СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИАДГЕЗИВНОГО КОМПОНЕНТА НА ОСНОВЕ ЛЕКТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ СТРУКТУР Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A61K31/715 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для лечения дисбактериозов.

Известно, что положительный эффект от пробиотиков опосредован прямой или непрямой модуляцией эндогенной флоры и иммунной системы. В этом случае необходимым условием является непосредственный контакт пробиотической культуры с активными эпителиоцитами терминальной ниши макроорганизма.

Описано для использования в гинекологической практике средство для лечения дисбактериозов. Из штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 - продуцента эубиотического препарата лактобактерина отобран вариант, агглютинирующийся в присутствии конканавалина-А (конА) и обладающий высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию (RU 2133272 C1, 20.07.1999). Однако эффективность такой композиции невысока вследствие недостаточной концентрации и чистоты лектинсвязывающих структур. Известны препараты для уменьшения и/или блокирования адгезии патогенных веществ и организмов на основе антиадгезивных углеводов со структурным звеном уроновой кислоты на одном из его концов (RU 2267324 С2, 10.01.2006), которые расширяют арсенал антипатогенных средств для эукариотических клеток, однако они сложны в приготовлении и не являются пробиотиками.

Наиболее близким к патентуемому способу является способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, состоящий в культивировании штамма лактобактерий с получением супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта (Henriksson A., Szewzyk R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fermentum 104 // App. and Environmental Microbiol. - 1991 - p.499-502).

Задачей изобретения является получение антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур из культуральной жидкости штамма L. fermentum 90-TS-4 (21), с целью его использования в производстве многокомпонентных пробиотических препаратов.

Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции предусматривает культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта.

Способ отличается тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1% раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10^-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре 37(±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок, и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.

Способ может характеризоваться тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об/мин в течение 14-16 мин при температуре 20(±0,05)°С.

Способ может характеризоваться и тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре 20(±0,05)°С в течение 24-48 ч, а также тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.

Способ может характеризоваться также тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0(±0,05) в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.

Способ может характеризоваться, кроме того, тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре 20 (±0,05)°С.

Технический результат изобретения - повышение модулирующей активности субстанции в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида E.coli и стабильности свойств субстанции.

В основе патентуемого способа получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур лежат следующие положения. В результате собственных экспериментов авторами показано, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающиеся с поверхности лактобактерии специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектино-подобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой. Выделение слущивающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры, и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствии биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной флоры (см., "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины" стр.192-195, №2, том 145, 2008; "Вестник РУДН" стр.10-13, №2, серия медицина, 2007).

Нами впервые показано, что для лактобактерии характерна вариабельность экспрессии лектинсвязывающего компонента на поверхность клетки: это свойство наибольшим образом выражено для L.fermentum штамм 90 TS-4 (производственный) и L.fructosum штамм 20349. Агглютинация конА лактобациллами обоих штаммов при 8-ом порядке разведения составляет не менее 3,5·10^-3 мг/мл. Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов существуют варианты с выраженной экспрессией таких структур и варианты их не экспрессирующие.

При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выявлено, что лектинсвязывающая субстанция диссоциирует на субединицы с молекулярной массой в пределах от 25 до 30 кДа. Известно, что за фиксацию на муцине клеток-мишеней ответственен белковый термостабильный компонент с молекулярной массой 29,0 кДа (см. упомянутый выше ближайший аналог). С помощью меченных коллоидальным золотом антител к этому компоненту удалось показать, что последний на поверхности лактобактерии присутствует в виде микрокапсулы, интегрирует в цитоплазматический слой и уходит в среду культивирования [Granato D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D., Marvin L., Rouvet M. Cell Surface-associated Elongation Factor Tu Mediates the Attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (Lal) to Human Intestinal Cells and Mucins. // J. Infec. and Immun. - 2004 - p.2160-2169].

Пример осуществления. После рассева штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) (штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7573) проводился отбор колоний по признаку агглютинации с конА на стекле в концентрации не ниже 1,75·10^-3 мг/мл.

Получение лектинсвязывающей субстанции от данного продуцента осуществлялось в следующем процессе.

1. Отобранный вариант штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) культивировали на жидкой среде МРС-1 в объеме 1000 мл в CO₂-условиях, в течение 15-17 часов при температуре 37(±0,05)°С и постоянном перемешивании.

2. Через 15-17 часов культуру клеток с помощью центрифугирования (14-16 мин, 3000 об/мин (g=9859,6 м/сек²)) отделяли от культуральной жидкости.

3.Супернатант культуральной жидкости переносили на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) и освобождали от низкомолекулярных компонентов и остаточного количества бактериальных клеток с помощью стерилизующих мембран марки «Милипор» с диаметром пор 0,02 мкм.

4. Очищенную культуральную жидкость концентрировали на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) с использованием мембран «Диафло» марки UM-20 до объема 100 мл. Одновременно супернатант культуральной жидкости трехкратно отмывали дистиллированной водой от молочной кислоты, доводя рН до значения 6,0±0,05.

5. Полученный концентрат культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) инкубировали 24 часа при комнатной температуре с конА-сефарозой. По истечении суток надосадок удаляли, а конА-сефарозу трехкратно отмывали фосфатным буфером (рН=8,2). Далее добавляли физиологический раствор (рН=3,0) и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Собирали надосадок и доводили его до рН=7,2 с помощью 0,1М NaOH. Наличие лектинсвязывающей субстанции контролировали с помощью 0,1% раствора конА в реакции кольцепреципитации.

Целевой продукт - антиадгезивный компонент на основе лектинсвязывающих структур штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) более технологичен, чем полученный из штамма L.fermentum RC-14 в упомянутой работе Henriksson А. и Szewzyk R., и имеет следующие характеристики:

компонент, содержащий 150,0 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях рН выше 6,0;

молекулярная масса, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, составляет от 25 до 30 кДа;

свойства лектинсвязывающей субстанции стабильны и не меняются при хранении и в процессе лиофилизации.

При изучении динамики накопления показано, что максимальная концентрация лектинсвязывающей субстанции в культуральной жидкости определяется на 15-17 час культивировании, в СО₂-условиях и постоянном перемешивании, что является более выгодными условиями, чем при выращивании культуры в течение 24-48 часов, как это описано в патенте RU 2133272.

Фореграмма очищенной лектинсвязывающей субстанции, выделенной из культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 представлена на фигуре.

Лектинсвязывающая субстанция оказывает модулирующее действие на адгезивную активность тест-культур дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида Е.соli к эпителиоцитам влагалища клинически здоровых женщин. Данное утверждение иллюстрируют следующие результаты.

Модулирующее свойство фракции, лишенной способности реагировать с конА и фракции, способной реагировать с конА концентрата культуральной жидкости (КЖ) L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) в тесте торможения адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища дало результаты (см. Таблицу), которые свидетельствуют о том что хроматографически очищенная фракция лектинсвязывающей субстанции активно ингибирует адгезию вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703 Б на эпителиоцитах влагалища и в меньшей степени влияет на адгезию орального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans. На адгезию E.coli штамм К 12 фракция не оказывает никакого эффекта, но значительно блокирует адгезию E.coli штамм 89-1449 на эпителиоцитах влагалища. В тоже время при удалении лектинсвязывающего компонента из КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) усиливается адгезивная активность части тест-культур E.coli к эпителиоцитам влагалища. Адгезия вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703, в этой модельной системе достоверно уменьшается.

ТАБЛИЦА
Модулирующее действие фракций концентрата культуральной жидкости (КЖ) штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) на тест-культуры при адгезии на эпителиоцитах влагалища Вид и штамм микроорганизмов Концентрат (UM-20) КЖ L.fermentum 90-TS-4 (21) (С_белка=150 мкг/мл) Фракция, способная реагировать с конА Фракция, лишенная способности реагировать с конА М±m M±m контроль опыт контроль опыт C.albicans 04-703 Б (вагинальный изолят) 4,33±0,4 1,20±0,2^*) 1,26±0,2 0,64±0,12^*) C.albicans (оральный изолят) 13,04±1,8 8,62±1,12^*) 2,74±0,5 4,76±1,02 Е.соli К-12 12,35±0,84 12,12±1,34 12,35±0,84 20,94±1,51 Е.соli 89-1449 (кишечный изолят) 33,92±2,2 19,92±1,42^*) 13,76±1,6 23,64±2,9 *) - достоверное снижение адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища

Культивируют колонии штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573), отобранные по признаку агглютинации с 0,1%-ным раствором конканавалина А в концентрации не ниже 1,75·10^-3 на жидкой среде МРС-1. Отделяют клетки центрифугированием и полученный супернатант культуральной жидкости концентрируют над мембраной UM-20 «Диафло». Полученный надосадок удаляют и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конканавалин А-сефарозе. Это обеспечивает получение субстанции с выраженной модулирующей активностью в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида Candida albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида Escherichia coli. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, предусматривающий культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1%-ного раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10^-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре (37±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об./мин в течение 14-16 мин при температуре (20±0,05)°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре (20±0,05)°С в течение 24-48 ч.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0±0,05 в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре (20±0,05)°С.