СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕРБЕРИНА В ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ВАСИЛИСТНИКА МАЛОГО Российский патент 2000 года по МПК C12N5/04 C12P17/18 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.).

Объектом исследования служила культура ткани василистника малого. Культура клеток Thalictrum minus - одна из немногих культур, выделяющих вторичные продукты во внешнюю среду. Это делает ее привлекательным объектом для разработки технологии непрерывного культивирования с использованием иммобилизации клеток на инертном носителе. Существование среди рода Thalictrum таких сверхпродуктивных культур, как Thalictrum rugosum (синтезирует в 10 раз больше берберина, чем интактное растение), свидетельствует о перспективности биотехнологического подхода к растениям этого рода.

Авторами впервые изучены условия и разработан способ получения берберина в иммобилизованной на кубики пенополиуретана клеточной культуре василистника малого.

Известен способ получения берберина в суспензионной культуре Thalictrum rugosum. [Choi Jeong-Woo ЮЯ Korean J.Chem.Eng. - 1992 - 9 N 3. c 128-134].

Недостатком способа является то, что берберин накапливается в биомассе, а не выделяется в среду, что делает невозможным многократное использование биомассы.

Наиболее близким является способ получения берберина в клеточной культуре василистника малого, иммобилизованной на Ca-альгинатные шарики. [Kobayashi Y., Fucui H., Tabata M. Effect of oxigen supply on berberine production in cells of Thalictrum minus. // Plant cell repts 1989.vol. 8, N 4 - P 255-258].

Суспензионную культуру выращивают в колбах на качалке на среде для роста, содержащей 0,2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, с минеральной основой по Мурасиге-Скугу (МС). На 14 сутки культивирования осуществляют иммобилизацию на Ca-альгинатные шарики и переносят на продукционную среду, содержащую a-нафтилуксусную кислоту в концентрации 100 мкм (18 мг/л) и 6-бензиламинопурин в концентрации 10 мкм (5 мг/л). Выход берберина в культуральной жидкости составляет от 0,3 г/л до 0,51 г/л в зависимости от размера Ca-альгинатных шариков.

Недостатком способа является низкий выход берберина. При этом авторы указывают на высокую кислородную зависимость процесса синтеза. При иммобилизации в Ca-альгинат клетки испытывают дефицит кислорода. С уменьшением размера шариков увеличивается выход берберина.

Изобретение решает задачу повышения выхода берберина в иммобилизованной на пенополиуретан клеточной биомассе. Благодаря иммобилизации в пористый матрикс улучшаются условия аэрации клеток. Модифицированный гормональный и витаминный состав среды также повышает интенсивность процессов синтеза.

Технический результат - высокий выход берберина и возможность многократного использования дорогостоящей биомассы.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения берберина иммобилизованной клеточной культуре василистника малого путем приготовления ростовой питательной среды по Мурасиге-Скугу, культивирование, иммобилизацию с последующим переносом на продукционную среду по Мурасиге-Скугу, согласно изобретению иммобилизацию суспензионной культуры проводят на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток, при этом ростовая и продукционная питательные среды дополнительно содержат: ростовая питательная среда - 2,4- дихлорфенокси-уксусную кислоту в количестве 0,1-1 мг/л, продукционная питательная среда - 6-бензиламинопурин в количестве 0,5-1 мг/л, а содержание пиридоксина солянокислого в обеих средах 3-7 мг/л.

При получении берберина осуществляется двухстадийное культивирование иммобилизованной на пенополиуретан биомассы со сменой сред, содержащих гормоны и витамины в нашей модификации. При использовании данных условий обеспечивается высокая скорость роста на первом этапе культивирования и высокий уровень синтеза на втором этапе, что повышает продуктивность культуры.

Способ осуществляется следующим образом. Суспензионную культуру василистника малого помещают на питательную среду с минеральной основой по МС, содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (0,1-1 мг/л), сахарозу (30000 мг/л), гидролизат казеина (150-250мг/л), инозит (100-500мг/л), тиамин солянокислый (0,5-1,5мг/л), пиридоксин солянокислый (3-7мг/л), ниацин солянокислый (0,5- 1,5мг/л). Стерилизацию среды проводят при 9,81•10⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм³ из расчета 150-300 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования на ростовой среде кубики с клетками отмывали на среде без гормонов и сахарозы в течение суток на качалке, а затем помещали их в продукционную среду с минеральной основой по МС, содержащую а-нафтилуксусную кислоту (10-20мг/л), 6-бензиламинопурин (0,5-1мг/л), сахарозу (30000мг/л), гидролизат казеина (150-250мг/л), инозит (100- 500мг/л), тиамин солянокислый (0,5- 1,5мг/л), пиридоксин солянокислый (3-7мг/л), ниацин солянокислый (0,5-1,5мг/л). Стерилизацию среды проводят при 9,81•10⁴ Па в течение 20 мин. Выделение берберина происходит в культуральную среду.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиски по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату, отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".

Для проверки соответствия заявленного изобретения условию "изобретательский уровень" заявитель провел дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявленного способа. Результаты показали, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку из уровня техники, определенного заявителем, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявленного изобретения преобразований для достижения технического результата.

Это позволяет сделать вывод о соответствии условию "изобретательский уровень".

Пример 1.

Для первого этапа культивирования приготавливают среду состава:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₂•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃BO₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5H₂O - 25
Na₂MoO₄•2H₂O - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na2EDTA•2H₂O (этилендиаминтетрауксусная кислота - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 100
Тиамин C1 - 0,5
Пиридоксин C1 - 3
Ниацин C1 - 0,5
Гормоны: - мг/л
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,1
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30 000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 150
Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Стерилизацию среды проводят при 9,81•10⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свете. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм² из расчета 150 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:
Макроэлементы: - мг/л
KMO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂0 - 330
MgS0₄•7H₂0 - 370
KH₂P0₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnS0₄•4Н₂0 - 22300
ZnS0₄•7H₂0 - 8600
H₃ВО₃ - 6200
KI - 830
CuS0₄•5Н₂0 - 25
Na₂MoO₄•2H₂0 - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeS0₄•7Н₂0 - 27850
Na2EDTA•2Н₂0 - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 100
Тиамин C1 - 0,5
Пиридоксин C1 - 3
Ниацин C1 - 0,5
Гормоны: - мг/л
α-Нафтилуксусная кислота - 10
6-Бензиламинопурин - 0,5
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 150
Культивирование на второй стадии проводится 14 сут. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0,58 г/л.

Пример 2. Аналогично примеру 1 питательная среда содержит:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2Н₂0 - 330
MgS0₄•7Н₂0 - 370
KH₂P0₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃BO₃ - 6200
К1 - 830
CuSO₄•5Н₂O - 25
Na₂MoO₄•2Н₂O - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na2EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 200
Тиамин C1 - 1
Пиридоксин C1 - 5
Ниацин C1 - 1
Гормоны: - мг/л
2,4-Д - 0,5
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 200
Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Cтерилизацию среды проводят при 9,81•10⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1 мм³ из расчета 200 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₄•7Н₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4Н₂O - 22300
ZnSO₄•7Н₂O - 8600
H₃ВО₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5Н₂O - 25
Na₂MoO₄•2Н₂О - 250
CoCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na2EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 250
Тиамин C1 - 1
Пиридоксин C1 - 5
Ниацин C1 - 1
Гормоны: - мг/л
α-Нафтилуксусная кислота - 15
6-Бензиламинопурин - 1
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 200
Культивирование на второй стадии проводится 14 суток. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0, 75 г/л.

Пример 3.

Питательная среда для первой стадии культивирования содержит:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgSO₄•7Н₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnS0₄•4Н₂O - 22300
ZnSO₄•7H₂O - 8600
H₃ВО₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5Н₂O - 25
Na₂MoO₄•2Н₂O - 250
CoCl₂•6Н₂O - 25
FeSO₄•7H₂O - 27850
Na2EDTA•2Н₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 500
Тиамин C1 - 1,5
Пиридоксин C1 - 7
Ниацин C1 - 1,5
Гормоны: - мг/л
2,4-Д - 1
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30 000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 250
Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Стерилизацию среды проводят при 9,81•10⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм³ из расчета 300 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:
Макроэлементы: - мг/л
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂•2H₂O - 330
MgS0₄•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микроэлементы: - мг/л
MnSO₄•4H₂O - 22300
ZnSO₄•7Н₂O - 8600
H₃BO₃ - 6200
KI - 830
CuSO₄•5Н₂О - 25
Na₂MoO₄•2H₂O - 250
COCl₂•6H₂O - 25
FeSO₄•7Н₂O - 27850
Na2EDTA•2H₂O - 37250
Витамины: - мг/л
Инозит - 500
Тиамин C1 - 1,5
Пиридоксин C1 - 7
Ниацин C1 - 1,5
Гормоны: - мг/л
α-Нафтилуксусная кислота - 20
6-Бензиламинопурин - 1,5
Углеводы: - мг/л
Сахароза - 30000
Аминокислотный компонент: - мг/л
Гидролизат казеина - 250
Культивирование на второй стадии проводится 14 суток. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0,61 г/л.

При значении параметров меньше или больше приведенных концентраций гормонов и витаминов снижается выход берберина. Содержание берберина в среде культивирования определялось спектрофотометрическим экспресс-методом.

Для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к получению берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.). Способ включает иммобилизацию суспензионной культуры на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток. При этом ростовая и продукционная питательные среды дополнительно содержат: ростовая питательная среда - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в количестве 0,1-1 мг/л, продукционная питательная среда - 6-бензиламинопурин в количестве 0,5 - 1 мг/л. Содержание пиридоксина солянокислого в обеих средах 3 - 7 мг/л. Способ позволяет повысить выход берберина, а также дает возможность многократного использования дорогостоящей биомассы.

Способ получения берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого, включающий приготовление ростовой питательной среды по Мурасиге-Скугу, культивирование, иммобилизацию с последующим переносом на продукционную среду по Мурасиге-Скугу, отличающийся тем, что иммобилизацию суспензионной культуры проводят на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток, при этом ростовая и продукционная питательные среды дополнительно содержат, мг/л:
Ростовая питательная среда - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,1 - 1
Продукционная питательная среда - 6-бензиламинопурин - 0,5 - 1
Пиридоксин солянокислый в обеих средах - 3 - 7