СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ВОДЫ ПРИ МАЛЫХ ДОЗАХ РАДИАЦИОННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к экологии и медицине и может найти применение при оценке качества питьевой воды.

Исследованию качества питьевой воды уделяется в последние годы очень большое внимание. Потенциальные источники водозабора подвергаются всестороннему предварительному изучению по различным параметрам, в том числе в отношении радиационного воздействия на живые органы. Еще более тщательно исследуются минеральные воды, поскольку они в большей степени потребляются ослабленными или больными людьми. При этом особое внимание уделяется рационально-химическому воздействию воды на организм, поскольку именно эти два фактора могут привести к развитию той или иной патологии и в конечном итоге к сокращению продолжительности жизни.

Исследованию влияния высоких доз радиации на организм посвящено большое число научных работ. Однако не менее серьезной проблемой является изучение малых доз радиации, поскольку такому воздействию подвергается большое число людей вследствие необходимости профессионального или бытового контакта с источниками ионизирующего излучения. В связи с этим изучение влияния потребляемой воды, в том числе минеральной, на живые организмы при малых дозах радиационных воздействий представляется весьма актуальным. Особое значение это имеет для больных, проходящих неоднократное рентгенологическое обследование, для медицинского персонала при работе с источниками ионизирующего излучения, а также для людей, проживающих в районах с повышенной радиационной активностью, в радоноопасных зонах, и широкого круга лиц, постоянно испытывающих действие малых доз радиации на производстве и в быту.

Известен способ оценки качества минеральной воды, заключающийся в том, что животным после облучения их в дозе 5 Гр вводят минеральную воду (Московская минеральная вода) в качестве питьевой [1]. Через 60 суток у животных подсчитывают число нормальных гепатоцитов и измеряют уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ). По достоверному уменьшению числа некробиотических (2% против 6,5%) и дистрофических (14,9% против 36,4%) клеток и снижению уровня ПОЛ (12,4 мкМ против 15,4 мкМ малонового альдегида) по сравнению с контрольной группой животных, получавшей после облучения в той же дозе водопроводную воду, делают заключение об активности восстановительных процессов у опытных животных, связывая этот эффект с приемом ими минеральной воды.

Этот метод приготовлен для оценки биологической эффективности воды лишь в случае использования высоких доз радиации и не может применяться для исследования сочетания ее с малыми дозами радиации, которые не вызывают некроза клеток. Измерение этих показателей в такой ситуации не позволило бы сделать обоснованного заключения о действии воды на пострадиационные процессы.

Для характеристики влияния на организм сочетания питьевой воды с малыми дозами радиации считается достаточным определить изменение продолжительности жизни экспериментальных животных, которые потребляют исследуемую воду после однократного радиационного воздействия на них в малых дозах. Такое исследование занимает, как правило, не менее 2-3 лет, что делает способ непригодным при необходимости быстрой оценки качества воды.

Наиболее близким к предлагаемому является метод оценки биологической эффективности воды при радиационном действии на организм путем однократного общего радиационного облучения животных в дозе 1 Гр с последующим использованием минеральной воды для них в качестве питьевой, взятый нами за прототип [2].

Способ позволяет через 50 суток после облучения по определению числа хромосомных аберраций в клетках эпителия слизистой тонкого кишечника оценить особенности действия воды. Определение хромосомных аберраций проводят одновременно для контрольных и опытных животных путем инкубирования суспензии питательной среды и эпителиальных клеток тонкой кишки этих животных при температуре 37^oC в течение 67-69 часов, после чего к ним добавляют колхицин и инкубацию продолжают еще 3 часа. Затем клетки промывают несколько раз центрифугированием, фиксируют, наносят на предметные стекла, высушивают и окрашивают раствором краски Романовского-Гимза. Метафазы фотографируют с помощью микроскопа, определяют изменения в хромосомном наборе, т.е. аберрации числа хромосом и полученные данные подвергают статистическому анализу. В случае достоверного снижения измеряемого показателя по сравнению с контролем авторы делают заключение о благоприятном эффекте минеральной воды.

Способ позволяет оценить эффект питьевой минеральной воды при радиационных воздействиях в низких дозах. Однако, он трудоемок и длителен, поскольку требует для получения результатов исследования 50-дневного эксперимента с последующим определением хромосомных аберраций в течение 5 суток.

Кроме того, в этих исследованиях используется доза радиационного воздействия 1 Гр. Вместе с тем, интересующий нас контингент людей, находящихся под действием малых доз радиации, получает гораздо более низкие дозы (для человека - 10 сГр и меньше). Однако экстраполировать данные, полученные при действии более высоких доз облучения, а в область более низких невозможно, так как в настоящее время показана некорректность такого рода подходов, занижающих действительную опасность биологических эффектов малых доз из-за существования в этом диапазоне зоны повышенной радиочувствительности [3, 4].

Технический результат настоящего изобретения состоит в сокращении времени определения эффективности воды при действии на организм малых доз радиации за счет измерения концентрации гемоглобина крови.

Этот результат достигается тем, что животных однократно облучают в дозе 25 сГр, затем в течение 30 суток им дают в качестве питьевой исследуемую воду, после чего определяют у них содержание гемоглобина в крови и при превышении его более чем на 8% по сравнению с контрольной группой животных, получавших при прочих равных условиях водопроводную воду, делают заключение о благоприятном эффекте воды.

В течение ряда лет мы профессионально занимаемся исследованием различных факторов окружающей среды, оказывающих влияние на продолжительность жизни живых организмов. В последние годы наши исследования связаны с качеством питьевой, в частности минеральной, воды и определением ее эффекта при малых дозах радиационных воздействий. Это обусловлено тем, что малые дозы радиации, как уже выше сказано, могут быть причиной целого ряда патологических состояний.

Фармацевтические фирмы в связи с этим предлагают ряд радиопротекторов, которые могут быть использованы, в основном, при среднелетальных и высоких дозах облучения. Задачей настоящего исследования явился поиск геропротектора как наиболее безопасного и в то же время доступного средства, в качестве которого мы использовали питьевую воду.

С этой целью мы предприняли исследование ряда гематологических и биохимических показателей у мелких лабораторных животных до их естественной смерти после однократного облучения в диапазоне малых доз (до 1 Гр) с последующим многопараметровым корреляционным анализом показателей и эффектом. Такое исследование позволило нам установить, что при малых дозах облучения существует достоверная взаимосвязь между величиной средней продолжительности жизни животных (крыс) и концентрацией гемоглобина в их крови (R = 0,929, p < 0,05):
СПЖ (сутки) = -528 + 10,6 • Hb%,
где СПЖ - средняя продолжительность жизни (сутки),
Hb - концентрация гемоглобина крови (в процентах по отношению к облученному контролю), измеренная через 30 суток после облучения.

Концентрацию гемоглобина в крови определяли следующим образом.

К 4 мл физиологического раствора добавляли 0,2 мл лизирующей смеси (2,0 М NaCl, 0,1 М Na₂EDTA, 0,01 М трис, 0,5% тритон X-100, pH 8,0) для лизиса эритроцитов. Потом добавляли 0,02 мл цельной крови из хвостовой вены крыс. Измерение стандарта и пробы производили при λ = 540 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2 с водой в кювете сравнения. Все кюветы толщиной 1 см. Стандарт соответствовал 16 г%. Концентрацию гемоглобина проб выражали относительно стандарта в г%. Это позволяет определить искомую величину в течение 5-7 мин, то есть практически экспрессно.

Крыс облучали в дозе 25 сГр (поскольку известно, что крыса примерно в 2 раза радиорезистентнее человека, была использована двойная доза облучения). Эта доза выбрана нами потому, что проведенным нами исследования показали большее действие ее на изменение концентрации гемоглобина (снижение на 21,6 ± 1,7% относительно контроля), чем действие дозы 50 сГр (снижение на 17,5 ± 0,8% по сравнению с контролем).

Динамика изменений концентрации гемоглобина у крыс после гамма-облучения с 25 по 33 сутки (см. таблицу 1) свидетельствовала прежде всего о том, что величина этого показателя у облученных животных была достоверно ниже (p < 0,05), чем у интактных. Вместе с тем, при введении минеральной воды после облучения значения концентрации гемоглобина возрастали и через 30 суток достоверно отличались от значений облученного контроля (p < 0,05). Измерение концентрации гемоглобина в сроки менее 30 суток после облучения не давало возможности определить достоверного возрастания данного показателя по сравнению с контролем. Как следует из данных таблицы, определение показатели в сроки более 30 суток нецелесообразно, так как это удлиняет всю процедуру оценки биологического эффекта воды, не приводя к существенным изменениям получаемого результата.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Мелких лабораторных животных (крыс) однократно облучают в дозе 25 сГр, анализируемую минеральную воду используют в качестве питьевой в течение 1 месяца, а затем определяют концентрацию гемоглобина крови и в случае отклонения более, чем на 8% определяемой величины от контрольной, получаемой путем аналогичного измерения концентрации гемоглобина крови облученных в той же дозе животных, но потреблявших водопроводную воду, делают заключение о биологической эффективности минеральной воды.

Способ поясняется следующим примером.

Пример.

30 крыс массой 160-180 г однократно облучили в дозе 25 сГр (поскольку известно, что крыса примерно в 2 раза радиорезистентнее человека, это воздействие адекватно облучению людей в дозе около 10-12 сГр) на установке "ИГУР-1" (¹³⁷Cs, мощность дозы 0,71 Гр/мин). В течение 30 суток после облучения животные находились на стандартной диете, а в качестве питьевой воды получали:
- первая группа из 5 животных - минеральную воду "Полюстрово", содержащую ионы трехвалентного железа в концентрации 60-63 мг/л или
- вторая группа (5 животных) - Ca, Mg-содержащую воду с низкой минерализацией - 0,15 г/л ("Росинка-2") или
- третья группа (5 животных) - Ca, Mg-содержащую воду со средней минерализацией солей - 4,05 г/л ("Аква-Стар-3").

Контрольные животные в качестве питьевой получали водопроводную воду. Через 1 месяц после облучения отбирали пробы крови из хвостовой вены контрольных и опытных животных и определяла в пробах концентрацию гемоглобина стандартным способом: к 4 мл физиологического раствора добавляли 0,2 мл лизирующей смеси (2,0 М NaCl, 0,1 М Na₂EDTA, 0,01 М трис, 0,5% тритон X-100, pH 8,0). Затем добавляли 0,02 мл цельной крови. Измерение стандарта и пробы производили при λ = 540 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2. Стандарт соответствовал 16 г%. Концентрацию гемоглобина проб выражали относительно стандарта в г%. Результаты определения концентрации гемоглобина в группах интактных, облученных и опытных крыс (средние из 5 животных) представлены в таблице 2.

Как следует из данных таблицы, через 30 суток после облучения в дозе 25 сГр в контрольной группе крыс имеет место достоверное снижение измеряемой величины на 10-22%. Введение минеральной воды "Полюстрово" после облучения незначительно изменяет концентрацию гемоглобина. Введение минеральных вод "Аква-Стар-3" и "Росинка-2" приводит к повышению измеряемой величины на 17% и 8% соответственно.

Полученные в эксперименте данные свидетельствуют о том, что минеральная вода "Полюстрово" не имеет благоприятного биологического эффекта при малых дозах радиационного воздействия на организм. А минеральные воды "Аква-Стар-3" и "Росинка-2" благоприятно действуют на организм при малых дозах радиационного воздействия и они показаны для использования их лицам, испытывающим действие таких доз.

Исследование биологической эффективности воды по предлагаемому способу длится в общей сложности 30 дней - определение концентрации гемоглобина при этом занимает 10 минут с использованием 0,02 мл крови, т.е. способ является практически экспрессным.

Способ по сравнению с известными имеет ряд существенных преимуществ.

1. Сокращение времени оценки эффективности воды при малых дозах радиационного воздействия почти вдвое (30 суток вместо 50 в прототипе).

2. Значительное сокращение времени определения информативного показателя - до 10 мин, в то время как известные методы и прототип требуют для этого не менее 5 суток.

Способ разработан в лаборатории биотестирования токсических факторов окружающей среды ЦНИРРИ МЗ РФ на моделях с малыми дозами облучения и минеральными водами Санкт-Петербургского региона. Метод был апробирован с использованием питьевых минеральных вод, выпускаемых предприятиями "Полюстрово", "Аква-Стар" и "Петроспирт".

Литература
1. Зубкова С.М., Любимова Н.Н., Никулина Л.А, Панова Л.Н., Королев Ю.Н. Пострадиационное восстановление печени при применении питьевых минеральных вод. Радиационная биология. Радиоэкология. 1995, т. 35, вып. 6, с. 884-888.

2. Королев Ю.Н., Панова Л.Н., Никулина Л.А., Загорская Н.З. Действие сульфатной минеральной воды при общем радиационном облучении в эксперименте. Вопр. курортол. 1996, N 1, с. 25-28.

3. Иванов С. Д., Кованько Е.Г. Развитие отдаленных эффектов радиационно-химических воздействий. Тез. докл. 3-го съезда по радиационным исследованиям. М. 1997, т. II, с. 224 - 225.

4. Заичкина С.И., Клоков Д.Ю., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А. Х. Действие малых доз γ-радиации на цитогенетическое повреждение в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей in vivo. Генетика. 1998, т. 34, N 7, с. 1013 - 1016.

Способ может быть использован в медицине и экологии. Однократно облучают животных в дозе 25 сГр. Вводят им исследуемую воду в качестве питьевой в течение 30 дней. В крови животных определяют содержание гемоглобина. При превышении его более чем 8% по сравнению с контрольной группой животных, получавшей при прочих равных условиях водопроводную воду, делают заключение о благоприятном эффекте исследуемой воды на организм при малых дозах радиационного воздействия. Способ обеспечивает сокращение времени оценки. 2 табл.

Способ оценки биологического эффекта воды при малых дозах радиационных воздействий, включающий однократное облучение контрольных и опытных животных и последующее введение опытным минеральной воды, контрольным - водопроводной, отличающийся тем, что животных облучают в дозе 25 сГр, введение воды осуществляют в течение 30 суток, после чего определяют у них концентрацию гемоглобина в крови и при повышении ее у опытных животных более чем на 8% по сравнению с контролем делают заключение о благоприятном эффекте минеральной воды.