ШТАММ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER ОXYDANS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/06 

Изобретение относится к экологической биотехнологии, микробиологии при очистке почвенных и водных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, а также может использоваться в нефтеперерабатывающей промышленности для очистки сточных вод с щелочным pH среды, содержащих нефтепродукты.

Известен штамм бактерий Arthrobacter SP, используемый для очистки сточных вод от диоксана (см. ав. св. N 1557109 по МКИ 5 C 02 F 3/34).

Недостатком известного штамма является ограниченный спектр действия.

Недостатком известного консорциума штаммов является ограниченный спектр действия.

Наиболее близким по достигаемому результату является штамм бактерий Rnodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (см. ав. св. N 1805097 по МКИ 5 C 02 F 3/34, C 02 B 15/04).

Недостатком известного штамма бактерий является узкий спектр избирательного действия.

Предлагаемый штамм способен осуществлять очистку воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Полученный штамм 0-91 был выделен из образцов почв, отобранных с нефтяных промыслов Астраханского НГДУ (Калмыкия) в 1991 году и идентифицирован как Arthrobacter oxydans и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером ВКМ As-1838Д. Штамм получен методом накопительной культуры, т.е. многократным пересевом на жидкой минеральной среде в присутствии нефти. Для культивирования штамма использовали среду Ворошиловой-Диановой следующего состава (г/л); K₂HPO₄ - 1,0; KH₂PO₄ - 1,0; NH₄NO₃ - 1,0; MgSO₄ - 0,2; CaCl₂•6H₂O - 0,01; FeCl₃•6H₂O - 3 капли, в присутствии 1% углеводородов.

Штамм имеет следующие характеристики.

1. Морфологические и культуральные признаки.

Кокк-палочка-кокковый цикл роста. Эндоспоры не образует. Грамположителен, неподвижен, не ферментирует. Метаболизм дыхательный, никогда не бродильный. На МПА образует колонии кремово-белого цвета, округлые, выпуклые, гладкие, блестящие,
2. Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимизм роста 20-30 град. Цельсия. Растет при температуре 10-45 град., в диапазоне pH 5.5-9.2. Рост при 7% NaCl.

Отношение к углеводам
Использует сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, рафинозу, маннит, глицерин. Не усваивает арабинозу,
Отношение к углеводородам.

Использует октан, гексан, толуол, ксилол, бензол, парафин, асфальтены, камфору. Не усваивает нафталин. Ароматические нефти усваиваются активнее, чем парафинистые.

Ассимилирует нитратный азот.

Другие характерные физиологические особенности обмена.

Желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. Сероводород и индол не образует. Аммиак не выделяет. Оксидазная реакция отрицательная, каталазоположителен. Не имеет лецитиназы, аргининдегидролазы, уреазы, лизиндекарбоксилазы. Сохраняет жизнеспособность и деструктивную активность в лиофильно-высушенном состоянии.

Сведения о наличии патогенных свойств.

Непатогенен.

В таблице 1 представлены данные о влиянии различных антибиотиков на штамм Arthrobacter oxydans.

Условия хранения.

Штамм сохраняется в коллекции в лиофилизированном состоянии. Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (2-4 раза в год) на МПА под слоем вазелинового масла при температуре 4 град. Цельсия.

Биотехническая характеристика штамма Arthrobacter oxydans,
Изучена деструктирующая активность штамма при его выращивании на среде с внесением в качестве единственного источника углеродов сырой нефти или ее фракций.

Для получения посевного материала используют среду Ворошиловой-Диановой (среда указана выше). Среду разливают по 100 мл в колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 минут. Засевают 2% бактериальной взвеси, нефть вносят стерильно в количестве 1% (вес). Выращивание осуществляют в термостате стационарно при температуре 30 град. Цельсия.

Опыты ставятся в трех повторностях.

Контролями служат: минеральная среда с культурой без нефти, минеральная среда и нефть без бактерий.

По истечении 4 суток в опытных колбах происходит исчезновение нефти, образуется муть, что не наблюдается в контрольных колбах.

Изменение содержания нефти в среде культивирования контролировалось методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Хром-5.

Как видно из таблицы 2, ароматическая нефть утилизируется A.oxydans эффективнее (80,6%), чем парафинистая (70,0%)
Пример 1.

Окислительная активность предлагаемого штамма представлена в табл. 2.

Пример 2.

Изучение процесса утилизации углеводородов от времени воздействия представлено в табл. 3.

Опыт проводили по аналогии с примером 1. В таблице представлены результаты биодеструкции нефти и диз. топлива в зависимости от времени экспозиции опыта. Из таблицы 3 видно, что максимальную степень разложение диз. топливо достигает на 4-ые сутки, а разложение нефти к концу 4-х суток достигает 90%.

Пример 3.

Изучение процесса утилизации углеводородов от pH среды.

Микробную деструкцию нефти осуществляли на среде Ворошиловой-Диановой при температуре 28 град. Цельсия. pH среды регулировали 10%-ным раствором NaOH.

Посевной материал выращивали на МПА в течение 24 часов, смывали стерильным физиологическим раствором и вносили в колбы.

Результаты влияния pH на разложение нефти представлены в табл. 4.

Данные таблицы показывают, что за 96 часов деструкции при pH = 9 утилизируется до 80% нефти.

Таким образом, опыты доказывают, что штамм Arthrobacter oxydans As-1838 D является наиболее активным деструктором нефти и нефтепродуктов в щелочных условиях среды и может быть использован в нефтеперерабатывающей промышленности для очистки сточных вод с щелочным pH среды, содержащих нефтепродукты.

Изобретение относится к микробиологии, экологии. Новый штамм Arthrobacter oxydans ВКМ Ас-1838 Д обладает способностью использовать в качестве источника питания и энергии углеводороды в широких диапазонах pH среды. Штамм является активным деструктором нефти. Степень утилизации нефтепродуктов достигает 95,0%. 4 табл.

Штамм бактерий Arthrobacter oxydans ВКМ Ас-1838Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.