СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ МАКЛЕИ СЕРДЦЕВИДНОЙ (MACLEAYA CORDATA (WILLD) R.BR.) (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам размножения растений.

Известна разработка методов культивирования тканей копеечника забытого, включающая стерилизацию семян, проращивание их на питательной среде, включающей 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты до получения пробирочных растений (см.: Н.С.Ляпкова, Н.В.Хадеева, С.С.Шаин, А.Н.Майсурян. «Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro», журнал «Биотехнология», 1999, №1, с. 55-61).

Известна разработка способов культивирования эфедры односемянной, включающая посадку семян и органов на питательную среду, получение каллусной культуры, морфогенного каллуса и растений-регенерантов (см.: Н.А.Величко. «Культивирование эфедры односемянной в условиях in vitro», журнал «Биотехнология», 2002, №5, с. 59-64).

Однако указанными способами культивирования не удается получить каллусную культуру маклеи сердцевидной (М. cordata (willd.) R.Br.), поскольку выполнение предлагаемых стадий культивирования приводит к некрозу ткани экспланта маклеи сердцевидной.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ микроразмножения женьшеня. Способ включает вычленение цветочных бутонов, культивирование их на питательной среде до образования зрелых эмбриоидов, посадку их на питательную среду для полного укоренения, высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат. При этом цветочные бутоны вычленяют из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей в своем составе 0,5 мг/л - 6-БАП и 0,5 мг/л ГК₃, а для получения укорененных растений-регенерантов эмбриоиды пересаживают на питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макроэлементов дополнительно - 4,0 мг/л - 6-БАП и 0,5 мг/л ГК₃(см.: а.с.СССР №1824114, кл. А 01 Н 4/00, опубл. 30.06.93).

Однако при использовании данного способа так же происходит некроз ткани маклеи сердцевидной. Задачей предлагаемого способа является получение каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной (Macleaya cordata (willd.) R. Br.).

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа размножения маклеи сердцевидной, включающего вычленение эксплантов, культивирование их на питательных средах до образования побегов, последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, причем экспланты вычленяют из листьев или черешков, при этом культивирование проводят на модифицированных средах Мурасиге и Скуга, включающих аскорбиновую кислоту 1-3 мг/л и гидролизат казеина - 10 мг/л.

Сущность предлагаемого способа.

Способ состоит в том, что осуществляют получение эксплантов из исходного материала, стерилизацию их, введение в культуру на среде Мурасиге и Скуга, содержащей цитокинин кинетин и ауксин 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), а также аскорбиновую кислоту и гидролизат казеина, размножение каллусной культуры, получение побегов на твердой питательной среде с последующей высадкой в теплицу для адаптации к нестерильным условиям. При этом в качестве исходного материала используют листья или черешки растений. Введение эксплантов в культуру осуществляют на среде Мурасиге и Скуга при содержании кинетина 0,5-1 мг/л, 2,4-Д - 2-4 мг/л, при этом адаптацию полученных растений в нестерильных условиях проводят в теплицах.

Пример 1. Размножение маклеи сердцевидной из листовых эксплантов.

Способ осуществляют на листовых эксплантах. Заготовленные побеги с листьями не рекомендуется хранить продолжительное время, а приступать к посадке эксплантов. В течение этого короткого промежутка времени побеги хранят при температуре 3-4°С.

Из листьев делают высечки диаметром 1 см. Перед посадкой экспланты стерилизуют, для чего их помещают в стерильный бокс и на 30-40 секунд, заливают 70% этанолом, затем на 7-15 минут (в зависимости от возраста листьев) помещают в 8%-ный раствор хлорамина, который отмывают в течение 15 минут в трех порциях стерильной дистиллированной воды. После этого с помощью стерильных пинцета и скальпеля удаляют концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены.

Выделенные таким образом экспланты надсекают в нескольких местах скальпелем и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1), содержащую (мг/л): мезоинозит - 100; никотиновая кислота - 1,0; тиамин - 0,5; пиридоксин - 0,5; кинетин - 0,5; 2,4-Д - 2,0; 6-бензиламинопурин - 0,5; аскорбиновая кислота - 1,0; гидролизат казеина 10. рН среды после автоклавирования 5,8.

Сроки каллусообразования и константа каллусообразования, рассчитанная по формуле Э.Люка (Люк Э., Ягер М. Консерванты в пищевой промышленности. - Санкт-Петербург, 1998) показаны в таблицах 2 и 3.

К=ln(Z₀/Z_t)/t;

где К - константа скорости каллусобразования;

Z₀ - количество каллусов на начальном этапе каллусообразования;

Z_t - количество каллусов на завершающем этапе;

t - количество дней от начала до завершения каллусообразования.

Показатели таблиц свидетельствуют о том, что наилучший результат получают при использовании в технологии получения каллуса маклеи сердцевидной на листовых эксплантах 2-го варианта питательных сред (представленного в примере).

В дальнейшем для индукции каллусогенеза на листовых эксплантах используют среду Мурасиге и Скуга №1 (табл.4).

Пробирки с высаженными эксплантами помещают в культуральную темновую комнату при температуре воздуха 25-27°С.

Через 12-15 дней у 50% высаженных эксплантов наблюдается начало каллусообразования, а через 20-25 дней на всех эксплантах образуется каллус. По прошествии 2-3 недель во избежание старения каллуса его пассируют на модифицированную среду Мурасиге и Скуга с тем же содержанием макро-, микроэлементов и витаминов, но с уменьшенным содержанием фитогормонов (табл.1, №4), мг/л: кинетин - 0,2; 2,4-Д - 1,0. рН 5,7-5,8. Размер пассируемого каллуса 0,1×0,1 см. Через 5-7 дней после пассажа наблюдается начало роста перенесенного каллуса.

В течение месяца каллус переносится на регенерационную среду Potato II, содержащую, мг/л: тиамин - 1,0; картофельный экстракт 20% (табл.4).

Каллус на регенерационной среде выращивается при температуре воздуха 25-27°С, фотопериоде 16 часов, освещенности 4000-6000 лк, относительной влажности воздуха 70-75%. В течение 1-1,5 месяцев отмечается развитие побегов из каллуса.

По истечении этого времени приступают к пересадке растеньиц. Коэффициент составляет 1:20. В течение 1-2 месяцев укореняется 64% растений. Асептические растения размножают черенкованием: развившиеся растения разрезают, оставляя на каждом отрезке 1 лист и почку в его пазухе. Этот микрочеренок помещают в пробирку со средой Мурасиге и Скуга №3 (табл.4) включающую, мг/л: тиамин - 1,6; пиридоксин - 1,0; кинетин - 0,5; аскорбиновая кислота - 3,0; гиббереллин 2,0; аденин 0,5. Для наилучшего укоренения черенковых побегов в среду добавляют индолил-3-уксусную или индолил-3-масляную кислоту в концентрации 1-2 мг/л.

Перенос растений из пробирок осуществляется в рулоны, заполненные торфом. Для этого целлофановую ленту размером 15×40 см надрезают в нескольких местах по центру. Ленту заполняют торфом, слой которого равен 0,5-1 см. На субстрат выкладывают растения маклеи через каждые 4-5 см. Ленту сворачивают в рулон и устанавливают в поддон глубиной 2-3 см. Полив производят 1% раствором индолил-3-уксусной или индолил-3-масляной кислотой.

После того как происходит адаптация растений и появляется 1-2 новых листа, растения высаживают в вегетационные сосуды диаметром 9 см. При высоте растений 10-15 см их пересаживают в теплицу. Экстремальные условия исключают путем проветривания теплицы и поливов. Условия произрастания растений в теплице максимально приближают к естественным условиям. Высадку растений в открытый грунт производят при прогревании почвы до 12-14°С.

Пример 2. Размножение маклеи сердцевиной из черешковых эксплантов.

Способ осуществляют на черешковых эксплантах, отличающийся составом питательной средой для начального культивирования.

Из черешков маклеи сердцевидной делают высечки длиной 1 см. Перед посадкой экспланты стерилизуют, как описано в примере 1. У стерильных эксплантов удаляют концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены.

Выделенные таким образом экспланты помещают на питательную среды Мурасиге и Скуга (табл.1), содержащую (мг/л): мезо-инозит - 100; никотиновая кислота - 1,0; тиамин - 10,0; пиридоксин - 1,0; кинетин - 1,0; 2,4-Д - 4,0; аскорбиновая кислота - 3,0. рН среды после автоклавирования 5,8.

Сроки каллусообразования и константа каллусообразования, рассчитывали по формуле Э.Люка, приведенной в примере 1.

Показатели таблиц 2 и 3 свидетельствуют о том, что наилучший результат получают при использовании в технологии получения каллуса на черешковых эксплантов маклеи сердцевидной 3 варианта питательной среды.

В дальнейшем для индукции каллусогенеза на черешковых эксплантах используют среду Мурасиге и Скуга №2 (табл.4).

Последующие приемы культивирования каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной из черешковых эксплантов аналогичны приемам культивирования каллусной культуры из листовых эксплантов.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными способами имеет следующие преимущества:

- возможность получения каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной вне зависимости от погодных и климатических условий;

- использование для размножения вегетативных органов маклеи сердцевидной;

- низкая себестоимость.

Таблица 1
Состав питательных сред для образования первичного каллуса маклеи сердцевидной (минеральная основа МС), мг/лКомпоненты средыВарианты средМС+ vit В5+ 2,4-ДМС+ vit C + гидр. Казеина +2,4-Д + кинетинMC+vit B5+vit С+2,4-Д + кенетинМС+2,4-Д + кинетин12345МакросолиNH₄NO₃1650165016501650KNO₃1900190019001900КН₂PO₄170170170170CaCl₂·2Н₂O440440440440MgSO₄·7H₂0370   МикроэлементыMnSO₄·4H₂O22,322,322,322,3Н₃ВО₃6,26,26,26,2ZnSO₄·7H₂O8,68,68,68,6KI0,830,830,830,83CuSO₄·5H₂O0,0250,0250,0250,025Na₂MoO₄·2H₂O0,250,250,250,25CoCl₂·6H₂O0,0250,0250,0250,025ЖелезоFeSO₄·7H₂O27,827,827,827,8Na₂ЭДТА·2H₂O37,337,337,337,3Органические добавкиМезоинозит100,0100,0100,0100,0Никотиновая кислота1,01,01,00,5Тиамин HCl10,00,510,01,0Пиридоксин HCl1,00,51,00,5Аскорбиновая кислота0,51,03,00Гидролизат казеина-10--ФитогормоныКинетин00,51,00,26-БАП00,5002,4-Д2,02,04,02,0УглеводыСахароза20000200002000020000СубстратАгар-агар7000700070007000

Таблица 2
Сроки образования каллуса на питательных средахЭксплантыВарианты сред1234MC+vit В5+2,4-ДMC+vitC+гидр. казеина +2,4-Д + кинетинMC+vitB5+ vitC +2,4-Д +кинетинМС + 2,4-Д+ +кинетинКоличество днейЛистовые25-3512-2015-2520-35Черешковые20-3015-2510-2020-35

Таблица 3
Константа скорости каллусообразования, в зависимости от средыВид эксплантаВарианты сред1234MC+vit B5+2.4-ДMC+vit С + гидр. казеина +2.4-Д + кинетинMC+vit B5+vit C+ +2.4-Д+ +кинетинМС+ 2.4-Д+ +кинетинКонстанта скоростиЛистовые0,020,030,020,02Черешковые0,020,020,030,02

Таблица 4
Состав питательных сред, используемых в работеКомпоненты средыКоличество, мг/л (мл/л)Мурасиге и Скуга(1)Мурасиге и Скуга(2)Мурасиге и Скуга(3)Potato II12345МакросолиNH₄NO₃165016501320850KNO₃190019001520900КН₂PO₄170170136100CaCl₂·2H₂О440440352200MgSO₄·7H₂O370370296200МикроэлементыMnSO₄·4H₂O22,322,344,6-Н₃ВО₃6,26,212,4-ZnSO₄·7H₂O8,68,617,2-KI0,830,831,66-CuSO₄·5H₂O0,0250,0250,05-Na₂MoO₄·2H₂O0,250,250,5-CoCl₂·6H₂O0,0250,0250,05-ЖелезоFeSO₄·7H₂O27,827,827,827,8Na₂ЭДТА·2Н₂O37,337,337,337,3Органические добавкиМезоинозит100,0100,0100,0-Никотиновая кислота1,01,0--Тиамин HCl1,010,01,61,0Пиридоксин HCl1,01,01,0-Аскорбиновая кислота1,03,03,0-Аденин--0,5-ФитогормоныИУК (ИМК)--2,0-Кинетин0,51,00,5-6-БАП0,50,5--Гиббереллин (ГК₃)--2,0-2,4-Д2,04,0- УглеводыСахароза30000200002000030000СубстратАгар-агар7000700070007000Гидролизат казеина100---Картофельный экстракт---400рН после автоклавирования5,85,85,85,8

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений. Для получения каллусной культуры растения маклеи сердцевидной вычленяют экспланты из листьев или черешков растения и культивируют их на питательных средах до образования побегов. Листовые экспланты культивируют на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 1 мг/л аскорбиновой кислоты и 10 мг/л гидролизата казеина, а черешковые - на аналогичной среде, содержащей 3 мг/л аскорбиновой кислоты. Регенеранты высаживают на твердый субстрат. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ размножения маклеи сердцевидной in vitro, включающий вычленение эксплантов из листьев растения, культивирование их на питательных средах до образования побегов и последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, при этом культивирование листовых эксплантов проводят на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 1 мг/л аскорбиновой кислоты и 10 мг/л гидролизата казеина.2. Способ размножения маклеи сердцевидной in vitro, включающий вычленение эксплантов из черешков растений, культивирование их на питательных средах до образования побегов и последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, при этом культивирование черешковых эксплантов проводят на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 3 мг/л аскорбиновой кислоты.