СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ЭМБРИОИДОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЛЕВЗЕИ САФЛОРОВИДНОЙ Российский патент 1999 года по МПК A01H4/00 A01H3/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению эмбриоидов в культуре растительной ткани.

Объектом исследования служила культура ткани левзеи сафлоровидной. Левзея сафлоровидная - эндем Южной Сибири, культура ткани левзеи сафлоровидной является продуцентом ценных биологически активных веществ, в частности экдистероидов.

Эмбриоидной ткани левзеи сафлоровидной в культуре in vitro до настоящего времени не выращивалось. Авторами впервые изучены условия и разработан способ получения эмбриоидных тканей левзеи сафлоровидной в культуре in vitro.

Известен способ получения эмбриоидов диоскореи кавказской и балканской [Соматический эмбриогенез in vitro диоскореи кавказской и балканской и криосохранение их органогенных каллусных тканей. Л. Чулафич, Д. Грубинич, Р. Вуничич, А. А. Воякова, А.С.Попов. Физиология растений, 1994, т.41, N 6, с. 92-93.]. Выход из 1 г эмбриогенной ткани - 100-300.

Соматический эмбриогенез был индуцирован из суспензии клеток каллусной ткани диоскореи кавказской и балканской. Среда содержала 2,4 дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту, бензиламинопурин, минеральные компоненты по Мурасиге и Скугу с добавлением 3%-ной сахарозы. Эмбриоиды развивались в присутствии зеатина и абсцизовой кислоты. Культивирование проводили при температуре 25-26^oC, освещенности 3 клк, фотопериоде 16/8 час (день-ночь), относительной влажности воздуха 60-70%. Из одного грамма эмбриоидной ткани получали 100-300 соматических зародышей, культивирование проводили 8 недель.

Недостатком способа является низкий выход эмбриоидов.

Наиболее близким является способ получения эмбриоидов зизифуса [Соматический эмбриогенез и регенерация растений Zizyphus jujula Mill. in vitro. И. В. Митрофанов, О.В. Митрофанова, Д.К. Пандей Физиология растений. 1997 г. т.44., N 1, с. 108-114.

Зародыши зизифуса стерилизовали в 90% этиловом спирте, помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макро- и микросолей, содержащую 2,6-нафтилуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, глюкозу, агар. Культивирование проводят в термостате при температуре 20-30^oC и освещенности 2-3 клк. Число первичных зародышей определяют на 60-е сутки культивирования и достигает 14-15.

Недостатком способа является низкий выход эмбриоидов 14 - 15 при продолжительности культивирования 60 суток, который препятствует получению указанного ниже технического результата.

Изобретение решает задачу получения эмбриоидной ткани левзеи сафлоровидной.

Технический результат - ускоренное получение эмбриоидных тканей левзеи сафлоровидной.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе получения соматических эмбриоидов в культуре in vitro левзеи сафлоровидной, включающем приготовление питательной среды по Мурасиге и Скугу, получение и выращивание на ней каллусной ткани, особенность заключается в том, что в питательную среду вносят макроэлементы по Sierlis, гормоны 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 0,1-1 мг/л, 6-бензиламинопурина- 0,3-1,5 мг/л и гидролизата казеина 150 - 250 мг/л, витамины инозит - 500-5000 мг/л, тиамин солянокислый 2 - 3 мг/л, пиридоксин солянокислый 1-2 мг/л, ниацин солянокислый 1 -2 мг/л, культивирование проводят на рассеянном свету и досвечивают эмбриоидные ткани 30-90 минут ультрафиолетовым светом.

При использовании данных условий культивирования обеспечивается высокий уровень первичного и вторичного синтеза в культуре ткани левзеи сафлоровидной, что приводит к образованию большого количества эмбриоидов.

Способ осуществляется следующим образом. Культуру ткани левзеи сафлоровидной помещают на питательную среду с добавлением микроэлементов по Мурасиге и Скугу, макроэлементов по Sierlis, гормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 0,1-1 мг/л, 6-бензиламинопурина - 0,3-1,5 мг/л, гидролизата казеина 150 - 250 мг/л и витаминов: инозит -500- 5000 мг/л, тиамин солянокислый 2-3 мг/л, пиридоксин солянокислый 1-2 мг/л, ниацин солянокислый 1 -2 мг/л. Стерилизацию Среды проводят при 1 атм в течение 20 минут. Культивирование происходит на рассеянном свету при досвечивании в течение 30- 90 минут ультрафиолетовым светом.

Пример 1
Приготавливают питательную среду состава
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₄•7H₂ - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃ВО₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5H₂O - 25
Na₂MoO₄•2H₂O - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na₂EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: мг/л
Инозит - 500
Тиамин HCl - 2
Пиридоксин HCl - 1
Ниацин HCl - 1
Гормоны: - мг/л
2,4-Д - 0,1
6-БАП - 0,3
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 150
Культуру тканей левзеи сафлоровидной выращивают в культуральных сосудах на приготовленной питательной среде. Стерилизацию среды проводят при 1 атм в течение 20 минут. Культивирование проводят на свету в течение 40 суток с ультрафиолетовым досвечиванием в течение 30 минут в сутки.

При досвечивании ультрафиолетовым светом в течение 30 минут количество образовавшихся эмбриоидов составило 100-200 шт. на 1 грамм сырого каллуса.

Пример 2
Аналогично примеру 1 питательная среда содержит:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₄•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃ВО₃ - 6200
Kl - 830
CuSO₄•5H₂O - 25
Na₂MoO₄•2H₂O - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na₂EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 2500
Тиамин HCl - 2,5
Пиридоксин HCl - 1,5
Ниацин HCl - 1,5
Гормоны: - мг/л
2,4-Д - 0,5
6-БАП - 0,8
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 200
Культивирование проводят на свету в течение 40 суток с ультрафиолетовым досвечиванием в течение 60 минут в сутки. При досвечивании ультрафиолетовым светом в течение 60 минут количество образовавшихся эмбриоидов составило до 700 шт. на 1 грамм сырого каллуса.

Пример 3
Аналогично примеру 1 питательная среда содержит:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₄•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃BO₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5H₂O - 25
Na₂MoO₄•2H₂O - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na₂EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 5000
Тиамин HCI - 3
Пиридоксин HCI - 2
Ниацин HCI - 2
Гормоны: - мг/л
2,4-Д - 1
6-БАП - 1,53
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 250
Культивирование проводили на свету в течение 40 суток с ультрафиолетовым досвечиванием в течение 90 минут в сутки.

На 40-е сутки количество эмбриоидов на 1 грамм сырого каллуса составляет 20-25 на рассеянном свету.

При значении параметров меньше наименьших содержания гормонов и витаминов и времени экспонирования на ультрафиолетовом свету снижается выход соматических эмбриоидов.

При значении параметров больше наибольших уменьшается количество эмбриоидов при ультрафиолетовом досвечивании и не отмечено образования эмбриоидов без досвечивания.

Разработанный авторами новый способ позволяет круглогодично получать тысячи единиц посадочного материала в год независимо от сезона.

В связи с повышенным содержанием БАВ в эмбриоидных тканях можно использовать данную технологию для производства эмбриоидов с целью последующего извлечения экдистероидов из культивируемых тканей.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению эмбриоидов в культуре растительной ткани. Культуру ткани левзеи сафлоровидной помещают на питательную среду с добавлением микроэлементов по Мурасиге и Скугу, макроэлементов по Sierlis, гормонов, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 0,1 - 1 мг/л, 6-бензиламинопурина 0,3 - 1,5 мг/л, гидролизата казеина 150 - 250 мг/л и витаминов: инозит 500 - 5000 мг/л, тиамин солянокислый 2 - 3 мг/л, пиридоксин солянокислый 1 - 2 мг/л, ниацин солянокислый 1 - 2 мг/л. Среду стерилизуют. Культуру культивируют на рассеянном свету при досвечивании в течение 30 - 90 мин ультрафиолетовым светом. Данные условия культивирования ускоряют получение эмбриоидных тканей левзеи сафлоровидной.

Способ получения соматических эмбриоидов в культуре in vitro левзеи сафлоровидной, включающий приготовление питательной среды по Мурасиге и Скугу и Sierlis, содержащей витамины и гормоны, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и 6-бензиламинопурин, культирование каллусной ткани на рассеянном свету и досвечивание ультрафиолетовым светом, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно содержит гидролизат казеина в количестве 150-250 мг/л.