ШТАММ БАКТЕРИИ LACTOBACILLUS FERMENTUM 90-TS-4(21), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭУБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ГИНЕКОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма L.fermentum 90-TS-4, который может быть использован для получения эубиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов.

Эубиотические препараты на основе лактобактерий широко применяются для коррекции дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы [Кашковская Н.В. и др. в кн. "Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция". Горький, 1988; Квасников Е.И., Нестеренко О.А. "Молочнокислые бактерии и пути их использования". М., 1975, с. 266-272]. В гинекологической практике возникновение дисбактериоза влагалища характеризуется резким снижением количества лактофлоры и бурным развитием условно- патогенных микроорганизмов, что приводит к развитию вагинозов и вагинитов, в том числе и кандидозов. В настоящее время вагинозы являются острой проблемой в гинекологии, в связи с большой частотой встречаемости в обшей популяции женщин до 65% и трудностью в лечении. Основным средством восстановления нормальной микрофлоры в этих случаях является применение эубиотических препаратов [Кира Е.Ф. с соавт. "Применение эубиотиков для лечения бактериального вагиноза". Ж. антиб. и химиотер., 1994, т.39, N 2-3, с.31-35].

В настоящее время в России наиболее широко применяются препараты лактобактерин (на основе L.fermentum 90-TS-4 и L.plantarum 8RA3) и ацилакт с использованием L.addophilus. [Анкирская А.С. "Бактериальный вагиноз". Ж. акуш. и гинекол. , 1995, N 6, с. 13-16]. Изначально эти препараты были предложены для лечения дисбактериоза кишечника, в дальнейшем их стали использовать в гинекологии. В практической гинекологии использование того или иного эубиотического препарата, как правило, осуществляется эмпирически.

Из всех эубиотиков, применяемых в гинекологии наиболее целесообразно использование лактобактерина на основе штамма L.fermentum 90-TS-4, поскольку этот штамм исходно выделен из влагалища женщины, обладает высокой активностью кислотообразования и способностью продуцировать лизоцим [Ленцнер А.А. с соавт. "О способности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим". Ж. микробиол., 1975, N 8, с. 77-81].

Однако при исследовании адгезивных свойств этот штамм был отнесен к среднеадгезивным [Брилис В. И. с соавт. "Адгезивные и гемагглютинационные свойства лактобацилл". Ж. микробиол., 1982, N 9, с. 75-78].

Задачей изобретения является создание варианта производного штамму L. fermentum 90-TS-4, который обладает высокими адгезивными свойствами к вагинальному эпителию.

Технический результат состоит в получении варианта штамма L.fermentum 90-TS-4 с выраженной экспрессией адгезина, сходного с таковым у C.albicans.

Указанная цель достигается путем селекции варианта штамма L.fermentum 90-TS-4 по признаку агглютинации конканавалином-А из исходной популяции.

Штамм L. fermentum 90-TS-4(21) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером Б-7573.

В основе патентуемого варианта штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что конканавалин-А-зависимая субпопуляция отличается от конканавалин-А-независимой по активности адгезии на вагинальном эпителии, кроме того, экспрессия конканавалин-А-зависимого адгезина у выделенного варианта коррелирует с агглютинацией иммунной сывороткой.

Сущность патентуемого решения. Известно, что некоторые лактобактерии агглютинируются в присутствии конканавалина-А. Этот признак характеризует наличие на их поверхности адгезина, сходного с аналогичным у C.albicans. [В кн. "Адгезины микроорганизмов". М., 1985]. Основываясь на этих данных, после рассева музейного штамма L. fermentum 90-TS-4 проводился отбор колоний по признаку агглютинации с конканавалином-А. Отобранные колонии кон-А-позитивных клонов оценивались в развернутой реакции агглютинации с конканавалином-А. Отобраны варианты, агглютинирующиеся с конканавалином-А в концентрации не ниже 10 мкг/мл. Из них отбирались культуры, агглютинирующиеся иммунной сывороткой в титре не ниже 1:2560. Из всех клонов был отобран вариант L. fermentum 90-TS-4(21), который агглютинируется конканавалином-А в концентрации 7 мкг/мл и иммунной сывороткой в титре 1:2560. Адгезивные свойства полученного варианта оценивали в модели адгезии на влагалищных эпителиальных клетках по следующей методике:
1. Эпителиальные клетки трижды отмывали 10 мл физиологического раствора, интенсивно ресуспендируя и центрифугируя при 1000 об/мин в течение 2 мин. Из отмытых клеток готовили стандартную взвесь 10⁴ кл/мл.

2. Суточную культуру лактобактерий трижды отмывали 5 мл физиологического раствора и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Готовили взвесь лактобактерий соответствующую 5 ед. по оптическому стандарту мутности.

3. К 1 мл взвеси эпителиальных клеток добавляли 1 мл взвеси лактобактерий и инкубировали 30 мин при 37^oC на встряхивателе.

4. После инкубации клетки трижды отмывали 10 мл физиологического раствора и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин.

5. Готовили мазки, окрашенные генциановым фиолетовым в течение 1 мин и подсчитывали количество адгезировавшихся лактобактерий на 50 эпителиальных клетках.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфология. Неподвижные грамположительные палочки длиной от 0,7 до 5 мкм, располагающиеся беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками.

Культурально-физиологические признаки.

1. На плотной среде МРС-4 через 48 ч образуют выпуклые, беловатые, полупрозрачные с неровным краем колонии в диаметре 1-2 мм.

2. На жидкой среде МРС-1 растет в виде гомогенного белого осадка на дне пробирки, возможно образование равномерной мути.

3. Укол в МРС агаре дает хороший рост по всему уколу.

4. Отношение к температуре и pH среды. Оптимум роста при 37^oС и pH среды 6,4.

Биохимические свойства.

Хорошо ферментирует глюкозу с образованием кислоты и газа, разлагает мальтозу, лактозу, галактозу, мелибиозу, слабо сахарозу и маннозу. Сорбит, целлобиозу, рамнозу, салицин и маннит не сбраживает.

Серологические свойства.

Штамм в развернутой реакции агглютинации агглютинируется конканавалином-А в концентрации не менее 7 мкг/мл и иммунной сывороткой, полученной на штамм L.fermentum 90-TS-4 в титре не ниже 1:2560.

По своим морфологическим, культурально-физиологическим и биохимическим свойствам штамм L.fermentum 90-TS-4(21) не отличается от исходного музейного штамма L.fermentum 90-TS-4.

Изобретение иллюстрируется примером, который характеризует адгезивные свойства штамма.

Пример 1. Изучение адгезивных свойств разных субпопуляций штамма L.fermentum 90-TS-4 в реакции агглютинации с конканавалином-А и иммунной сывороткой.

Развернутая реакция агглютинации ставилась в микробиологических планшетах для серологических реакций по стандартной методике с суточными культурами, выращенными на МРС-1. Исследуемые культуры: музейный вариант штамма L. fermentum 90-TS-4, конканавалин-А-позитивный вариант L.fermentum 90-TS-4(21) и конканавалин-А-независимый L.fermentum 90-TS-4(10). Результаты приведены в таблице 1.

Пример 2. Изучение адгезивных свойств разных вариантов штамма L.fermentum 90-TS-4 на клетках, влагалищного эпителия.

Исследование адгезии на влагалищных эпителиальных клетках проводили по методике, описанной выше. В качестве исследуемых штаммов взяты кон-А-зависимый и кон-А-независимый варианты штамма L.fermentum 90-TS-4. Результаты приведены в таблице 2.

Приведенные в таблице 2 данные показывают, что кон-А-зависимый вариант L.fermentum 90-TS-4(21) является более высокоадгезивным.

Промышленная применимость. Свойства штамма L.fermentum 90-TS-4(21) стабильны и не меняются при хранении и в процессе культивирования. При изучении динамики роста исходного штамма и предлагаемого варианта показано, что L. fermentum 90-TS-4(21) является более продуктивным: обладает высокой скоростью роста с большим накоплением биомассы по сравнению с исходным музейным вариантом.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, гинекологической практике для лечения дисбактериозов. Из штамма Lactobacillus fermentum 90-Ts-4 - продуцента эубиотического препарата лактобактерина отобран вариант, агглютинирующийся в присутствии конканавалина-А и обладающий высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию. Признаки являются стабильными. Штамм обладает более высокой скоростью роста, чем исходный штамм, что является позитивным моментом для производства. 2 табл.

Штамм бактерии Lactobacillus fermentum 90-Ts-4(21) ВКПМ Б-7573, используемый для получения эубиотического препарата для применения в гинекологической практике.