АГЕНТ, УСКОРЯЮЩИЙ РАЗРАСТАНИЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1999 года по МПК A61K31/165 A61K31/175 

Изобретение касается как нового применения производных бета-нафтохинона, так и их солей.

Специальный патент на лекарства 924 М описывает применение в качестве лекарств производных бета-нафтохинона. По этому патенту эти производные представлены как обладающие гемостатическими свойствами и витаминными свойствами.

Известно, что эндотелий образован однослойной пленкой клеток мезодермального происхождения, которая покрывает внутренность всей сосудистой системы. Следовательно, он образует поверхность раздела между кровью и прилегающими тканями. Эта локализация придает ему главную роль при сохранении целостности сосудов и крови.

Отслоение однослойной пленки эндотелиальных клеток, не тромбогенных, ведет к экспозиции тромбогенного подэндотелия /прилипание тромбоцитов и лейкоцитов/. Экспозиция подэндотелия является патологическим состоянием, которое наблюдается при некоторых хирургических операциях: эмболэктомий, ангиопластики, эндартериактомии и пересадки сосудистых протезов или в других случаях медицинской патологии /атеросклероз, васкулиты/. Во всех этих случаях ставится одна общая задача, а именно быстрое восстановление эндотелиальной поверхности, которая была бы цельной и функциональной. Недавно было доказано, что факторы нарастания полипептидов /FGF: fibroblast growth factor; PDGF: platelet derived growth factor или EGF: epidermal growth factor/ играют важную роль при поправке сосудистых или кожных повреждений: язв, струпов и ожогов.

Продолжая изучения упомянутых выше производных бета-нафтохинона, заявитель нашел совершенно неожиданно, что эти производные проявляют замечательную активность, позволяющую ускорить разрастание эндотелиальных клеток и тормозить структурные и индуцированные NO-синтазы.

Таким образом, данная заявка касается нового применения производных бета-нафтохинона общей формулы I

где R - группа формулы -NH-CO-CH₃, или группа -NH-CO-NH₂, или гидроксил, а также их аддитивных солей с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами для получения лекарства, позволяющего ускорить разрастание эндотелиальных клеток и тормозить NO-синтазы.

Аддитивными солями с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами могут быть, например, соли, образованные с соляной кислотой, бромистым водородом, йодистым водородом, азотной, серной, фосфорной, пропионовой, муравьиной, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, винной, лимонной, щавелевой, глиоксалевой, аспарагиновой кислотами, алкансульфокислотами, такими как метан-этан-сульфокислоты и арилсульфокислотами, такими как бензосульфокислота.

Среди производных бета-нафтохинона общей формулы I, в частности могут быть названы:
- продукт формулы I, где R - группа формулы -NH-CO-NH₂, а также его аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами;
- продукт формулы I, где R - группа формулы -NH-CO-CH₃, а также его аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами;
- продукт формулы I, где R - окси, а также его аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами.

Среди предназначенных продуктов изобретения, употребляемых для получения лекарства, позволяющего ускорить разрастание эндотелиальных клеток и тормозить NO-синтазы, особенно интересен 2-семикарбазон 1,2-нафтохинона, известный под международным названием нафтазона. В экспериментальной части этот продукт называется DCI /общее международное название/.

Вследствие этих замечательных свойств, позволяющих ускорить разрастание эндотелиальных клеток и тормозить NO-синтазы, иллюстрированных в опытной части, производные бета-нафтохинона формулы I, а также их аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами, могут употребляться в сосудистой области, например, в профилактике гипотензии септического шока, атерома, рестенозов артерий /после ангиопластии/, при защите сосудов, при сосудистых заболеваниях и пересадках, при мозговой защите во время удара или при лечении боли, в качестве лекарства против отеков, уменьшая проницаемость капилляров, при лечении мигрени, закрытием мозга от артериовенозных отклонений, при развитии болезни, вызывающей микрокровообращение /в офтальмологии, диабетологии/, также как и в васкуляризации из-за лекарств/ и во всех процессах рубцевания и поправок ткани.

Обычной дозой, изменяющейся в зависимости от употребляемого продукта, лечимого больного и самой болезни, может быть, например, доза от 1 мг до 100 мг в день, вводимая через рот или впрыскиванием.

Изобретение также касается фармацевтических составов, которые содержат в качестве действующего начала по меньшей мере одно из определенных выше соединений.

Эти фармацевтические составы могут быть, например, твердыми или жидкими и выпускаться в фармацевтических формах, обычно употребляемых в медицине, как например, таблетки, драже, желулы, гранулы, свечки, препараты для впрыскивания, капсулы; они получаются обычными способами. Одно или несколько действующих начал могут быть введены в экспицианты, обычно употребляемые в фармацевтических составах, такие как тальк, гуммиарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, масло какао, водные или неводные носители, животные или растительные жиры, различные смачиватели, диспергаторы, эмульгаторы, консерванты.

Способы получения производных бета-нафтохинона формулы I, а также их солей, были описаны в технической литературе. В частности, можно привести способы, описанные в специальном патенте на лекарство 924 М, или во французском патенте 2 103 504.

Ниже будут даны примеры неограничивающего характера, фармацевтических составов, которые могут быть получены согласно изобретению.

Пример 1. Были получены таблетки, отвечающие следующей формуле, мг:
Нафтазон - 10
Эксципиент в достаточном количестве для одной законченной таблетки - 150
(Пример эксципиента: лактоза, крахмал, тальк, стеарат магния).

Пример 2. Был получен раствор для инъекций, отвечающий следующей формуле, мг:
Нафтазон - 5
Стерильный водный эксципиент в достаточном количестве - 2
Пример. Вводят 8,6 г нафтазона в 200 мл уксусного ангидрида. После нагревания при 140^oC в течение 10 часов, а затем охлаждения, фильтрации, экстрагирования осадка хлороформом, упаривания досуха, поглощения этанолом, обработки активированным углем, фильтрации и медленной кристаллизации, получают 5,1 г продукта, отвечающего формуле I, с R = -NH-CO-CH₃ /микрокристаллический порошок охро-желтого цвета, Т_пл. = 137 - 138^oC/.

Фармакологическое исследование.

I. Исследование в пробирке разрастания эндотелиальных клеток человека подкожной вены нижней конечности.

Мы оценили митогенные свойства нафтазона на эндотелиальных клетках подкожной вены нижней конечности в культуре в стандартных условиях.

При концентрациях, находящихся между 10^-5 М и 10^-7 М, нафтазон ускоряет разрастание эндотелиальных клеток, обсемененных с низкой плотностью, при максимальном факторе 2 по сравнению с контрольной пробой /без нафтазона/.

В месте слияния клеточная плотность остается немного увеличенной /около 20%/. Зато в присутствии оптимальной концентрации сыворотки разница клеточной плотности между контролем и пробой, содержащей нафтазон, смягчается.

В заключение в условиях опыта эффект нафтазона остается в общем ниже или равным тому, который введен FGF_s, но при слиянии плотность клеток в присутствии факторов FGF_s явно выше, чем та, которая получена с нафтазоном, в сравнении с контрольной пробой.

II. Изучение торможения структурной NO-синтазы сосудистых эндотелиальных клеток.

Нафтазон являлся предметом исследований, проведенных на кольцах брюшной аорты /3 - 4 мм длины/ крысы CD /200 - 250 г, Charles River, Франция/ и бедренной вены кролика Новой Зеландии /2 - 2,5 кг, Charles River, Франция/.

Кольца вводятся в камеру органов /25 мл, Фимеп, Франция/ в растворе Кребс-Рингера. Этот раствор все время тонометрируется газовой смесью, содержащей 95% O₂ - 5% CO₂, при pH 7,40 и с термостатом в 37^oC. Изометрическая сила, развитая кольцами, измеряется датчиками напряжения /Phymep, Франция/. Кольца доводятся до оптимальной точки отношения напряжение - длина повторяющимися стимуляциями при помощи KC1 40 мМ. Фармакологические исследования ведутся после прополаскивания и стадии равновесия в 45 минут. Поскольку фармакологический ответ сосуда изучают без эндотелия, то его удаляют трением внутри сосуда при помощи хирургического пациента. Отсутствие эндотелия проверяется по отсутствию расслабления сосуда, наведенного ACh 10^-6 М, после сокращения при помощи NAD 10^-7 М. Сокращения выражены в % от максимального сокращения с KC1 60 мМ, а ослабления выражены в % от сокращения с NAD 10^-5 М или PGF2^α 10^-7 М.

Были отмечены следующие фармакологические свойства:
1 - нафтазон /10^-6 М - 10^-4 М/ значительно увеличивает базальный тонус аортовых колец крысы и феморальной вены кролика;
2 - нафтазон /10^-6 М - 10^-4 М/ потенциализирует сокращения, полученные с NAD /10^-9 М - 10^-5 М/ и с 5HT /10^-9 М - 10^-5 М/ значительным образом и зависимой дозой на аорте крысы. Эта потенциализация исчезает при отсутствии эндотелия;
3 - на аортовых кольцах, сокращенных при помощи NAD /10^-5 М/, нафтазон /10^-6 М - 10^-4 М/ тормозит значительным образом и зависимой дозой, расслабление с ACh /10^-9 М - 10^-5 М/.

Торможение достигает 60 - 80% с нафтазоном /10^-5 М/ при расслаблении, полученном с ACh /10^-5 М/. Это торможение сравнимо по кинетике и амплитуде, с торможением, полученным с N ω-нитро-L-аргинином /10^-6 М/ /сильным ингибитором NO-синтаз/.

На аортовых кольцах, сокращенных при помощи PGF2^α /2 • 10^-6 М/ в присутствии индометацина /10^-5 М/ и кетансерина /10^-5 М/, нафтазон /10^-6 М - 10^-4 М/ тормозит расслабление, полученное с 5HT /10^-9 М - 10^-5 М/, значительным образом и зависимой дозой /10^-6 М - 10^-4 М/;
4 - на аортовых кольцах, сокращенных при помощи NAD /10^-7 М/ или с PGF2^α /2 • 10^-6 М/ в присутствии индометацина /10^-5 М/, нафтазон тормозит расслабление, полученное с кальций ионофором А23187 /10^-9 М - 10^-6 М/, и это значительным образом и зависимой дозой /10^-6 М - 10^-4 М/;
5 - торможение зависимого расслабления эндотелия при ACh, 5HT и А23187, полученное с нафтазоном /10^-5 М/ снимается полностью L-аргинином /9 • 10^-4 М/;
6 - нафтазон /10^-5 М/ тормозит значительным образом гипореактивность по отношению к NAD /10^-9 М - 10^-5 М/, полученную после 3 часов инкубации аортовых колец крысы, в присутствии липополисахаридов E. coli 011B4 /10 ммк/мл/. Этот эффект сравним с тем, который получен с N ω-нитро-L-аргинином /10^-5 М/;
7 - нафтазон /10^-5 М/ потенциализирует сокращение при NAD /10^-9 М - 10^-5 М/, полученное на кольцах бедренной вены кролика и тормозит расслабление с ACh /10^-9 М - 10^-5 М/.

Таким образом, увеличение основного тонуса, потенциализация вазоактивных эффектов от норадреналина, серотонина, торможение зависимых расслаблений эндотелия от ацетилхолина, серотонина, и кальцийионофора А23187, снятие торможения зависимых расслаблений эндотелия L-аргинином, торможение гипореактивности в присутствии норадреналина, наведенной микробным эндотоксином, классифицируют нафтазон в качестве ингибитора структурной NO-синтазы и индуцированной NO-синтазы.

Предложено новое средство, ускоряющее разрастание эндотелиальных клеток и тормозящее NO-синтазы - производные бетанафтохинона формулы I

где R - группировка -NН-СО-NH₂ или -NН-СО-СН₃, или гидроксил,
и их солей. Изобретение расширяет арсенал средств с указанным назначением и является ингибитором структурной NO-синтазы и индуцированной NO-синтазы. 4 з.п. ф-лы.

1. Применение производных бета-нафтохинона общей формулы I

где R - группа формулы -NH-CO-NH₂ или группа формулы -NH-CO-CH₃, или гидроксил,
а также их аддитивных солей с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами в качестве агента, позволяющего ускорить разрастание эндотелиальных клеток и тормозить NO-синтазы. 2. Применение по п.1, в котором производным бета-нафтохинона является продукт общей формулы I, где R - группа формулы -NH-CO-NH₂, а также его аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами. 3. Применение по п.1, в котором производным бета-нафтохинона является продукт общей формулы I, где R - группа формулы -NH-CO-CH₃, а также его аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми минеральными или органическими кислотами. 4. Применение по п.1, в котором производным бета-нафтохинона является продукт общей формулы I, где R - гидрокси, а также его аддитивные соли с фармацевтическими приемлемыми органическими или минеральными кислотами. 5. Применение по п.1 или 2, в котором производным бета-нафтохинона является 2-семикарбазон 1,2-нафтохинона.