СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОГРАНИЧЕННЫХ ФОРМ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/68 G01N33/544 

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиопульмонологии, и может быть использовано в диагностике ограниченных форм туберкулеза легких.

Дифференциальная диагностика ограниченных сегментарных поражений легких является сложной проблемой клинической фтизиопульмонологии. В последнее время в диагностике туберкулеза широко применяется иммунодиагностика, в частности, определение уровня противотуберкулезных антител (ПТАТ) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) [1]. Однако использование иммунологического метода затруднено, с одной стороны, низкой выработкой ПТАТ при ограниченных формах туберкулеза и, с другой стороны, довольно частым их обнаружением при опухолевых процессах и ограниченных пневмониях [2, 3, 4].

Известный туберкулино-иммунологический тест несколько повышает информативность иммунологического исследования. Так, если при ограниченных формах туберкулеза положительная реакция ИФА в сыворотке крови отмечается в 33,3% случаев, то после пробы Коха уровень ПТАТ становится положительным еще у 14,8% больных. Таким образом, чувствительность ИФА в условиях провокационного теста повышается до 48,1% при специфичности 84,2% [5 - прототип].

Однако ряд авторов указывает на несоответствие выраженности местного и системного иммунитета [6, 7, 8, 9]. Исследование уровня ПТАТ непосредственно в зоне поражения существенно повышает точность иммунодиагностики туберкулезного сановита, туберкулезного спондилита [10]. Зона туберкулезного поражения является более чувствительной к антигенной стимуляции, в связи с чем можно ожидать, что исследование ПТАТ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) также повысит чувствительность и специфичность метода.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности диагностики ограниченных форм туберкулеза легких. Она достигается за счет того, что определяется динамика противотуберкулезных антител в жидкости, полученной при двукратном бронхоальвеолярном лаваже пораженного сегмента до и через 48 часов после подкожного введения туберкулина (20 ТЕ).

У больных туберкулезом после пробы Коха отмечена различная (разнонаправленная) динамика уровня противотуберкулезных антител, обусловленная развитием иммунного конфликта в зоне специфического поражения легкого. При положительных и особенно резко положительных фоновых титрах наблюдается тенденция к снижению уровня ПТДТ до существенно меньших значений (вплоть до отрицательных) за счет нейтрализации поступившего избыточного антигена в реакции "антиген-антитело". Напротив, при отрицательных исходных уровнях ПТАТ туберкулин оказывает стимулирующее влияние на антителообразование, что приводит к достоверному повышению содержания антител до положительных значений.

При нетуберкулезных заболеваниях, в отличие от туберкулеза, не характерна динамика в сторону уменьшения титров: отмечено одионаправленное их изменение в сторону некоторого увеличения как при отрицательных, так и при положительных исходных значениях.

Способ осуществляется следующим образом.

Больному после выполнения клинико-рентгенологического обследования проводят фибробронхоскопию с лаважем пораженного сегмента. Сегментарный бронхоальвеолярный лаваж проводится по стандартной методике (объем введенной жидкости 100 мл). В день бронхоскопии больному подкожно вводится туберкулин (20 ТЕ). Через 48 часов повторяется бронхоальвеолярный лаваж того же сегмента. В ЖБАЛ, полученной до и после туберкулиновой пробы, определяется уровень противотуберкулезных антител методом ИФА с использованием стандартной тест-системы иммунофермеитной для выявления антител к возбудителю туберкулеза (ВФС 42-388 ВС 93).

Лаважную жидкость центрифугируют при скорости 6000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость осторожно переносят в чистую пробирку и используют для определения ПТАТ согласно инструкции, приложенной к набору иммуноферментной тест-системы. Материал для исследования используют в цельном виде, без разведения.

Растворы для проведения иммуноферментного анализа готовят в соответствии с инструкцией, приложенной к набору тест-системы.

Проведение иммуноферментного анализа.

1) Иммобилизация специфического антигена на планшете. Во все лунки планшета вносится по 0,1 мл раствора антигена. Планшет закрывают крышкой и инкубируют 18-20 ч при температуре 4-6^oC, после чего антиген удаляют из планшета вытряхиванием. Планшет промывают буферным раствором ФСБТ 3 раза (по 0,25 мл в лунку).

2) Внесение контрольных и исследуемых образцов (ЖБАЛ). В две лунки (A-1, B-1) вносят по 0,1 мл ФСБТ (контроль субстрата); в другие две лунки (C-1, D-1) - по 0,1 мл раствора НК (негативный контроль), в следующие две лунки (E-1, F-1) по 0,1 мл раствора ПК (позитивный контроль). В остальные лунки вносят по 0,1 мл анализируемых образцов (каждый образец вносят дважды, в две соседние лунки). Планшет закрывают крышкой и выдерживают в термостате при температуре 37^oC в течение 1 ч, затем промывают 3 раза раствором ФСБТ, как указано в п.1.

3) Во все лунки вносят по 0,1 мл раствора конъюгата. Планшет закрывают и инкубируют при температуре 37^oC в течение 1 ч, затем промывают 5 раз раствором ФСБТ.

4) Во все лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Планшет закрывают и выдерживают в темноте при температуре 18-22^oC в течение 30 мин.

5) Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 0,1 мл раствора серной кислоты.

6) Учет результатов. При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и негативным контролем (НК) должно оставаться бесцветным, содержимое лунок с позитивным контролем (ПК) должно приобрести желто-коричневую окраску.

Измерение оптической плотности (ОП) проводят на вертикальном фотометре типа "Multiscan" при длине волны 492 нм непосредственно в планшете. Среднее значение ОП в лунках с ПК должно быть не ниже 0,5, в лунках с НК - не выше 0,2. ОП остальных лунок соответствует содержанию ПТАТ в анализируемых образцах. ОП образца служит условной мерой концентрации находящихся в нем ПТАТ (в у.е.).

Исследование надосадочной ЖБАЛ с последующей клинической интерпретацией результатов у конкретного больного сопряжено с техническими трудностями, обусловленными сложностью стандартизации степени ее разведения. Для более высокой надежности использована ошибка 2,5 m (0,100 у.е.). С целью наибольшего исключения случайных различий при выведении разницы показателей в процентах к минимальному значению прибавляется, а от максимального отнимается 0,100 у. е. Если оба показателя меньше уровня диагностической оптической плотности (0,200 у.е.), то динамика содержания антител не учитывается.

Проявлением очаговой реакции принято снижение уровня антител в ЖБАЛ на 45,0% и более или его повышение на 150,0% и более. Такая отрицательная или положительная динамика отмечена соответственно у 31,7 и 17,1% (всего у 48,8%) больных туберкулезом и у 5,1% больных нетуберкулезными заболеваниями. Чувствительность метода составляет 48,8%, специфичность - 94,9%.

Таким образом, существенное снижение или повышение титров ПТАТ, как свидетельство стимулированного туберкулином иммунного конфликта в зоне специфического поражения, является характерным для туберкулезной природы заболевания.

Клинические наблюдения,
1. Больной Б., 48 лет, поступил 16,01.95, и/б N 43. Заболевание началось остро, протекало с фебрильной температурой, выраженной интоксикацией, кашлем с большим количеством гнойной мокроты. При рентгенологическом исследовании выявлен неоднородный инфильтрат в C₂ левого легкого. Дифференциальный диагноз проводился между туберкулезом и пневмонией. Очаговая реакция на провокационную пробу проявилась уменьшением уровня ПТДТ в ЖБАЛ с 1,451 до 0,009 у. е.(-91,9%). Назначена противотуберкулезная терапия. Через месяц получен результат посева ЖБАЛ: выделена культура M.tuberculosis.

2. Больная С., 20 лет, поступила 10.04.96, и/б N 123. При флюорографии, сделанной по поводу остро начавшегося заболевания, выявлен инфильтрат с распадом в верхней доле левого легкого. Проводилась дифференциальная диагностика между абсцедирующей пневмонией и инфильтративным туберкулезом. Очаговая реакция на провокационную туберкулиновую пробу проявилась увеличением уровня ПТАТ в ЖБАЛ с 0,095 до 1,027 у.е. (+375,4%),что позволило поставить диагноз туберкулеза и своевременно назначить адекватную терапию. При посеве ЖБАЛ получен рост M.tuberculosis.

Источники информации
1. Вербов В.Н., Якунова О.А., Шендерова Р.И., Артюхов А.И. Сравнительная оценка иммуноферментной тест-системы при использовании для серодиагностики туберкулеза и нетуберкулезных заболеваний // Пробл. туб. - 1990. -N 10.-С. 60-62.

2. Кноринг Б.Е. Оценка иммунитета больных туберкулезом с учетом патогенетических особенностей заболевания // Пробл. туб. - 1995. - N 1. -С. 18-21.

3. Кноринг Б. Е. , Рыбалко В.В., Сахарова И.Я. и др. Иммунологические критерии дифференциальной диагностики заболеваний легких // Пробл. туб. -1994. - N 6. -С. 38 - 41.

4. Кноринг Б.Е., Ариэль Б.М. Оценка клинической значимости туберкулиновой сенсибилизации у больных раком // Пробл. туб. - 1996. -N 2.-С. 26- 30.

5. Ивановский В.Б., Стеклова Л.К. О результатах комплексного применения во фтизиатрии туберкулинопровокациоиной пробы и ИФА // Пробл. туб. - 1993. -N 2.-С. 42-44. (прототип)
6. Герман Г.П., Чернохвостова Е.В., Мальцева Н.Н. Сравнительный анализ системного и местного иммунитета при избирательном дефиците IgA // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 1984. -N 3. -С. 89 -93.

7. Титанян А.С., Селицкая Р.П., Ким А.Ч. Определение концентрации иммунотообулинов и других белков в бронхоальвеолярной жидкости больных при различной легочной патологии // Тер. арх. - 1987. N 12. -С. 48-51.

8. Авербах M.M., Колодяжная Н.С., Абрамова З.П. и др. Иммунологическое исследование бронхоальвеолярного смыва при заболеваниях легких // Диагностический бронхоальвеолярный лаваж. - М., 1988. -С. 21-24.

9. Шестерина М.В., Селицкая Р.П., Ким А.П., Киреева С.Г. Оценка активности иммуноглобулинпродуцирующей функции легкого при туберкулезе // Пробл. туб. - 1985. -N 11. -С. 16-18.

10. Беллеидир Э.Н., Щендерова Р.И., Горяшина В.И. и др. Патогенетическое обоснование и методика диагностики туберкулезно-аллергического синовита коленного сустава // Пробл. туб. - 1994. -N 3. -С. 34-38.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиопульмонологии, и может быть использовано в диагностике ограниченных форм туберкулеза легких. Способ основан на оценке динамики противотуберкулезных антител в жидкости бронхоальвеолярного лаважа пораженного сегмента в условиях провокационной туберкулиновой пробы. Количество антител определяют до и через 48 ч после подкожного введения обследуемому туберкулина. При снижении уровня антител на 45% и более или повышении на 150% диагностируют туберкулез легких. Способ эффективен, его чувствительность составляет 48,8% при специфичности 94,9%.

Способ диагностики ограниченных форм туберкулеза легких путем иммунологического исследования, отличающийся тем, что с помощью стандартной иммунной тест-системы определяют уровень противотуберкулезных антител в жидкости бронхоальвеолярного лаважа до и через 48 ч после подкожного введения туберкулина и при динамике снижения уровня антител на 45,0% и более или повышения на 150,0% и более диагностируют туберкулез легких.