СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/12 

Описание патента на изобретение RU2129871C1

Изобретение относится к медицине, более конкретно к офтальмологии и может быть использовано для получения основных компонентов соединительной ткани - гликозаминогликанов для применения их в качестве лекарственной формы при лечении заболеваний и повреждений роговицы глаза.

Известен способ получения сульфатированных гликозаминогликанов (патент РФ N 2056851. Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из роговиц, авт. Багров С.Н., Ларионов Е.В., Панаск А.Ф.), путем обработки роговиц ферментом папаином, трихлоруксусной кислотой с последующим диализом.

Недостатком указанного способа является то, что при обработке тканей одним ферментом, часть гликозаминогликанов остается в неразрушенной ткани, особенно если ткань плотная, что приводит к снижению выхода конечного продукта.

Задачей изобретения является разработка универсального способа получения полного набора гликозаминогликанов, содержащихся в биологических тканях.

Техническим результатом изобретения является получение конечной субстанции с высоким содержанием гликозаминогликанов, лишенной белка и других примесей.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гликозаминогликанов биологическую ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролируют смесью ферментов, кипятят от 5 до 30 мин., центрифугируют от 3 до 45 тыс. об/мин, диализируют в течение 5-6 дней и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.

Измельчение биологической ткани (роговицы быков, свиней, стекловидное тело, трахея крупного рогатого скота, плавники акул), проводят механическим способом на ультраизмельчителе (Ai Ko, Japan) до получения однородной массы, лишенной крупных частиц ткани.

После измельчения гомогенат ткани дополнительно дезинтегрируют в ультразвуковой ванне в кавитационном режиме, время обработки зависит от плотности частиц ткани и степени начального измельчения.

Гидролиз ткани ведут с помощью ферментов, поскольку основными компонентами любой животной биологической ткани являются белки, а гликозаминогликаны, как правило, тесно связаны с ними. Гидролитическое (расщепляющее) действие ферментов всегда осуществляется при определенной температуре и для большинства ферментов лежит в диапазоне от 37 до 66oC. Время гидролиза для большинства ферментов также вполне определенно, оно определяется скоростью ферментсубстратного взаимодействия.

После гидролиза полученный гомогенат центрифугируют от 3 до 6 тыс. об/мин. При центрифугировании со скоростью менее 3 тыс. об/мин осаждается менее 50% гомогената, а при скорости выше 45 тыс.об/мин, часть основного продукта уходит в осадок.

Диализ надосадка гидролизата проводят в течение 5-6 дней. При диалезе менее 5 дней в растворе обнаруживаются белки и другие примеси, а при диализе более 6 дней качественный и количественный состав гликозаминогликанов в растворе остается постоянным, что делает продолжение диализа нецелесообразным.

Повторное центрифугирование диализата позволяет окончательно удалить примеси из раствора.

Осаждение гликозаминогликанов из раствора производят с помощью насыщенных растворов этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.

Способ осуществляется следующим образом. Полученную свежую биологическую ткань отмывают от примесей крови, жировой ткани, взвешивают, измельчают на ультраизмельчителе (фирма Ai Ko, Japan), помещают в ультразвуковую "ванну" в режим кавитации, затем гомогенат обрабатывают смесью протеологических ферментов, которые подбирают конкретно для каждой ткани, именно для роговиц свиней и быков - смесь ферментов 0,01% p-p трипсина (химотрипсина) и 0,0125% p-p папаина; для трахей крупного рогатого скота 0,005% p-p коллагеназы и 0,125% p-p папаина; для стекловидного тела 0,0050 p-p коллагеназы и 0,125% p-p папаина. Гидролиз ткани ведут на водяной бане при 37-66oC, по окончании гидролиза гомогенат кипятят в течение 5-30 мин, помещают гомогенат в центрифужные стаканы и центрифугируют от 3 до 45 тыс.об/мин, надосадок в диализных мешках погружают в дистиллированную воду с непрерывным потоколом. Через 5-6 дней диализ прекращают. Раствор центрифугируют и добавляют в него равный объем насыщенного раствора ацетата (натрия) и после осаждения гликозаминогликанов промывают их 96% этанолом, высушивают. Количественный и качественный состав гликозаминогликанов делают по Временной Фармакопейной статье N 42-2678-96 на препарат "Сульфатированные гликозаминогликаны".

Для лучшего понимания способ поясняется примером конкретного исполнения.

Пример. 1. Из глаз свиней бритвой вырезают роговицы и помещают их в стеклянный сосуд, при достижении общей массы 1 кг их механически измельчают на ультраизмельчителе и после обработки ультразвуком в кавитационном режиме в течение 1 ч гомогенат проверяют на наличие в нем неразрушенных частиц.

Гидролиз роговиц приводят смесью ферментов 50 мл 0,01% раствора трипсина и 50 мл 0,125% раствора папаина, которую добавляют в гомогенат. Гидролиз ведут на водяной бане при 65oC в течение 4-5 ч. Через 5-6 ч после остывания гидролизат помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 30 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Нaдосадок сливают в диализные мешки и помещают их в сосуды с дистиллированной водой, которая подается непрерывно. Через 5-6 дней диализ прекращают. Раствор сливают в центрифужные стаканы и центрифугируют его при 30 тыс. об/мин в течение 30 мин.

К 1 л раствора добавляют 3 л насыщенного раствора этилацетата калия. Через 3-4 дня недосадок сливают, а осадок промывают 96% этанолом, высушивают, герметично упаковывают и стерилизуют.

Качественный и количественный анализ полученных гликозаминогликанов проводят по Временной Фармакопейной cтатье 42-2677-96.

С помощью данного способа экстрагируется от 95 до 99,5% всех гликозаминогликанов, содержащихся в конкретной ткани.

Похожие патенты RU2129871C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ 1999
  • Ларионов Е.В.
  • Кузьмина С.А.
  • Баньковская Е.О.
  • Иванов С.Ю.
RU2139715C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ 2000
  • Панасюк А.Ф.
  • Иванов С.Ю.
  • Ларионов Е.В.
  • Левин В.О.
  • Саващук Д.А.
RU2162331C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СТОМАТОЛОГИИ 1999
  • Панасюк А.Ф.
  • Ларионов Е.В.
  • Шехтман М.А.
  • Якобашвили Р.Д.
  • Саващук Д.А.
RU2155025C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ 2005
  • Саващук Дмитрий Алексеевич
  • Панасюк Андрей Федорович
RU2304441C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА "БИО-МАТРИКС ИМПЛАНТ I" ДЛЯ СТОМАТОЛОГИИ 1998
  • Иванов С.Ю.
  • Ларионов Е.В.
  • Новиков С.В.
  • Трегубов А.А.
  • Ахундов И.Ю.
  • Ломакин М.В.
  • Саващук Д.А.
  • Литвиненко А.Н.
RU2136298C1
ПОКРЫТИЕ ДЛЯ РАН 1999
  • Гаврилюк Б.К.
  • Ларионов Е.В.
  • Новиков С.В.
  • Трегубов А.А.
  • Кузьмина С.А.
  • Шехтман М.А.
  • Гришин Ю.В.
  • Саващук Д.А.
RU2138294C1
ПОКРЫТИЕ ДЛЯ РАН 1999
  • Гаврилюк Б.К.
  • Ларионов Е.В.
  • Трегубов А.А.
  • Новиков С.В.
  • Кузьмина С.А.
  • Шехтман М.А.
  • Гришин Ю.В.
  • Саващук Д.А.
RU2138296C1
ГЛАЗНЫЕ КАПЛИ "КОРНЕАЛОН-ПЛЮС" 1998
  • Ларионов Е.В.
  • Новиков С.В.
  • Трегубов А.А.
  • Саващук Д.А.
  • Шехтман М.А.
  • Гришин Ю.В.
  • Лозинская О.Л.
RU2135129C1
ГЛАЗНЫЕ КАПЛИ "КОРНЕАЛОН" 1998
  • Ларионов Е.В.
  • Новиков С.В.
  • Трегубов А.А.
  • Саващук Д.А.
  • Шехтман М.А.
  • Гришин Ю.В.
  • Лозинская О.Л.
RU2134559C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ 2004
  • Панасюк Андрей Федорович
  • Ларионов Евгений Викторович
RU2273486C1

Реферат патента 1999 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ

Изобретение относится к медицине. Сущность изобретения: ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролизуют смесью ферментов, кипятят в течение 5 - 30 мин, центрифугируют от 3 до 45 тыс.об/мин, диализируют в течение 5 - 6 дней, затем повторно центрифугируют и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов. Техническим результатом изобретения является получение конечной субстанции с высоким содержанием гликозаминогликанов, лишенной белка и других примесей.

Формула изобретения RU 2 129 871 C1

Способ получения гликозаминогликанов, включающий обработку биологической ткани ферментом с последующим диализом, отличающийся тем, что ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролизуют смесью ферментов, кипятят в течение 5 - 30 мин, центрифугируют от 3 до 45 тыс. об/мин диализируют в течение 5 - 6 дней, затем повторно центрифугируют и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1999 года RU2129871C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ РОГОВИЦЫ 1992
  • Багров Сергей Николаевич
  • Ларионов Евгений Викторович
  • Панасюк Андрей Федорович
RU2056851C1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА ИЗ ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ 1992
  • Васюков С.Е.
  • Кирьянов Н.А.
  • Лукина И.В.
  • Шульгина А.А.
  • Животова Г.П.
RU2061485C1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ ФИБРОЗНОГО ХРЯЩА 1994
  • Карякина Е.В.
RU2089201C1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
ЭЛЕКТРОД 2008
  • Росвалль Мангус
  • Эдвинссон Альберс Рольф
  • Хеденстедт Кристоффер
RU2487197C2
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
СВАРОЧНЫЙ ЭЛЕКТРОД 0
SU297455A1
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1
Флюс для очистки стального литья от пригара 1976
  • Бородянский Леонид Евгеньевич
  • Гурник Юлия Владимировна
  • Садомский Александр Львович
  • Померанец Анатолий Абрамович
  • Соколов Анатолий Евгеньевич
  • Юрченко Георгий Давыдович
  • Андерсон Валерий Августович
SU582330A1

RU 2 129 871 C1

Авторы

Ларионов Е.В.

Новиков С.В.

Трегубов А.А.

Саващук Д.А.

Даты

1999-05-10Публикация

1998-09-17Подача