СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЛИМФАДЕНИТА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в диагностике туберкулезного лимфаденита /ТЛА/.

Важность своевременной диагностики ТЛА обусловлена эпидемиологическими показателями, свидетельствующими о быстром относительном и абсолютном росте заболеваемости туберкулезом периферических лимфоузлов с увеличением его удельного веса среди других локализаций туберкулеза, патоморфозом заболевания с нарастанием нетипичных его проявлений, стертых форм, резко затрудняющих дифференциальную диагностику. Необходим пересмотр проблемы ТЛА в соответствии с новыми данными о лимфатической системе и достижениями лимфологии, соотносимыми с современными представлениями об иммунитете при туберкулезе на системном и местном уровнях, в котором ведущая роль отводится лимфатической ткани и лимфоцитам.

Известно, что функциональные свойства Т-лимфоцитов крови, оцениваемые по реакциям бластной трансформации лимфоцитов и торможения миграции лейкоцитов /РБТЛ, РТМЛ/, использовались для постановки диагноза ТЛА /Дифференциальная диагностика аденопатий туберкулезной и неспецифической этиологии у детей: Метод. рекомендации /Львовский НИИ туберкулеза; Сост. В.Ф. Подусовский, В.М. Барме. - Львов, 1976/. Специфическая активность B-лимфоцитов крови, выявляемая в реакциях непрямой гемагглютинации и гемолизиса /РНГА, РГЛ/ с туберкулиновым антигеном, также учитывалась при диагностике туберкулеза периферических лимфоузлов /Выявление, диагностика и лечение внелегочного туберкулеза: Метод. рекомендации /Московский НИИ туберкулеза; Под. ред. А.А. Приймака, Т.П. Мочаловой, Э.Н. Беллендира. - М., 1991/. Тем не менее, данные о том, насколько информативны рекомендуемые реакции клеточного и гуморального иммунитета при постановке диагноза ТЛА отсутствуют. Безуспешной оказалась попытка усовершенствовать гуморальную иммунодиагностику ТЛА с помощью использования специфических патентованных антигенов в иммуноферментном анализе /Turneer M. et al. Determination of humoral immunoglobulin M and G direct against antigen 60 failed to diagnose primary tuberculosis and mycobacterial adenitis in childdren // Amer. J. Resp. Crit. Care Med. - 1994. - У.150. - N 6. - P. 1508 - 1510/.

Наконец, для подтверждения диагноза туберкулеза лимфоузлов было предложено комплексное использование реакций клеточного и гуморального иммунитета на системном уровне с туберкулиновым антигеном /РБТЛ, реакция Манту, РНГА, РГЛ, реакция потребления комплемента// М.М. Нездатный, В.А. Талантов, О. А. Якунова и др. Данные иммунологического и морфологического исследований у больных туберкулезом периферических лимфатических узлов //Пробл. туберкулеза. - 1982. - N 4. - С. 59 - 62/. Этот способ, являющийся прототипом предлагаемого изобретения, не отличается высокой диагностической точностью /не более 61% совпадений при 18% ложноположительных результатов/, трудоемок, основан на нестандартизованных реакциях клеточного и гуморального иммунитета и не учитывает современных представлений об участии B-клеток лимфоузла в синтезе и секреции антител.

Цель предлагаемого изобретения - упрощение и повышение точности иммунологической диагностики ТЛА.

Цель достигается за счет определения концентрации противотуберкулезных антител /ПТАТ/ в ткани пораженного лимфоузла с помощью стандартной иммуноферментной тест-системы, при величине оптической плотности, равной или превышающей 0,300, диагностируют туберкулез периферических лимфоузлов.

Специальными исследованиями установлена особая роль лимфатических узлов в иммунопатогенезе туберкулеза /Weissler J.C. Tuberulosis. Immunophatogenesis and therapy // Amer. J. Med. Sci. - 1993. - Y. 305. - N 1. - P. 52 - 65/. В наибольшем количестве и раньше всего антиген поступает в регионарный лимфатический узел /Fojtasek M.F. et al Local immunity in lung-associated lymph nodes in a murine model of pulmonary histoplasmosis // Infect. and Immun. - 1993. - Y. 61. - N 11. - P. 4607 - 4615/. В нем происходит локальная антиген-обусловленная клональная клеточная пролиферация /Meyer E.M. Zur functio. nellen Bedeutung der histologizchen Lymphknotenreactionen // Klin. Wschr. - 1982. - B. 60. - N 6. - 265- 273/. Следовательно, иммунитет инициируется в регионарном лимфатическом узле. В нем на клетках стромы в наибольших количествах фиксируются антигены, антитела и иммунные комплексы, а в лимфоидной ткани продуцируются лимфокины и депонируются антитела. Первично вовлеченный в иммунный процесс лимфатический узел не является единственным участником иммунного ответа, т.к. быстро возникает генерализация последнего. Тем не менее, приведенные иммунологические данные оправдывают попытки и указывают на основные направления поисков возможностей использования изучения местного иммунитета для решения тех вопросов диагностики ТЛА, которые еще недавно казались неразрешимыми.

Принципиальным отличием заявляемого способа от прототипа являются: 1/ простота выполнения, которая состоит в том, что требуется постановка только одной реакции - выявление ПТАТ с помощью стандартной иммуноферментной тест-системы - вместо одновременной постановки и комплексного учета результатов четырех реакций - РНГА + РГЛ + РПК + РБТЛ, каждая из которых более трудоемка, чем ИФА; 2/ более высокая точность, т.к. поиски ПТАТ производятся непосредственно в очаге поражения. В результате чувствительность заявляемого способа повышается не менее, чем на 25%, специфичность - на 10%.

Способ выявления ПТАТ в ткани пораженного лимфоузла осуществляют следующим образом:
удаленный лимфоузел, освобожденный от пленок жира и фиброзной капсулы, взвешенный на торсионных или аптечных весах, измельчают до получения кашицеобразной массы. К гомогенату прибавляют хлороформ /на 1 г ткани - 5 мл хлороформа/, перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике. Отсасывают и отбрасывают хлороформ, осушают гомогенат фильтровальной бумагой до воздушно-сухого состояния, затем растирают гомогенат с небольшим количеством речного песка и 0,9%-ным раствором хлористого натрия, содержащего 0,05% тритона X-100, в соотношении 5 мл физраствора на 1 г сырого веса ткани лимфоузла. Гомогенат центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин. В супернатанте определяют концентрацию ПТАТ согласно инструкции, прилагаемой к набору стандартной иммуноферментной тест-системы /ВФС 42-388 ВС-93/, содержащей все необходимые реактивы:
- антиген растворяют в буферном растворе, вносят в лунки планшетов, инкубируют 18 ч при 4^oC. Затем последовательно добавляют супернатант и конъюгат - белок A, меченный пероксидазой. После каждого этапа инкубации антигена и супернатанта планшет промывают трехкратно, после инкубации с конъюгатом - 5 раз. В качестве субстрата используют раствор O-фенилендиамина, который вносят в лунки и инкубируют вместе с перекисью водорода в течение 30 мин при комнатной температуре. Остановку реакции осуществляют добавлением серной кислоты /1 М/. Учет результатов проводят на вертикальном фотометре типа Мультискан при длине волны 492 нм.

Полученный результат - концентрация ПТАТ, выраженная через величину оптической плотности /ОП/ - соотносят с пороговым значением показателя, рассчитанным на основании статистической обработки результатов сопоставления индивидуальных значений ОП с данными гистологического исследования тех же пораженных лимфоузлов с использованием информационной меры Кульбака. При величине ОП ≥ 0,300 диагностируют ТЛА. При ОП < 0,300 диагностируют неспецифический лимфаденит.

Апробацией заявляемого способа служат результаты обследования 2-х групп больных с поражением периферических лимфоузлов, всего 43 человека. 1-ю группу составили 17 больных ТЛА, 2-ю - 26 больных неспецифическим лимфаденитом. Диагноз туберкулезного поражения верифицировался положительными результатами гистологического и бактериологического исследований тех же удаленных лимфоузлов. Оказалось, что у 15-ти больных 1-й группы ОП > 0,300 /0,301 - 0,682/; у 2-х больных ОП < 0,300 /0,288 и 0,217/. Следовательно, чувствительность способа составляет 88,2%. У 24-х больных 2-й группы ОП < 0,300 и лишь в двух случаях оказалась выше порогового значения /0317 и 0,384/. Т. о. , специфичность предлагаемого способа составляет 92,3%. Позитивная и негативная предсказывающие ценности теста составляют 88,2% и 92,3%. В целом, с помощью предлагаемого способа правильный диагноз по двум группами больных был поставлен в 39-ти случаях из 43-х; значит, диагностическая эффективность теста составляет 90,7%.

Примеры реализации заявленного способа.

1. Больная Н., 52 лет. Жалобы на увеличение шейных лимфоузлов слева, наличие свища с гнойным отделяемым. Больна в течение 6 мес. Реакция Манту положительна /р. 12 мм/. В экстракте ткани удаленного лимфоузла с помощью стандартной ИФА тест-системы выявлены ПТАТ: величина ОП супернатанта выше пороговой и составляет 0,577. Диагноз - туберкулез шейных лимфоузлов, свищевая форма. Диагноз подтвержден гистологически - в препарате участки казеозного некроза, эпителиоидноклеточные бугорки с гигантскими клетками.

2. Больная Ч., 53 лет. Жалобы на увеличение шейных лимфоузлов слева. Больна в течение 4 мес. Реакция Манту положительна /р. 11 мм/. В экстракте ткани удаленного лимфоузла ПТАТ не выявлены: величина ОП супернатанта ниже пороговой и составляет 0,208. Диагноз - неспецифический шейный лимфаденит. Диагноз подтвержден гистологически - в препарате преимущественно жировая ткань, небольшие участки диффузной гиперплазии лимфоузла без признаков специфического воспаления.

Подтверждением заявляемого способа служат собственные экспериментальные данные. На моделях туберкулеза периферических лимфоузлов кроликов установлено, что ОП экстрактов существенно выше, чем у животных с неспецифическим лимфаденитом, развившимся на фоне предшествующей вакцинации животных BCG или сенсибилизацией их введением убитой культуры возбудителя туберкулеза /ОП соответственно > 0,500; < 0,020 и < 0,280/.

Предлагаемый тест, патогенетически обоснованный, позволяет сократить количество иммунологических исследований, стандартизовать и повысить точность иммунодиагностики /чувствительность не менее, чем на 25%, специфичность - на 10%/.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики туберкулезного лимфаденита путем иммунологического исследования. В экстракте ткани пораженного удаленного лимфоузла с помощью стандартной иммуноферментной тест-системы определяют концентрацию противотуберкулезных антител (ПТАТ). При концентрации ПТАТ, выраженной через величину оптической плотности, равной или превышающей 0,3, диагностируют туберкулезный лимфаденит периферических лимфоузлов. Способ позволяет стандартизировать и повысить точность диагностики.

Способ диагностики туберкулезного лимфаденита путем иммунологического исследования, отличающийся тем, что в экстракте ткани пораженного удаленного лимфоузла с помощью стандартной иммуноферментной тест-системы определяют концентрацию противотуберкулезных антител (ПТАТ) и при концентрации ПТАТ, выраженной через величину оптической плотности, равной или превышающей 0,3, диагностируют туберкулезный лимфаденит периферических лимфоузлов.