделения и культивирования предлагаемого штамма.

Раствор 1 доводят до кипения с одновременным продуванием сквозь этот раствор свободной от кислорода смеси газов, состоящей из 97% N₂ и 3% H₂. Стерилизуют в атмосфере этих газов. Растворы 3, 4 и 5 стерилизуют в атмосфере N₂. После стерилизации все пять растворов соединяют. Значение рН среды после смешения устанавливают 7,2-7,4.

Получают чистую культуру предлагаемого штамма Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д.

Пример 2. Использование штамма бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д для очистки вод от повышенных концентраций сульфатов

Процесс осуществляют в периодическом реакторе. Реактор засевают предварительно выращенной культурой бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д. Температуру культивирования поддерживают в диапазоне 28-30°С. В результате жизнедеятельности предлагаемого штамма выделяется сероводород и образуется осадок сульфида железа, уменьшается содержание сульфатов. Эффективность удаления сульфата из жидкой среды увеличивается за счет выведения из жидкой среды растворенного сероводорода, продуцируемого предлагаемым штаммом, в виде нерастворимого сульфида железа.

Эффективность работы реактора по очистке вод от повышенных концентраций сульфатов составляет до 80% при начальной концентрации сульфатов 3 г/л за 14 дней.

Пример 3. Использование штамма бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д для очистки вод от ионов шестивалентного хрома

Процесс осуществляют в периодическом реакторе. Засевают реактор предварительно выращенной и иммобилизованной на пористом носителе культурой бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д. Температуру культивирования в реакторе поддерживают в диапазоне 28-30°С. В реактор вносят среду, моделирующую сточные воды с концентрацией хрома (VI) 17,5 мг/л, сульфат - 0,5 г/л. В качестве источника углерода используют молочную кислоту. В результате жизнедеятельности СВБ выделяется сероводород, который соединяется с ионами металла, накопление сероводорода в среде отмечают только после полного исчезновения хрома (VI).

Эффективность работы реактора по удалению 17,5 мг/л шестивалентного хрома составляет 99,9% за 5 дней.

Таким образом, сточные воды, содержащие повышенные концентрации сульфатов (более 3 г/л) и ионы некоторых тяжелых металлов, могут быть эффективно очищены с помощью прелагаемого штамма бактерий Desulfovibrio oxamicus ВКМ В-2465 Д. Расширяется ассортимент штаммов бактерий, используемых для очистки сточных вод. Не используются токсичные компоненты.

Штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus BKM В-2465 Д выделен из речных донных отложений. Штамм характеризуется высокой степенью очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов при повышенных концентрациях сульфатов. Степень очистки от шестивалентного хрома составляет 99,9%, от сульфатов - 80%.

Штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus BKM B-2465 Д, используемый для очистки сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов.